小木虫 --- 600万学术达人喜爱的学术科研平台
热门搜索：
&&查看话题
DNA测序过程可能遇到的问题及分析(欢迎讨论)
DNA测序过程可能遇到的问题及分析& &&&
& &&&对于一些生物测序公司（ 如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？
& &&&PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸 ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
& && &N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。在序列的3’端易产生N值。一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
& &&&测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。有两种方法可以得到引物序列。1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。由于在测序的起始端总有一些碱基无法准确读出，因此，如果想得到PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。 PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当在一条链上找不到引物序列时，可以在互补链上寻找引物序列。当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。 对测序引物的一般要求：1).特异性与测序模板结合，不能有多于4个碱基以上的错配现象；2).不能含有混合碱基；3).长度17-25碱基；4).纯度高，最好PAGE纯化；5).用ddH2O溶解，不要用TE/RTE溶解。
质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时也找不到引物序列。过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于200bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此用于测序的PCR产物一般不低于200bp长度。其次，由于测序本身的限制，以一个100bp的PCR产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约40到50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过30～40碱基，这是在最理想的条件下的假设，稍不顺利，测序就失败。因此，过短的PCR产物，只能克隆后进行测序。
& && &此外，ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
& && &测序自身再就是不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。 大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致凌乱峰。自己在割胶回收是要注意空离心要充分，不要带入酒精，这样防止造成酒精峰。仪器不要有灰尘，否则会出现钉子峰。还有测序模板要纯，对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等，否则将有干扰峰；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行，甚至无信号。鉴定时用1.2%琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入0.5ug/ml的EB(电泳缓冲液中不必加EB)，加一个已知浓度的标准样品。电泳结束以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品中是否含有染色体DNA、RNA等。也可以抽提的质粒DNA的不同构型，质粒DNA的3种构型是在抽提质粒DNA过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结构的质粒(SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状(L)分子。这3种分子有不同的迁移率，通常，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢为开环状(OC)分子。质粒大小可以用商品质粒Marker做标准，或自己的已知质粒做标准。提取质粒的试剂盒或割胶回收试剂盒会提供一个Elution Buffer给用户洗脱DNA，建议用户不要使用，因为其中含有的如EDTA等组分会对测序反应产生干扰，甚至导致测序反应失败，就用ddH2O是最好的。
DNA测序过程可能遇到的问题及分析/结束
各位有相关经验的，包括从分子克隆到测序全过程经验的还望支持指点！
