)南方医科大学学报(JSouthMedUniv)
实时荧光定量RT-PCR检测肝癌组织中miR-122a及miR-224的表达
刘卓然1，陈小卫2，乔新惠2，王蓉3，向征4(南华大学1附属第二医院检验科，2生命科学与技术学院生物技术系，3附属第一医院血液科，湖南衡阳暨南大学分子免疫学和抗体工程研究中心，广东广州
摘要：目的
运用实时荧光定量RT-PCR方法分析miR-122与miR-224两种miRNAs在原发性肝细胞癌（HCC）中的
采用基于2（-△△CT）的实时荧光定量RT-PCR法
表达，探讨以miRNAs为靶点在早期肝癌中的临床诊断意义。方法
对35例肝癌组织及癌旁组织的miR-122a及miR-224进行了定量分析，结果经由Northernblot验证。结果与正常组织相比，在所有的被检肝癌组织中，均发现了miR-122a有不同程度的表达下调(P&0.01)，而上述肝癌组织中的miR-224的定量结果显示该miRNA表达显著增加(P&0.001)。结论HCC组织中存在上述两种miRNAs表达水平的改变，实时荧光定量RT-PCR法为早期、准确的在临床上检测肝组织癌变提供了新的思路。关键词：miR-122；miR-224；实时荧光定量RT-PCR；肝癌中图分类号：R730.43
文献标识码：A
文章编号：09)04-0751-03
DetectionofmiR-122aandmiR-224expressioninhepatocellularcarcinomabyreal-timefluorescencequantitiveRT-PCR
LIUZhuo-ran1,CHENXiao-wei2,QIAOXin-hui2,WANGRong3,XIANGZheng4
DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,2DepartmentofBiotechnology,SchoolofLifeScienceandTechnology,DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,HengyangMolecularImmunologyand
AntibodyEngineeringCenter,JinanUniversity,Guangzhou510632,China
Abstract:ObjectiveTodetecttheexpressionsofmiR-122andmiR-224inhepatocellularcarcinoma(HCC)byreal-timefluorescencequantitativeRT-PCRandinvestigatethesignificanceofmiRNAsinearlydiagnosisofHCC.Methods2-△△CTmethodwasusedforquantitativeanalysisoftheexpressionpatternofmiR-122andmiR-224in35HCCandadjacentnormaltissues.AllthequantitativeresultswereconfirmedbyNorthernblotting.ResultsComparedwithadjacentnormaltissues,theHCCtissuesshowedsignificantmiR-122down-regulation(P&0.01)andmiR-224over-expression(P&0.001).ConclusionHCChasobviousalterationintheexpressionpatternsofmiR-122andmiR-224,andreal-timefluorescencequantitativeRT-PCRprovideanewmeansforearly,efficient,andaccuratediagnosisofHCC.
Keywords:miR-122;miR-224;real-timefluorescencequantitativeRT-PCR;hepatocellularcarcinoma
肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是目前临床上位列第三的恶性肿瘤。我国是肝癌高发区之一。肝癌最主要的病因有病毒感染所致（HBV和HCV）、非病毒因素（酒精及食物中黄曲霉毒素B1摄入）以及遗传性肝病肝硬化等［1］。目前，肝癌的发病机制还不是十分清楚。基于人们普遍认为抑癌基因的异常失活或癌基因的激活是导致肝癌发生的主要原因，近年来，研究发现micoRNAs(miRNAs)在肿瘤的发生、发展过程中也起到非常重要的作用［2］。
大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后而生成。生物体内的miRNA对其靶基因的转录后表达调节起到非常重要的作用，它们能通过与靶mRNA3端非编码区序列的特异性结合从而启动mRNA的降解同时抑制mRNA翻译的进行［2］。miRNA现已被证实在不同的生理过程，诸如发育、分化、增值、凋亡及病毒感染中发挥着重要的作用［3-4］。最新的研究表明，有部分miRNA与肿瘤的关系密切。有些肿瘤组织特异性的miRNA亦被证实在肿瘤的发生过程中起到了非常重要的调节作用［5-7］。同时，通过对不同类型肝癌组织的miRNA表达的分析，Zucman-Rossi等［8］得到了与肝癌发生发展相关的miRNA的表达谱。本实验结合相关文献所报道的肝癌组织miRNA表达数据，结合基于Delta-deltaCT的实时荧光定量PCR法对
