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流式细胞仪的发展历史及其原理与应用进展(正文)
流式细胞仪的发展历史及其原理与应用进展
    魏熙胤 牛瑞芳
摘 要 流式细胞分析 测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它是众多不同学术背景、不同科技领域相结合的结晶。它是物理学、生物学、医学等综合运用的产物。本文就流式细胞术的发展历史、流式细胞仪的原理及在各领域的应用进行综述,阐明现代流式细胞术由于结合单克隆抗体技术、定量荧光细胞化学技术,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。
关键词 流式细胞术 历史 原理 应用
流式细胞分析 测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它凝结众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、发展直到今天在各个领域应用的拓展,每一步都是诸如电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于它结合单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。流式细胞术的发展史也就是各个相关学科的发展史的缩影。
1 流式细胞术的发展历史
1930 年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于细胞的计数;1934 年,Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过1 根毛细管的细胞数量;1936 年,Caspersson 等引入显微光度术;1940 年,Coons 提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;1947 年,Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器;1949 年,Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利;1950 年,Caspersson 用显微分光光度计在紫外 发明第一台荧光检测细胞计;1972 年,Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号; 1975 年,Kochler 和Milstein 提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。现今随着光电技术的进一步发展,流式细胞仪已开始向模块化发展,即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照实验要求随意更换。进入21 世纪,流式细胞术已经日臻完善,成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。
2 流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪主要由4 部分组成:液流系统、光学系统、电子系统、分析系统。它只能检测悬浮的单细胞或微粒的信号。一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本,在一定气体压力下将待测样品压入流动室,用不含细胞或微粒的缓冲液 ,纵轴为相对细胞数。一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有256 或1024 通道数,这视其模/数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等。流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取,它通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体,可以产生高频振荡,使液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷,当带电液滴通过电场,在电场的作用下发生偏转,然后落入相应的收集器之中,从而实现细胞分选。流式细胞仪的分选速度从以往的5000 个/ s 提高到现在的25000 个/ s。
流式细胞术发展趋势可归纳为:
①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪;
②对流式细胞术检测荧光参数,从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析,目前最多可同时检测15 种荧光信号;
③从检测参数的相对定量发展为绝对定量;
④从检测参数的手动人工分析发展为利用计算机软件的自动分析;
⑤所采用的荧光试剂,从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切,就要求流式细胞仪使用者和科研人员,一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识,只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。
3 流式细胞术的应用
流式细胞术的应用,简单用一句话概括就是,凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域,因为最初这个技术就是为此目的而设计的。
3.1 流式细胞术在细胞生物学中的应用
染色体核型分析 用流式细胞术可将分离的染色体进行分类、纯化。传统的核型分析在取材、培养、涂片、固定后,用分带技术显示出不同染色体的特征信息,然后再显微照相,放大、剪接、组型。这是一个十分费时且不可避免掺有主观因素的技术。目前,用仪器自动分型的方法,一是采用图像技术的静态方法,再有就是采用流式细胞术。后者除可做染色体分析外还可纯化,得到克隆实验所要求的染色体,这是其他任何技术都无法完成的,为此设计专门的特种流式细胞计。
在分子遗传学领域中的应用 流式细胞术的分析功能和分选功能在分子遗传学领域很有用处。分析的功能常用来研究分离的染色体,有时也用来检测或定量测量细胞表面或内部为特异基因所编码的细胞分子;分选的功能可用来分选指定的染色体,然后用来建立人类染色体DNA 文库。
用于家畜性别的预选择 将家畜的X、Y精子分选出来,达到控制胎畜性别的目的。此外,在精子发生学、睾丸瘤、不育症、药物对精细胞的干扰等研究中,都可使用流式细胞术进行定量研究。
在微生物学中的应用 流式细胞技术在真核细胞生物学方面,特别是哺乳类细胞学方面有重要贡献,在微生物学方面的应用则发展相对较晚。实际上,微生物学,尤其是细菌学当前面临的一些问题,特别是需要对大数量细菌进行逐个的快速多参数精确测量时,流式细胞术很适合解决此类问题。已发表的论文多数是针对酵母菌和各类细菌的测量与分析。酵母菌的测量在技术上比较简单,它自身体积大,其DNA 含量约为人类二倍体细胞DNA 含量的1/ 200。已用定量DNA、RNA 和光散射方法研究酵母菌的细胞周期。用同样方法和目的,也对原生生物、藻类和霉菌类以及各种重金属对其的影响进行研究。另外用FITC 结合的抗血清可作种系鉴别,应用此项技术已能代替临床上经典的费时繁琐的细菌抗生素敏感试验和传染活性的测定。在工业中,流式细胞术可用于快速微生物鉴定,如对饮用水及原油中的微生物学鉴定与控制。
3.1.5 在细胞周期研究中的应用 在生物细胞核中,DNA 含量并非恒定,随细胞增殖周期时相不同而发生变化。G0 期是第一次细胞分裂完成后进入第二次分裂开始前的阶段。G0 期细胞是不参与细胞增殖的一群细胞,为静止期细胞,其细胞DNA 含量为较恒定的二倍体 。G1 期指第二次分裂开始到本次DNA 复制之前的过程,此期主要功能是积累能量和原料为DNA 的复制做准备,故又称DNA 合成前期。G1 期细胞具有增殖活性,开始有RNA 的合成;G0 期和Gl 期是细胞处于周期过程中两种不同功能状态时相的细胞,不能视为同一细胞,但就DNA 含量而言,两者相同,均为二倍体DNA 含量。S 期又称DNA 合成期,合成及复制DNA。当细胞进入S 期后,DNA 含量值逐渐从二倍体～四倍体增加,直到细胞DNA 倍增结束,进入G2 期。G2 期指从DNA 复制完成到有丝分裂开始的时间区间,又称DNA 合成后期或有丝分裂前期,此期合成大量蛋白质,为M期的细胞分裂做准备。经过G2 期后细胞最终进入M期,即有丝分裂期。在M期分裂为两个子细胞之前,G2 期和M期的DNA 含量均为恒定的四倍体细胞群。FCM分析细胞周期与DNA 倍体时,需对DNA进行染色。DNA 荧光染料与细胞DNA 双链的结合有一定量效关系,即DNA 含量的多少与PI 结合量成正比,因此通过荧光强度可以反映细胞内DNA 的含量。
3.2 流式细胞术在医学中的应用
在免疫学中的应用 随着单克隆抗体技术、荧光色素化学等技术的发展,流式细胞术成为当代新技术的“杂交体”。正像免疫学作为一种不断发展的学科和技术手段延伸到生物、医学及其他领域一样,流式细胞术也以它的快速、灵活和定量的特点,广泛地被应用于免疫理论研究和临床实践应用的各方面,所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体结合应用,在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监督、机体免疫状态的监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面都起着相当重要的作用。随着细胞学、病理学、免疫学、肿瘤学研究发展的需要、流式细胞测定技术也不断得到充实和完善。它不仅在功能上作为荧光显微镜的补充,而且因具备二者的全部功能和特点,从而在免疫及有关各学科领域发挥出更重要的作用。