学术必备与600万学术达人在线互动！
扫描下载送金币查看: 314909|回复: 30
分享下亲身经历的无创DNA检测全过程
注册时间11-10-25
在线时间1 小时
最后登录16-6-23
主题帖子八通币
小学生, 积分 63, 距离下一级还需 137 积分
小学生, 积分 63, 距离下一级还需 137 积分
注册时间11-10-25
发表于 11-11-3 13:04:32
& && &当拿到那张阳性的尿检单后，到医院进行各项检查就成了家常便饭，B超、验血、验......尽管医生所说的每项检查都一个不拉的做了，但心里多少还有些不安，是男孩还是女孩啊，有没有什么问题啊？尤其是有时候看到一些介绍畸形儿童的书籍之后，也会担心自己的宝宝有没有事情，毕竟每对夫妻都有生育染色体疾病患儿的潜在风险，而且发病率随孕妇年龄的增高而升高的。每次检查完之后，我都要详细的咨询医生胎儿的发育情况，有没有什么异样，搞得整个围产保健室的医生和护士都有些不耐烦了。
& && &&&大约12周的时候，妇产科的主治医生都跟我处的比较熟了。一位姓于的大夫实在受不了我的神经质，就建议我去做个无创DNA产前诊断。以前只听说过唐氏筛查比较准确，我很怀疑这家伙是不是忽悠我去当新技术的试验“小白鼠”。刚好，身边的一个快要生产的孕妇已经做过无创DNA检测了，我就趁着她在等尿检结果时，顺便探了下她的口风。原来，这是种比较新的诊断技术，一些大医院已经开始使用了，通过超灵敏的测序技术对孕妇血液中的胎儿游离DN**段进行序列测定，然后利用专门生物信息软件进行测序分析，去判断胎儿的遗传状态,可以准确检测患染色体疾病的胎儿。跟羊水穿刺检查等需要在**内取样的方式不一样，这个方法不用再在孕妇身上开创口，也不用将针头等接近胎儿，不存感染或流产的风险，DNA水平检测的准确率达99%以上，比唐氏筛查的准确率更高，据说目前只有贝瑞和康等少数几家公司能做这种检测。
& && &&&与其早晚提心吊胆的想象，不如先行检查一下，真的有什么问题也能一颗红心两手准备，谁让咱是高龄产妇呢？老公对我“林妹妹”似的唠叨估计也是忍耐已久，得知只需到他们合作的医院抽血就能检查，虽然价格有点小贵，但是却能检查三种染色体疾病，从长期来看，还是比较划算的，再说，传统的唐氏筛查、羊水穿刺什么的也不便宜，而且也有一定的漏诊率，也就是说，存在查不出来的可能性。做一个DNA诊断顶过去几个检查项目，抽血少了，风险低了，不费劲，还能提前知道结果。
& && &&&按照约定的时间来到医院，医生早就准备好了协议，老公一脸严肃的签好，跑去交了费用，一位护士就领着我们去取样了。本来想着是提取DNA肯定要很复杂，心里还有些忐忑，没想到就是抽了一些血，然后就是回家等消息了。在这个特殊阶段，等待就是煎熬啊，结果当然是越快越好。
& && &&&幸运的是，我们拿到的检查结果显示三种染色体都一切正常，小家伙真是争气，没辜负他老爹老妈的一番努力啊。再过几个月，就能来给大家晒照片喽！
注册时间07-1-22
在线时间362 小时
最后登录15-4-9
主题帖子八通币
大学生, 积分 2830, 距离下一级还需 170 积分
大学生, 积分 2830, 距离下一级还需 170 积分
注册时间07-1-22
发表于 11-11-3 16:16:44
目前，DNA检测确实尚处于试验阶段，这是妇幼的山丹亲口承认的。且，其99%的检出率与羊水穿刺的99%并不是一个意思。目前，DNA检测只能以DNA链上的几个碱基对靶体（姑且这样说吧，专业名词我忘了），所以，其只能对包括唐氏综合症的几类遗传疾病有筛查功能。而羊水穿刺在筛查遗传疾病的范围上要远远广泛于该种检测。以上这些观点我是咨询过包括王山米在内的很多妇科专家得到的答复。
当然了，我说这些并不是想吓唬您啊，只是想告诉您，说到底还是受试者，并且是自行支付费用的受试者。其实，很多孕妈妈尽管首次筛查没有过，但羊水穿刺的结果都是正常的，所以，您也不必负担太重。
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:07
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:07
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:06
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:06
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:03
注册时间09-5-29
在线时间46 小时
最后登录16-1-4
主题帖子八通币
注册时间09-5-29
发表于 11-12-4 07:54:29
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽
注册时间07-5-24
在线时间57 小时
最后登录13-11-22
主题帖子八通币
高中生, 积分 563, 距离下一级还需 437 积分
高中生, 积分 563, 距离下一级还需 437 积分
注册时间07-5-24
发表于 11-12-30 08:32:29
亲,你等了多长时间拿的结果?
