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北京市公安局海淀分局备案号：
京ICP证080135号初级生产力叶绿素a的测定（B)
来源/作者：中国标准物质网　　日期：
叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。1．水样的采集与保存可根据工作的需要进行分层采样或混合采样。湖泊、水库采样500m]，池塘300ml,采样量视浮游植物分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样l000mi。采样点及采样时间同“浮游植物”。水样采集后应放在荫凉处，避免日光直射。最好立即进行测定的预处理，如需经过一段时间（(4-48h)方可进行预处理，则应将水样保存在低温（(0-4℃）避光处。在每升水样中加入1％碳酸镁悬浊液lml，以防止酸化引起色素溶解。水样在冰冻情况下（-20℃ )最长可保存30d。2．仪器设备①分光光度计。②真空泵。③离心机。④乙酸纤维滤膜（孔径0.45μm)。⑤抽滤器。⑥组织研磨器或其他细胞破碎器。⑦碳酸镁粉末。⑧90％丙酮。3．试验程序①以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kPa)。水样抽完后，继续抽1 -2min，以减少滤膜上的水分。如需短期保存1-2d时，可放入普通冰箱冷冻，如需长期保存（30d)，则应放入低温冰箱（-20℃）保存。②取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6-8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2-3ml 90％丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机（(r/min）离心10min。将上清液倒入5ml或l0ml容量瓶中。③再用2-3ml的90％的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。重复1-2次，用90％的丙酮定容为5ml或l0ml，摇匀。④将上清液在分光光度计上，用lcm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90％的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。4．计算方法叶绿素a的含量按如下公式计算：叶绿素a（mg/m3)=(11.64×(D663-D750)-2.16×(D645-D750)+0.10×(D630-D750)?V1/V?δ式中：V一一水样体积（L);D一一吸光度；V1――提取液定容后的体积（ml);δ――比色皿光程（cm)。【关键词】初级生产力淡水生态常规检测中～叶绿素a的几个问题
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如题，个人体会或经验谈，欢迎拍砖！1, 叶绿素是个含糊的指标，笼统的指标，权宜的指标。我们想反应水体浮游植物的情况，又没有分类鉴定方面的人，而浮游植物又不是主要的讨论对象，叶绿素是可以用用用的。但是这个指标只反映了一个总浮游植物的部分特征，最近刘老师一个评价鲢鳙控藻的帖子里可以看出，很多人在用叶绿素这个指标来评价浮游植物的特征，这是不完整的，掩盖或混淆或忽视了浮游植物种群间的差异，仅靠它下的结论都不可靠。2,叶绿素测量误差大。这是方法的缺陷，客观存在的，至少如此。新方法用酒精抽提，酒精抽提效果差，有些明明膜上有藻的差异，但差异经常反应不出来。丙酮抽提效果好多了，因为丙酮对身体不好，所以要注意防护。膜泡到丙酮里，结果受以下因素影响，滤膜的藻面直接接触丙酮还是卷进去靠渗透接触，浸泡时间长短，浸泡液体积和高度，测量时碎渣的影响，倾倒出的是哪部分，底部偏绿。还有个就是测量人的态度，这些都影响到结果。3,叶绿素做背景指标供参考或锦上添花可以，靠它下结论就不太科学了。4,仪器测量更不靠谱，至少目前如此。ysi的叶绿素探头不好使，至少目前没有发现或听说有好使的便携仪器测它。
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1 叶绿素含量测定 80％的丙酮液的配制4L丙酮+ 1L蒸馏水。 称05g.doc 9页
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1 叶绿素含量测定 80％的丙酮液的配制4L丙酮
1L蒸馏水。 称05g
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1叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+1L蒸馏水。称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(.05Ca-114Cb)/2452抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506gNa2HPO4·12H2O+2.65285gNaH2PO4·2H2O,定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/LpH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206gNBT+0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4mlEDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。（另配）100mlPBS溶液加EDTA-Na3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。2.3过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251gNa2HPO4·12H2O+3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml30%H2O2，用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。2ml0.3%H2O2溶液+0.95ml0.2%愈创木酚溶液+1ml0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)+0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。2.4脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）00.10.20.40.60.81.0H2O（ml）1.00.90.80.60.40.20冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）3333333脯氨酸含量（μl）012468100.5ml酶液（对照用0.5ml80％乙醇代替）（做三个重复）+1ml冰乙酸+1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）牛血清白蛋白：配成100μg/ml和1000μg/ml。90％乙醇：90ml乙醇+10ml蒸馏水。？？？85％（W/V）磷酸：170ml磷酸+30ml蒸馏水。考马斯亮蓝G-250:称0.2g考