miRNA是一组小的内源性非编码单链小分子RNAs(~22nt)，是由具有发夹结构的约70~90个碱基
收稿日期：
基金项目：湖南省科技计划项目()；湖南省教育厅科学基金(08C732)
作者简介：刘卓然(1964-)，男，副主任技师，电话：，
35例肝癌组织的miR-122a及miR-224进行了定量
分析，以期建立一种临床上可行的快速，准确的早期
南方医科大学学报(JSouthMedUniv)第29卷
肝癌诊断方法。
cDNA的合成采用miScriptReverseTranscriptionKit(QiagenGmbH,Hilden,Germany)依
据操作说明进行，每一合成反应体系中包含约1μg的总RNA，1μlmiScriptReverseTranscriptase混合物，以及4μlmiScriptRT反应缓冲液，37℃水浴1h反应完全。实时荧光定量PCR反应选用Qiagen公司的miScriptSYBRGreenPCRKitmiRNA定量扩增反应体系，反应总体积为25μl，其中含有12.5μl2×
1材料和方法1.1标本来源
南华大学附属第二医院肝胆肠外科2007年3月
~2008年3月间外科手术切除的原发性肝癌组织标
本35例。其中男16例、女19例。年龄（50.5±8.30）（31~65）岁，诊断依据肝穿刺活体组织检查、CT、MRI及AFP等确诊。所有标本均经过病理学证实。患者术中、术前均未经放、化疗及免疫治疗。另取上述HCC患者的癌旁肝组织作为对照。手术切除的新鲜标本立即放入液氮中冻存并于-80℃冰箱保存。
QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix，2μl反转录反应产物，2.5μl10×misScriptUniversalPrimer，2.5μl检测特异miRNA引物，引物序列参考文献［9］引物序列见表1。最后用ddH2O补足体系至25μl。实时PCR反应条件：95℃预变性8min；然后以93℃15s、55℃30s和72℃30s进行40个循环。扩增反应
在实时荧光定量PCR仪Rotor-Gene3000仪上进行。在扩增待测miRNAs的同时，
我们还扩增了U6
1.2RNA提取
采用Trizol法提取组织总RNA，将约2mm3冷冻肝脏组织在液氮中研磨，将组织悬液按照
RecoverAllTMTotalNucleicAcidIsolationKit
(Ambion,Austin,TX)的操作说明提取总RNA。紫外分光光度计NanoDropND-1000(NanoDrop,Wilmington,DE)用于评估RNA的浓度和纯度。所有RNA样品置-80℃保存备用。
1.3miRNAs反转录和实时荧光定量RT-PCR
RNA作为内对照，待测miRNAs的量通过2（-△△CT）法确定，△△CT=(CTmiRNA-CTU6RNA)待测样品-(CTmiRNA-CTU6RNA)对照组。对照组样品取自每位患者正常的癌旁组织，经病理学证实，实时PCR反应结果为3
次独立实验的校正结果。
表1miR-122miR-224的成熟miRNA序列及引物序列
Tab.1MaturemiRNAsequencesandreal-timePCRprimersformiR-122andmiR-224
miRNAmiR-122amiR-224U6RNA
MirBase#MIMAT0000421MIMAT0000281NCBI:X07425.1
miRNAsequence(s)
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGUCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUACACCACGUUUAUACGCCGGUG
RT-PCRprimersequence(s)TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTACACCACGTTTATACGCCGGTG
1.4Northernblot检测miRNAs的表达
取RNA样品约15μg，15%丙烯酰胺（含7mol/L尿素）凝胶电泳分离，于半干电转仪上以100mA转移2h，转膜至HybondN+membrane(AmershamBiosciences)。紫外交联仪上用紫外线交联125mJ，最后于80℃干烤1h。37℃预杂交2h。加入5端用［γ-32P］ATP标记的探针，37℃杂交过夜，
用2×标准磷酸盐溶液（含0.18mol/LNaCl和10
我们所选择的两种肿瘤标志miRNAs在反应体系中都能有效的扩增，如图一所示，依据CT值间的比较，通过2（-△△CT）法分别计算每一被检肝癌组织样品中两种miRNAs相对正常癌旁组织的表达变化比率。对所得到的每一组织miRNA变化比率取平均值（n=35），用以评估所选miRNA在肝癌癌变过程中的变化情况。我们发现，在所有的肝癌组织中，
