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纯化重组蛋白时，AKTA系统过NI柱纯化后，目标蛋白不纯，下一步不知道选择哪个继续透析？请各位老师帮忙分析一下原因？
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qierui edited on
是不是我表达的太不清楚了？
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纯度可以了，上样量小一点，杂带就没有了。镍柱纯化有时候纯度是不高的。
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可以过一个分子筛，或者先过个分子筛再过个离子柱。
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可以考虑过个离子柱。离子柱分离效果比较好。分子筛一般蛋白大小差大于10kD才能分开。
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这个纯度应该是差不多了，如果绝不纯度不够首先可以从结合缓冲液咪唑浓度或者填料上偶联的金属离子种类去优化，也可以在后面添加一步离子交换或者凝胶过滤进一步纯化。
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目的条带附近有一条相隔非常近的杂带，如果上面那条是您的目的蛋白，那是否考虑下面那条带是您的目的蛋白的降解带的可能性. 2.如果在亲和这一步无法达到您的纯度要求，可以考虑在加一步纯化，凝胶过滤原则上说要目标蛋白和杂蛋白分子量相差一倍以上会有比较好的分离效果，但可以尝试下。如果凝胶过滤分不开，可以尝试离子交换层析技术
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不知哪一条是目的条带，如果大的是，要考虑小的是否为部分降解蛋白，我为此摸索了很长时间。如果不是考虑离子交换.分子筛没戏。
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离子交换啊！
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关于丁香园& 【求助】NI柱子纯化后的蛋白保存方法
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【求助】NI柱子纯化后的蛋白保存方法
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【求助】NI柱子纯化后的蛋白保存方法
我用的是novagen公司的 NI柱子，最后洗脱用的是高浓度的咪唑（1M）进行的，我打算用这些纯化的蛋白免疫小鼠作单抗，能行不?要先透析去咪唑再免小鼠吗？由于纯化的量较小，透析肯定有损失。不透析怎么保存，都说蛋白反复冻融会降解，这些蛋白还要用于ELISA筛选的抗原，大家快帮忙，谢谢！
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先不要急于放在低温，4度放置应该不会很快降解，（当然时间不能太长）咪唑对小鼠有没有影响不太清楚，至少脱盐可以排除一个因素对动物实验的干扰，建议脱盐。小批量的蛋白可以使用milippore的超滤管浓缩和脱盐（脱盐应该多稀释几次，
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milippore的超滤管浓缩是怎么回事？我没用过，我想用Tris.HCl缓冲液透析，因为最后的洗脱液中含有Tris.HCl缓冲液（PH=7.9），Tris.HCl应该不会影响蛋白的特性和干扰免疫小鼠吧！
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蛋白如果是自己表达的话，你最好还是多表达纯化一些，毕竟你还要免疫小鼠（一般要6只以上，因为有些小鼠在免疫过程中，有多种原因可以导致其死亡），还要用你的抗原去筛选单抗（这也需要很多抗原）。然后用透析，或者凝胶柱去脱盐。透析，并不会象你说的会使蛋白量损失很大，有那种径较小的透析袋。由于你的咪唑浓度很高，你可以先用蒸馏水透析（2小时左右），在用PBS透析。
另外提醒你一下，你完全不必用这么高的咪唑浓度去洗脱，一般的蛋白200-300　mM的咪唑就可以达到完全洗脱了，你可用梯度（连续梯度或者阶段梯度法）去摸索一下洗脱条件。
二楼所说用milippore，只能达到浓缩效果，却不会降低盐浓度。
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还想问一下，我透析完了，怎么知道咪唑已经透析出去了，或者没有咪唑了昵？
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透析，并不会象你说的会使蛋白量损失很大，有那种径较小的透析袋。由于你的咪唑浓度很高，你可以先用蒸馏水透析（2小时左右），在用PBS透析。
用蒸馏水透析，那我最后得到的蛋白岂不是很稀，我是用Tris HCl透析的，最后还需要用PBS透析吗？
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二楼所说用milippore，只能达到浓缩效果，却不会降低盐浓度。
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超滤进行diafiltration，可以有效降低盐浓度。
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买个柱子把,用sephdex系列来脱盐换液是比较不错的选择,你可以买来自己装,液可以买很小的柱子,就像NI柱大小的,你可以去AMERSHAMR公司目录查查,
浓度也控制的不错,呵呵,这个公司的(GEL FILTRATION)上看来的,我也要买柱子,所以不对请大家指正.谢谢!!!
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关于蛋白的保存,我建议你看看蛋白质纯化和鉴定指南这本书以及这里的(从纯化到星辰),很好的两个指南,呵呵!!!