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技术员, 积分 27, 距离下一级还需 23 积分
我现在正在做藻类的试验，我从湖边取水回来，不知道怎么测定水中的藻类含量。有人知道吗？？最好是包括试验装置图片的
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技术员, 积分 27, 距离下一级还需 23 积分
叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素，通过测定水中叶绿素浓度，可掌握水藻类浮游藻类的数量。
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二星工程师, 积分 776, 距离下一级还需 24 积分
下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法. 分别详细介绍了各种方法的设备,程序,计算公式及特点.。此外,还介绍了藻类类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。 按测定方法分为六个部分：(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ; (2) 叶绿素a 的荧光检测法; (3) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的分光光度法测定; (4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定; (5) 高效液相色谱(HPLC) 测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素。
藻类的特异性色素是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素. 浮游藻类里常见的三种叶绿素是叶绿素a ,b 和c.叶绿素a 在一切浮游藻类里大约占有机物干重的1～2 % ,是估计藻类生物量的好指标. 细胞的叶绿素含量随种类或类群而有所不同,同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响.脱镁叶绿素a (一种叶绿素a 的普通降解产物) 能够干扰叶绿素a 的测定,因为如果存在脱镁叶绿素a ,它能在叶绿素a 的相同光谱区吸收光和荧光,造成叶绿素a 值的误差. 当测定叶绿素a 的时候还要测定脱镁叶绿素a. 叶绿素a 和脱镁叶绿素a 之比可作为浮游植物生理条件的一个良好指标.下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法：
(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ;
(2) 叶绿素a 的荧光检测法;
(3) 存在脱镁叶绿素a时,叶绿素a 的分光光度法测定;
(4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定;
(5) 高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素.
1 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法)
用丙酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素,用分光光度计测定萃取物的吸光度. 叶绿素自细胞内提出的难度,不同藻类差异相当大. 为了将色素完全萃出,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞.
111 　仪器和试剂
(1) 分光光度计:用窄带的(015～210nm) .
(2) 1cm ,4cm 和10cm 光程的比色池.
(3) 医用离心机.
(4) 组织研磨器(最好使用圆底的研磨管和捣杆) .
(5) 离心管:15ml ,有刻度和螺帽.
(6) 过滤设备:过滤器,滤膜(0145μm 孔径,47mm 直径) 或玻璃纤维过滤器(GFPC 或GFPA ,415cm 直径) ,真空泵.
(7)MgCO3 悬浮液:在100ml 蒸馏水中加入110g 细粉末MgCO3 .
(8) 90 %(体积比) 丙酮水溶液.
112 　测定程序
(1) 离心或过滤浓缩水样. 在离心前或过滤的最后一步加入012ml MgCO3 悬浮液.
(2) 把样品置入组织研磨器,用2～3ml 90 %丙酮水溶液覆盖浸泡.
(3) 把样品移入一个有螺帽的离心管,用几毫升90 %丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液
中,用90 %丙酮水溶液调节体积到5～10ml .
(4) 在盖紧的离心管中于500g 离心20min 澄清萃取液,把澄清的萃取液倾入一支清洁的,标定过的15ml 有螺帽的离心管并测定萃取液的总体积.
(5) 把萃取液移入1cm 的比色池,在750、663、645 和630nm 测定吸光度(OD) .
113 　计算
叶绿素a ,b 和c 的测定分别使用663、645 和630nm 的吸光度. 750 nm 的读数用来校正浑浊度. 将每个色素的OD 值中减去这个浑浊度校正值后,带入下列公式计算浓度:
(1) 叶绿素a (mgPl) = 11164 (OD663 ) - 2116 (OD645 ) + 0110 (OD630 )
　叶绿素b (mgPl) = 20197 (OD645 ) - 3194 (OD663 ) - 3166 (OD630 )
　叶绿素c (mgPl ) = 54122 (OD630 ) - 14118 (OD645 ) - 5153 (OD663 )
(2) 各单位体积色素量的计算如下:
叶绿素a (mgPm3 ) = 叶绿素a (mgPl ) ×萃取液的总体积(l) / 水样体积(m3 )
2 叶绿素a 的荧光检测法
叶绿素a 的荧光检测法比分光光度法灵敏,需样品较少. 而且不要求像分光光度法那样的波长分辨率,在430nm 的激发波长和在663nm 的发射波长抽取在试管内测定叶绿素a 可过的最佳灵感度.
211 　仪器和试剂
(1) 荧光计,备有高强度F4 T. 5 蓝光灯,光电倍增管R - 136 (红敏) ,可滑动窗孔,光发射(CS - 2 - 64)
和光激发(CS - 5 - 60) 滤光片,以及一个高灵敏度门.