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:10
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:09
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:09
东骏国际辅助生殖技术中心、提供代yun妈妈、提供捐精捐卵、选男女包成功包出生：微信/电话： &
发表于 17-6-1 06:08
注册时间09-8-14
在线时间790 小时
最后登录17-5-16
主题帖子八通币
博士生, 积分 7025, 距离下一级还需 2975 积分
博士生, 积分 7025, 距离下一级还需 2975 积分
注册时间09-8-14
发表于 11-12-30 10:22:41
我也做了这个了，这个没有穿刺准确率高，但是也能说明问题了
注册时间10-11-27
在线时间847 小时
最后登录17-7-5
主题帖子八通币
博士后, 积分 13767, 距离下一级还需 11233 积分
博士后, 积分 13767, 距离下一级还需 11233 积分
注册时间10-11-27
发表于 11-12-31 12:11:19
我前几天也刚坐做的这个
注册时间10-8-31
在线时间198 小时
最后登录14-9-25
主题帖子八通币
大学生, 积分 1527, 距离下一级还需 1473 积分
大学生, 积分 1527, 距离下一级还需 1473 积分
注册时间10-8-31
发表于 12-5-9 09:38:46
我没做唐筛 和穿刺 想直接做无创DAN&&今天的唐筛人太多&&看很多人说穿刺又有风险 查了一下还是直接做无创吧 后天打算去301做&&
注册时间10-10-29
在线时间24 小时
最后登录12-9-3
主题帖子八通币
初中生, 积分 265, 距离下一级还需 235 积分
初中生, 积分 265, 距离下一级还需 235 积分
注册时间10-10-29
发表于 12-5-11 09:31:08
注册时间14-4-1
在线时间3 小时
最后登录14-5-1
主题帖子八通币
学前班, 积分 32, 距离下一级还需 18 积分
学前班, 积分 32, 距离下一级还需 18 积分
注册时间14-4-1
发表于 14-4-1 11:15:14
目前国内不能做无创dna检测了，华大基因叫停，只能去香港做，但是香港检测需要提前预约的，孕9周以上就可以做这个检测了，抽取静脉血20MM就可以检测了。相比之下去香港做无创基因的优势还是很大的：
香港无创产前检测和国内无创产前检测的区别
一：无创性
香港：是无创的，除母亲血液样本外，最好提供父亲口腔细胞样本。
国内：是无创的，仅提供母亲血液样本。
二：早期性
香港：孕期9周或者9周以上就可以，而国内需要12-24周才能做。鉴定最快出结果的话，香港孕期12周就可以，而国内则需要孕期14周，相比来说，香港做无创产前检测更占优势。
三：全面性
香港做无创产前检测的话，还包括了唐氏综合征筛查在内的数组疾病检测等等，而国内的一般指用于唐氏综合征筛查。两者的准确率都能达到99%以上，安全系数都蛮高。
因此，选择香港无创DNA产前检测的话，会更好！
67dd74e0tw1eba2t6tb9pj20c8081q3i_副本.jpg (49.98 KB, 下载次数: 729)
14-4-1 11:16 上传
注册时间06-12-7
在线时间1884 小时
最后登录17-7-4
主题帖子八通币
博士后, 积分 13551, 距离下一级还需 11449 积分
博士后, 积分 13551, 距离下一级还需 11449 积分
注册时间06-12-7
发表于 14-6-5 09:35:12
现在北京的医院都不做这个了，实在不行只能做羊水穿刺了，哎
注册时间16-1-11
在线时间0 小时
最后登录16-1-11
主题帖子八通币
学前班, 积分 2, 距离下一级还需 48 积分
学前班, 积分 2, 距离下一级还需 48 积分
注册时间16-1-11
发表于 16-1-11 14:27:07
国家已在试点，不光是北京，卫计委在全国范围内都有试点医院，我给大家提一下无创DNA检测注意事项（1）染色体异常胎儿分娩史，夫妇一方有明确染色体异常的孕妇。（2）孕妇【1年内】接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗等无创DNA检查结果将造成干扰的。（3）试管婴儿双胎（第8周首次B超有2胎存活即视为双胎）及多胎孕妇（4）大于27周的孕妇（5）各种基因病的高风险人群。（6）采取6-10ml外周静脉血。健禾基因整理提供
注册时间16-2-23
在线时间1 小时
最后登录16-12-8
主题帖子八通币
学前班, 积分 11, 距离下一级还需 39 积分
学前班, 积分 11, 距离下一级还需 39 积分
注册时间16-2-23
发表于 16-2-26 09:20:46
香港.jpg (20.68 KB, 下载次数: 310)
16-2-26 09:20 上传
GMT+8, 17-7-6 05:42
Powered by百度拇指医生
&&&普通咨询
您的网络环境存在异常，
请输入验证码
验证码输入错误，请重新输入请问基因检测是检测什么多长时间能出结果大概多少钱?