20 世纪80 年代中期,国际上提出的白血病MIC分型法,标志着流式细胞仪及免疫分型在白血病诊断中的广泛应用。我国自80 年代中期引进该仪器,90 年代迅速发展,现在已得到普遍应用。这期间免疫标记方法已发生很大的变化,由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法,从单色或双色到利用CD45 抗体标记设门法进行多色免疫标记,使免疫分型的准确性得到很大的提高,现在已成为诊断白血病不可缺少的工具。同时淋巴瘤的免疫分型与白血病免疫分型一样也已得到广泛开展。在获得性免疫缺陷综合症和“非典”的研究与治疗中FCM也发挥极大的作用。它通过对外周血中的CD4 + T 淋巴细胞进行绝对记数,来反映病情进展及监测疗效。
3.2.2 流式细胞术在肿瘤学上的应用 利用FCM进行细胞周期分析、DNA
倍体分析、定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗和预防提供帮助。对肿瘤细胞DNA
含量作定量分析,解析细胞周期,通过细胞异倍体测定预测各种肿瘤的预后,并能在化疗中对药物的选择和放疗中强度、时间的决定等起指导作用。解析抗癌药物作用机制,对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定参考价值。此外,由于FCM对凋亡、周期蛋白、癌基因及抗癌基因的研究也发挥着重要作用,近年来引起肿瘤研究者的极大关注,已广泛应用于肿瘤基础和临床研究中,为肿瘤诊断、疗效评价和预后预测提供重要参考指标。另外,传统的细胞形态学至今仍是诊断肿瘤的一种重要的手段。多年来,细胞学工作者就设想使肿瘤细胞学诊断自动化,流式细胞术的问世,使细胞学检查自动化的宿愿如愿以偿,并已广泛应用于肿瘤临床细胞学的诊断研究。
大量的临床应用表明,流式细胞术对肿瘤细胞学的诊断正确率已达常规细胞学诊断水平。肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。肿瘤细胞的耐药性可分为原发耐药和继发耐药,前者在化疗前就存在于肿瘤细胞中,与用药无关,后者是由化疗药物诱导产生的,即在药物使用前对药物敏感,而在用药之后产生耐药。继发耐药根据耐药谱的不同又可分为原药耐药 。MDR 相关蛋白包括P 糖蛋白、多药耐药相关蛋白等。它们都属于ATP 酶活性转运蛋白,均是通过药物外排泵的作用降低细胞中药物的聚集。因此应用FCM 检测肿瘤细胞的多药耐药相关蛋白的表达水平,对监测临床肿瘤化疗效果及药物的选择有一定意义。
在血液学研究中的应用 除上述FCM在白血病及淋巴瘤的免疫分型应用之外,它在血液学研究中有广泛的用途。如血小板记数、血小板自身抗体测定、血小板膜表面糖蛋白分析、血小板活化分析等。红细胞表面相关免疫球蛋白测定、红细胞血型抗原分析等。
3.3 流式细胞术新技术的应用
液相芯片技术 生物芯片技术是近年来随着人类基因组计划和蛋白质组计划的进展在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术,现已被大家所熟知。将生物芯片技术和FCM有机结合在一起,把不同生物探针
标记在各种有荧光的微球上,以荧光标记微球作为反应载体在液相系统中完成生物学反应,即为流式细胞术液相芯片技术。它组成由微球体+ 探针+ 目的分子+ 报告分子的一种简单反应模式。可以在同一液相中同时检测多个目的分子。如对血液中多种白细胞介素检测。
3.3.2 定量流式细胞分析 定量流式细胞分析
是指用流式细胞术对细胞或微粒上标记荧光分子的定量分析,从而对细胞的生物分子进行精确测量。如每个分子表达的平均分子数、抗原数等。定量流式细胞分析不同于以往的相对荧光强度或阳性细胞百分率测量,它更为准确、灵敏。为FCM的发展趋势。如在获得性免疫缺陷综合症和“非典”的研究与治疗中,对外周血中的CD4 + T 淋巴细胞进行绝对记数,来反映病情进展及监测疗效。总之,流式细胞术应用极为广泛,本文所介绍的也只是其中一部分。随着当今各项科学技术的迅猛发展,流式细胞术会有更加广阔的应用前景。
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流式细胞仪使用手册（中文版）
仪器类型：BD FACSCalibur
第一章 流式细胞仪简介...............................................................................................1
1.1 流式细胞术发展史...........................................................................................1
1.2 流式细胞仪构造和工作原理...........................................................................2
1.2.1 概述.........................................................................................................2
1.2.2 流式细胞仪构造.....................................................................................2
1.3 流式细胞仪的主要技术指标.........................................................................10
第二章 FACSCalibur 的日常操作...............................................................................12
2.1 FACSCalibur系统...........................................................................................12
2.2 FACSCalibur开机程序...................................................................................15
2.3 FACSCalibur关机程序...................................................................................16
2.4 FACSCalibur的维护与保养...........................................................................17
2.4.1 FACSCalibur的每月维护......................................................................17
2.4.2 FACSCalibur的定期维护......................................................................18
2.5 常见故障排除.................................................................................................20
第三章 FACSComp软件..............................................................................................22
3.1 FACSComp简介.............................................................................................22
3.1.1 FACSComp运行条件............................................................................22
3.1.2 FACSComp的文件类型........................................................................23
3.2 FACSComp的功能.........................................................................................24
3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节.......................................................24
3.2.2 荧光补偿的调节...................................................................................24
3.2.3 灵敏度的测试.......................................................................................24
3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT）............................25
3.2.5 HLA-B27的校准...................................................................................25
3.2.6 LeucoCOUNT........................................................................................25
3.2.7 优化.......................................................................................................25