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透析过程中出现沉淀，很有可能是你纯化的蛋白的等电点与PBS相近，你可以试试用vectorNTI或其它软件测一下蛋白的等电点，然后调整一下PBS的pH值，或许会有帮助生物在线声明：以上所展示的信息由企业自行提供，内容的真实性、准确性和合法性由发布企业负责。生物在线对此不承担任何保证责任。
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上海悦克生物科技有限公司
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产品详细描述
His-Binding-resin 使用说明书
一、简介：
His-Binding-resin 纯化柱系采用进口填料分装而成，性质稳定、重复性好、使用简单、方便。胶粒平均直径100微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组His-tag融合蛋白的能力大于20 mg/ml（30 kDa）。可以满足大多数实验室级别小量纯化His-tag融合蛋白的需求。
二、使用方法：
1.&&&&&&&&& 离心收集500 ml表达目标蛋白的大肠杆菌，冻融或超声破菌于20 ml破菌缓冲液。破菌缓冲液: 20-50 mM Tris-HCl，pH 7.3-8.3，含0.25 M-0.5M NaCl，其它常用缓冲液为PBS。这一步可以适当加入PMSF作为蛋白酶抑制剂，但是不能使用EDTA。还原剂使用2 mM 2-ME，避免使用DTT，因为DTT会造成Ni/Co离子还原。
2.&&&&&&&&& 离心取上清，上样于预先平衡好的纯化柱（10倍柱体积上样缓冲液平衡），通常自然流速可以很好结合。少数情况下，流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度。
3.&&&&&&&&& 样品上完以后，使用破菌缓冲液洗柱10个柱体积，注意将纯化柱侧壁上的残留样品洗干净。
4.&&&&&&&&& 使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，如果杂蛋白太多可以加大洗杂体积。洗杂缓冲液：破菌缓冲液中补加咪唑到终浓度20 mM。咪唑可以使用上样缓冲液配制成500 mM母液，用前加入。
5.&&&&&&&&& 洗杂结束以后，使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。洗脱缓冲液：上样缓冲液中补加咪唑到终浓度200 mM。
6.&&&&&&&&& 收集完成以后，使用10倍柱体积1 醋酸冲洗纯化柱，再使用PBS/TBS平衡pH，大量蒸馏水水洗柱，最后加入5 ml 20乙醇，保存在4 ℃，不要在-20 ℃冻结。
三、处理与再生：
His-Binding-resin可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子纯化不同目标蛋白，或者长时间使用造成金属离子脱落，柱子堵塞、流速慢，可以按照下述方法进行再生。
1.&&&&&&&&& 用0.1 M EDTA洗柱4倍柱体积，将金属离子洗脱下来，再用蒸馏水洗柱10倍柱体积除去EDTA残留。如果柱子堵塞严重，使用1 Triton X-100/PBS浸泡过夜。
2.&&&&&&&&& 使用0.1 M盐酸洗柱4倍柱体积，10倍柱体积蒸馏水冲洗，再用0.1M 氢氧化钠洗柱4倍柱体积， PBS/TBS平衡pH，大量蒸馏水洗柱。这一步需要避免强酸、强碱洗柱时间过长。
3.&&&&&&&&& 用4氯化镍或者硫酸镍3倍柱体积重新螯合10分钟，也可以使用4氯化钴或者硫酸钴螯合柱子，颜色不同，但是在使用效果上基本没有区别。
4.&&&&&&&&& 柱子长时间不用，加入20 乙醇，封口后于4摄氏度保存，避免干裂或者冻结。
四、补充说明：
1.&&&&&&&&& 在未知His-tag融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程最好在4℃完成，可以使用蛋白酶抑制剂防止降解，但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。此外，可以使用非离子去垢剂改善结合，具体使用浓度参考以下：1 Triton X-100，1 Tween-20，0.03 SDS，0.1 NP-40。
2.&&&&&&&&& 最好不同的融合蛋白使用不同的柱子，每根1 ml的His-Binding-resin亲和柱一次可以结合大约20 mg His-tag融合蛋白，样品较多，可以使用多根柱子。
3.&&&&&&&&& 上样缓冲液中可以含有1 mM咪唑减少杂蛋白的结合，部分目标蛋白会在20 mM咪唑洗杂缓冲液中流出，所以对于新样品，每一步都要留样电泳，摸索纯化条件。
4.&&&&&&&&& 如果融合蛋白是包涵体形式，那么可以选择变性纯化方法，通常是在缓冲液中加入8M 尿素以及去垢剂。变性纯化时一定要做好样品处理，不然容易造成柱子堵塞。变性方法得到的蛋白一般没有活力，可以用来制备抗体，但如想测定活力，就需要做复性。
5.&&&&&&&&& 除了常规的咪唑洗脱方法以外，还有EDTA洗脱和pH梯度洗脱。后两种方法缺点明显，只在特殊情况下使用。
6.&&&&&&&&& 可以使用在柱酶切的方法得到去除His-tag的目标蛋白。经常使用的酶包括：Thrombin；Enterokinase；TEV protease等。我们推荐TEV protease，因为这种酶的特异性较好，是带有His-Tag的重组酶，方便除去。在柱酶切可以提高产物纯度，但是空间位阻可能造成酶切效果不好，按照惯例，多数实验不用切除His-tag。
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