请问基因检测是检测什么多长时间能出结果大...
请问基因检测是检测什么多长时间能出结果大概多少钱?
医院出诊医生
擅长：妇科炎症
擅长：无痛人流
共2条医生回复
因不能面诊，医生的建议仅供参考
职称：医生会员
专长：蜂窝组织炎,消化道出血,胃十二指肠溃疡瘢痕性幽门梗...
&&已帮助用户：209911
指导意见：你好，可能是看症状基因是DNA分子上的一个功能片断，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子；基因决定人的生老病死，是健康、靓丽、长寿之因，是生命的操纵者
15天，3000元左右
问请问做DNA检测需要多长时间出结果
职称：医生会员
专长：眼科、高血压、耳鼻喉、心血管疾病
&&已帮助用户：23672
意见建议：半个月左右，一般都是有针对性的。比如疾病易感、儿童天赋、药物敏感性等。疾病易感基因检测可以检测出大部分常见疾病的患病风险，从各方面给检测者提供个性化的生活方式建议，避免或延缓疾病发生，想了解更多可HI我
问请问遗传基因检测要检测哪些项目。检测要多长时间才能知道结果。
职称：医师
专长：妇产科
&&已帮助用户：280553
病情分析：您描述的耳朵的问题，如果只是外耳廓的异常，由于对生命和生存质量本身没有影响，多无需担心。对于夫妻间是否有亲缘关系，应该只能做亲子鉴定之类的检查，可以查询问一下当地能检查的机构。
意见建议：
问基因检测需要多少费用？
职称：医生会员
专长：子宫肌瘤、宫颈糜烂
&&已帮助用户：96763
病情分析： 朋友您好，建议就近到三甲医院进行检查，这项检查的费用大概元。
问要做肺腺癌基因检测需要住院吗，需要多长时间，听说检...
职称：医生会员
专长：肿瘤科、内科
&&已帮助用户：3776
问题分析：您好，左肺癌，胸腔积液，胸膜转移，高血压，心衰，建议住院检查。选择保守疗法，减轻痛苦，提高生存质量。意见建议：建议，中西医结合治疗，忌食生冷辛辣刺激食物，清淡，低盐低脂饮食为主。
问那里可以做基因检测，费用是多少？
职称：医生会员
专长：各种眼科疾病
&&已帮助用户：200
病情分析： 基因检测属于比较高端的体检范畴，通过基因检测能早期预测出某些疾病的患病风险，并指导养生保健，促进优生优育等，使受检者受益终生意见建议：可以在长春市吉大一附院可以做初步的基因诊断
问请问做DNA检查需要多长时间能拿到结果
职称：医师
专长：艾滋病、传染性肝炎、脂肪肝、狂犬病、脱发、过敏性皮肤病、高血压等
&&已帮助用户：55038
病情分析： 你好，你说的是肝炎的病毒复制量检测结果吧，那这个检测时间一般是当天可以出具结果的，具体看这个检测医院的检测效率了，这个可以采血的时候询问一些取结果的时间，有的也可以通过电话获知的。
关注此问题的人还看了
大家都在搜：
腹泻相关标签
免费向百万名医生提问
填写症状 描述信息，如：小孩头不发烧，手脚冰凉，是怎么回事？
无需注册，10分钟内回答
百度联盟推广
百度联盟推广
搜狗联盟推广
同类科室问答排行ｘ
日累计回答人
日累计回答人
评价成功！上客户端，随时随地问医生