mmol/L磷酸盐，pH7.4)42℃洗膜两次，放射自显影。用以杂交的两条探针序列分别为：miR-122a，5-ACAAACACCATTGTCACACTCCA-3；miR-224，5-TAAACGGAACCACTAGTGACTTG-3［10］。每次检测同时杂交U6RNA作内对照，探针序列：5-GCAGGGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCG-3。2结果
2.1实时荧光定量检测miR-122a和miRNA-224在
肝癌组织中的表达
miRNA-122a都出现下调，降低比值为-2.38±0.89（P&0.01），miRNA-224的表达均有显著提高，升高比值为20.32±3.65(P&0.001)。2.2Northernblot检测结果
两种miRNAs以及种U6RNA的相对含量如图
2所示，miRNA-224在正常组织的表达量非常小，但是在肝癌组织，实验结果显示miRNA-224的表达非
常明显。反之，相对正常组织而言，肿瘤组织中
miRNA-122a的表达量显著降低。3讨论
第4期刘卓然,等.实时荧光定量RT-PCR检测肝癌组织中miR-122a及miR-224的表达
NormFluoro
0.60.40.20
0.80.60.40.20
NormFluoro
图1实时荧光定量PCR检测miRNAs的扩增曲线
Fig.1RepresentativeamplificationcurveofmiRNAsinHCCandtheadjacentnormaltissues
A:TheamplificationofU6RNAandmiR-122a.1,2:RT-PCRresultsofU6RNA;3,4:RT-PCRresultsofmiR-122a.2and4werefromthe
samepatientwithHCC,and1and3werefromthesameadjacentnormaltissue.B:TheamplificationofU6RNAandmiR-224.5,6:RT-PCRresultsofU6RNA;7,8:RT-PCRresultsofmiR-122a.5and7werefromthesamepatientwithHCC,and6and8werefromthe
sameadjacentnormaltissue.NTC:No-templatecontrol.Allamplificationswererepeatedfor3times.
织、细胞以及实验模型中miRNAs的表达谱［14-16］，多方面的研究数据表明，肝脏组织特异性的miRNAs在一些恶性肝组织或细胞中的表达量相对正常组织或细胞有非常明显的变化，诸如，miR-224、miR-21、
miR-34a、miR-221/222、miR-122a以及miR-145。肝癌
组织的miRNAs表达谱数据提示我们，在临床上对肝癌的诊断、分级，miRNA无疑是一种全新的且非常有效的标志物。尤其对于临床诊断来说，越早期的确诊意味着更有效的治疗。
目前，国内外对于miRNA用于临床肝癌诊断的报导较少，且实时荧光定量RT-PCR尚未运用于临床上对癌症组织特异性miRNA的表达进行诊断。实时荧光定量方法是一种准确的、重现性好、高效、值得信赖的科学方法，而且在miRNA的定量上有着Miro
图2miR-122a和miR-224a在肝癌组织中的表达，U6
RNA作为内参
Fig.2RepresentativeresultsofNorthernblottingofmiRNAsmiR122aandmiR-224confirmingmir-122adown-regulationandmiR-224up-regulationinHCC
usingU6RNAasthecontrol
array和Northernblotting无法比拟的优势［17］，在我们
的研究中，我们挑选了两种非常有代表性的肝脏组织特异的miRNAs，miR-122a和miR-224结合一定数量的临床肿瘤组织标本，并选用实时荧光RT-PCR作为检测手段，建立了一种可以日后在临床上运用的检测平台，相对传统的DNA水平以及mRNA水平的诊断方式而言，在时间上miRNAs能够更早期的提示癌变。同时，我们的结果亦经Northernblot验证，结果可靠。因此，我们的研究为今后在临床上展开新的更高效的肝癌诊断方法提供了一定的实验依据。参考文献：
［1］Laurent-PuigP,Zucman-RossiJ.Geneticsofhepatocellulartumors
［J］.Oncogene,):3778-86.［2］
miRNAs是一类近些年所发现的对基因表达调
控具有非常重要的调节作用的小分子RNA［11］，通常，
miRNAs基因位于基因的内含子区段，有时在一些非编码的基因的外显子以及基因间区域亦有miRNAs基因的分布。在动物细胞中，miRNA基因的转录初产物很快被一种核糖核酸酶ⅢDrosha加工成为miRNA前体(pre-miRNA)，然后由细胞核转运至细胞质中，经另一种核糖核酸酶ⅢDicer识别剪切为成熟miRNA［12］。近些年来人们对癌症以及小分子RNA进
行了广泛的研究，人们发现许多位于人类基因组的一些相对脆弱区域(fragileregions)的miRNA通过对其相应靶基因的功能调控在癌症的发生、发展中起到了非常重要的作用［13］。
近两年内，国外几个实验室先后报导了在肝癌组
BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction［J］.Cell,):281-97.