(2) 其他设备和试剂同111
212 　测定程序
(1) 　用已知浓度的叶绿素溶液标定荧光计:
　用分光光度法测定浓度约为2、6、20 和60μgPl 的叶绿素a 萃取液,再在每一灵敏度位置对每一溶液进行读数,导出标定系数Fs
Fs = CaPRs
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二星工程师, 积分 776, 距离下一级还需 24 积分
水中藻类检测的方法
姓名：田家宇&&专业：市政工程&&学号：04s027026
本文主要从以下三个方面阐述了水中藻类检测的方法：
1. 藻类检测和计数新方法——置式显微镜法；
2. 改进的水中藻类检测方法；
3.藻类叶绿素及其降解产物的测定方法。
一、藻类检测和计数新方法——置式显微镜法
由于环境污染，一些湖泊富营养化程度不断加剧，导致水中藻类的快速增长。大量藻类的存在，直接影响了自来水的生产和供应。为了了解藻类对水厂各工艺环节的影响，以湖泊水为水源的许多水厂都相继开展了藻类计数检测项目。国内普遍采用的方法是将1L水样加鲁戈试剂固定在一个容器中，自然沉降24h后，利用虹吸的方法吸去上清液，并浓缩定容到30～50mL，然后取1mL放入血球计数板，在正置式显微镜下进行镜检计数[1]。此方法由于所需的水样较多（1L），在需要采集多个水样时，采集和运送的工作量大;在沉样时还要多次冲洗转移，增加了产生误差的机会，而且操作不便。昆明自来水总公司的水源之一是富化程度较高的滇池水，因而昆明水司较早开展了此项目，并得到了瑞士苏黎世供水局的技术支持和大力帮助。我们所采用的藻类计数方法的特点是使用倒置式显微镜，藻样通过沉样板一步沉降到位，与国内普遍采用的方法相比具有准确快捷，水样用量少，运送方便，无须多次冲洗转移，操作简单等优点，适用于生产和科研检测。
1.用品准备
（1）沉样板。由一个长12cm，宽4.1cm,中央有圆形凹槽（底面积为5cm2）的长方形有机玻璃板和一个可滑动的、底部与凹槽形状完全吻合的空心圆筒（容积为25mL）以及一块圆形盖玻片组成（见图1），有机玻璃板的左侧有一小孔，用于放掉上清液。
（2）倒置式显微镜。与普通倒置式显微镜不同的是，它的载物台经简单改造，增加了一个长方形的金属框，大小恰好可放置沉样板。金属框的作用是将沉样板固定在载物台上，使沉样板可与载物台同步移动，避免沉样板发生偏移。两个目镜，一个装有微型刻度尺，可直接测量藻类的大小和长度，另一个装有“&&”形标尺，在讦数时用它界定讦数范围。
（3）250mL试剂瓶。用于盛装水样。
（4）移液管（1～25mL）。
2.药品准备
①鲁戈试剂（Lugols Solution）;②福尔马林（40%）;③洒精（50％）。
3.方法与步骤
先在250mL试剂中加入6～7滴鲁戈剂，再加入200mL，左右水样，摇匀。如果水样需保存较长时间，可加入适量福尔马林（40％）。
用移液管取适量水样加入沉样板，再加入蒸馏水至满，加盖圆玻片，静沉24h。取多少水样，同藻类的多寡而定，藻类数量多可少取，数量少可多取，一般水样体积在1~25mL之间。
将沉样板上的圆筒用盖玻片推开，放掉上清液，置于显微镜上，以目镜上的“工工”形标尺为界线，随机选取若干条带计数。
一般情况是这样计数的；①在10×16倍镜头下，计数全部视野（1cm2）内的大型藻类。②在×25的倍镜下，随机选取5条带，计数基中的中型藻类。③在10×40倍的镜头下，随机选取1条带，计数其中的微型藻类。
在实际运用中，可根据当地的原水藻类情况，确定所选取的条带数。
式中N ——1mL;
& & 5——沉样板板底部圆形凹槽的底面积，cm2;
S——每个计数条带的面积，cm2;
A——选取的条带数；
V——水样体积；mL;
N——实际数的A个条带的藻类个数。
将上述三个放大倍数下计数得的藻类依上式分别计算，再相加，即得到藻类总数。
计数完毕，用蒸留水冲洗沉样板，浸泡于50％的酒精中过认，再次用蒸留水冲洗后，晾干待用。
4.注意事项
（1）沉样前，要将水样摇匀
（2）将沉样板的圆筒推开时，要防止产生气泡。
（3）将沉样板置于显微镜上时，要尽量保持平衡，避免藻类向一侧倾斜。
（4）在选取计条带时，既要注意随机性，又要注意均匀性。
5.实际样品检测
取某水厂原水用上述方法（简称倒置法）和国内普遍采用的传统方法（简称正置法）分别进行藻类检测和计数，结果见表1。
由表1可见，倒置法水样用量少，并有较高的精密度；正置法水样用量多，精密度较低，而且由于正置法使用的血球计数的容积所限（0.1m3），出现在计数框内的藻类种类也有限，如果需要分类计数，有一定局限性，不好操作。倒置法可以一边分类鉴定，一边分类计数，水样中存在的种类在1cm2的计数范围内基本都能看到，分类鉴定和计数的结果比较全面，操作也方便。另外，倒置法将水样一步沉降到位，省略了许多中间环节，减少了多次冲洗 转移带来的操作误差，从而提高了准确度。
利用倒置式显微镜进行藻类检测和计数的方法，比使用正置式显微镜的血球计数板法水样用量少，中间环节少，准确快捷，精密度较高，在分类鉴定和计数时，操作较为方便。但该方法使用的沉样板国内尚无厂家生产，需要从国外购买。
二、改进的水中藻类检测方法
水中藻类传统的测定方法是将一定量的水样加鲁哥试剂因定，在筒型分液漏斗中进行自然沉淀，48h后，借助虹吸方法吸去上层清液，按要求浓缩定容到30—50ml，然后在镜下计数，由于固定沉降时间较长，检测结果常滞后于生产和研究，影响了及时分析和解决问题。为了解决这一问题，下文对传统的检测蚊法中的沉淀浓缩进行了改进，摸索出一种快速测定藻类的方法，测定时间缩至当天即可出结果，而且准确、可靠，适用于生产和科研检测。
利用测大肠菌的抽滤装置，对检测水样进行抽滤，藻类被截留在滤膜（0.35—0.65μm）上，利用滤膜对藻细胞的吸附力并不强，用少量纯水在HJ-3型电磁搅拌器上萃取4、5次就能将全部的藻细胞洗回水中。
滤膜的主要成分是硝化纤维素（CN）,可深于丙酮，而丙酮对藻细胞形状基本没影响，当滤膜遇到丙酮后会变成透明胶液，不影响镜下观察检测。
由于丙酮易挥发，滤膜变干会恢复原型，为了保证藻细胞和滤膜的湿度，考虑到丙酮和甘油的相容性，甘油的吸潮性及本身的油脂性，能使藻细胞和滤膜在较长的时间内保持湿润透明，因此，在丙酮溶剂中加了一定比例的甘油，但甘油太多，会影响滤膜的溶解。
2.实验方法
2.1抽滤萃取法
取适量水样，按100：1的量加鲁哥试剂固定，在装有滤膜的抽滤器上进行抽滤。取下滤膜，放到100ml的小烧杯里，有藻细胞的一面朝上，加5—8ml纯水；调好电磁搅拌器转速，使液体搅拌时不会向上溅出，将小烧杯放到搅拌器上转1mim左右，取洗液。
加入纯水5—8ml纯水；重复上步聚；振洗5次，定空洗液至50ml，在显微镜下记数，计算公工：
N=[(A/Ac)×（Vs/V•Va）]×n
式中，N为每升原水样中的浮游植物数量（个•J-1）；A为计数框的体积（ml）；n为计数所得藻类数目（个）。
将上述实验洗净后的滤膜放入一平面皿，在空调下或热源边（不要超过40℃）使滤膜稍干燥，将滤膜放一载玻片上，加二至四滴滤膜透明液，使膜完全溶解成透明胶液，盖上盖玻片，在CHK型显微镜下观察。
此方法也可用来验证传统沉淀法中的弃液藻细胞流失情况。
3 结果及分析
& &取已知数量的小球藻9.643×105&#，按上述方法进行回收实验，结果见表1，两种方法在实际水样中的应用结果如表2所示。
传统沉淀方法精确度低，平行样相对偏关在+15％；测试时间较长，根据理论推算，最小的藻为沉时间需要60 ，我们实验静置学时间为43H,常有一些较小的藻细胞随弃液流失，而且在南方地区气温较高，藻细胞大都偏小，易发生流失现象，流失达30％以上。
抽滤萃取法能较好地阻止藻细胞流失，但由于滤敢太小，一般只能抽滤浊度10NTU以下的水，对于源水最多只能抽滤200ML左右的水量，太多则滤孔就会被堵 而难以达到抽滤效果，所以存在取水量较少，影响代表性，如有条件，滤膜孔径可取在1.5－1.8M,对于低浊度的出厂水和滤后水，则不存在这个问题，可抽滤200－300ml水量，而且能准确地反映水中残存藻细胞的数量。
传统的沉淀方法中由于染色时间较长，藻细胞和杂质均被染成褐色，在镜下观察时，影响藻细胞的分 而抽滤萃取则没有这种问题，因为藻细胞还保存着很好的原本色泽（绝大多数为绿色）和形状，较容易与水中的细菌、真菌以及低等浮游动物、颗粒、纤维等区分开来。
三、藻类叶绿素及其降解产物的测定方法
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