（下转756页）
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【摘要】甘蓝型油菜(Brassicanapus)作为我国最重要的油料作物之一,已成为国产食用植物油的第大来源,2009年菜籽油已占国产油料作物产油的57%以上,但国内食用植物油自给率不到40%,且南方冬闲田油菜产量和含油量较低、抗性较弱且不适宜机械化操作,而通过基因工程技术分离出具有较高应用价值的启动子来提高油菜抗性和光合效率等性状,逐步扩大和提高其种植面积与产量,为有效解决我国植物油问题具有重要意义。组织特异启动子能专门调控基因在特定的组织部位或器官中表达,不仅可以克服组成型启动子驱动外源基因的非特异持续表达所造成浪费以及特定部位表达量上的不足,还有效避免转基因作物种植中发生的基因逃逸现象,有效的解决了转基因环境安全问题。因此,从甘蓝型油菜中分离和鉴定油菜自身的组织特异性启动子,并研究其转录调控的分子机制,为油菜及其近缘物种的基因功能研究和基因工程改良奠定基础。本研究首先根据拟南芥基因芯片和白菜与甘蓝表达谱数据,筛选在根、茎、叶、花组织中特异表达候选基因,并利用实时荧光定量PCR方法对候选基因进行组织特异性检测和表达模式分析；其次,利用5’RACE技术获得其准确的转录起始位点,通过同源克隆方法获得RO-4、LE-7、FL-1、FL-4和ST-7启动子序列,并利用PlantCARE数据库对其顺式调节元件进行了预测和分析。最后,利用双酶切技术构建其相应的植物表达载体并通过农杆菌介导法遗传转化中油821下胚轴,通过转基因植株验证分析启动子表达的特异性和表达强度。同时为了进一步研究特异启动子中的核心序列位置与功能,分别设计不同长度的启动子片段,采用Gateway克隆技术构建启动子的缺失表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,验证启动子中核心序列的位置及功能。具体结论如下：1.采用生物信息学分析方法从拟南芥基因芯片及白菜与甘蓝表达谱数据中筛选鉴定出24个组织特异表达的候选基因,从24个候选基因中获得了14个组织特异表达基因,qPCR分析结果表明RO-4在根部特异表达、LE-7在叶片特异表达、ST-7在根茎角果皮中特异表达、FL-1和FL-4在花器官特异表达。通过对qPCR检测片段、5’RACE末端及基因5’末端序列测序结果分析证实扩增片段是来自qPCR检测为组织特异表达的候选基因基因,启动子的长度为bp(包含5’-UTR序列),转录起始位点分别位于翻译起始位点上游53-269bp,并包含核心启动元件TATA-box及多个增强子元件CAAT-box,另外光响应、胁迫响应和激素响应元件也广泛存在于启动子中。2.克隆获得5个组织特异启动子片段,分别是RO-4(1475bp),LE-7(1566bp)、FL-1(1372bp)、FL-4(1517bp)和ST-7(1305bp),利用BamHI和NcoI双酶切将RO-4、LE-7、FL-1和FL-4分别亚克隆到相同酶切位点的粘性末端载体骨架pCAMBIA1305.1上,最终成功构建promoter-GUS载体p13O5.1-RO-4P、p1305.1-LE-7P、p1305.1-FL-1P和p1305.1-FL-4P；同样利用SacI/NcoI双双酶切将ST-7替换pCAMBIA13O5.1上的CaMV35S启动子,构建植物表达载体p1305.1-ST-7P。然后将构建的植物表达载体成功转化到农杆菌菌株GV3101中获得工程菌株。3.将构建的植物表达载体p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P通过下胚轴浸染法遗传转化甘蓝型油菜DH系中油821,经多重PCR鉴定,成功获得p1305.1-RO-4P和p1305.1-LE-7P转基因阳性植株,GUS组织化学染色证实LE-7启动子主要在叶片中表达,在花和花蕾、根、角果皮中基本上不表达；RO-4启动子在叶片边缘表达,其他部位因生长情况还未检测。4.克隆获得6个RO-4缺失启动子,分别是R1(1301bp)、R2(1030bp)、R3(622bp)、R4(481bp)、R5(352bp)和R6(252bp)；5个LE-7P缺失启动子即L1、L2、L3、L4和L5,长度分别为925bp、755bp、526bp、350bp和231bp。分别与表达载体质粒pMDC162进行LR重组反应构建了相应片段的缺失表达载体,并成功转入农杆菌菌株GV3101,获得工程菌株。
【作者】赵雪花；
【导师】李加纳；卢坤；
【作者基本信息】西南大学，作物遗传育种，2014，硕士
【关键词】甘蓝型油菜；组织特异启动子；植物表达载体；遗传转化；GUS；
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