3.3 FACSComp的运行.........................................................................................25
3.3.1 CaliBRITE Beads的准备.......................................................................25
3.3.2 软件环境的设置...................................................................................26
3.3.3 Beads的检测..........................................................................................26
3.3.4 Optimization..........................................................................................28
3.4 Troubleshooting...............................................................................................28
第四章 FACStation 数据管理系统..............................................................................30
4.1 FACStation 数据管理系统组成.....................................................................30
4.2 FACStation文件组成......................................................................................31
4.2.1 如何建立文件夹...................................................................................31
4.2.2 FACStation文件的类型.........................................................................31
4.2.3 如何管件.......................................................................................32
4.3 实用的Macintosh OS X功能........................................................................34
4.3.1 菜单栏...................................................................................................35
4.3.2 Dock.......................................................................................................37
4.3.3 查找窗口...............................................................................................37
4.3.4 键盘快捷键...........................................................................................38
4.4 如何设置模版.................................................................................................39
4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下...........................40
4.6 可选性存储装置.............................................................................................40
4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则.......................................................40
4.6.2 光驱的维护...........................................................................................41
4.6.3 光盘的维护...........................................................................................41
第五章 CellQuest Pro软件...........................................................................................42
5.1 概述.................................................................................................................42
5.1.1 获取(Acquisition）................................................................................42
5.1.2 分析(Analysis).......................................................................................42
5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis)..................................................42
5.2 工具栏.............................................................................................................42
5.3 CellQuest Pro 的文件.....................................................................................43
5.3.1 FCS数据文件........................................................................................43
5.3.2 实验文件...............................................................................................44
5.3.3 仪器条件文件.......................................................................................44
5.3.4 统计文件...............................................................................................44
5.4 CellQuest Pro 的仪器控制.............................................................................44
5.4.1 探测器...................................................................................................45
5.4.2 放大器...................................................................................................45
5.4.3 阈 值......................................................................................................46
5.4.4 补 偿......................................................................................................46
5.4.5 状 态......................................................................................................47
5.5 CellQuest Pro 的视图.....................................................................................48
5.6 练习：3色或4色数据获取.............................................................................48
5.6.1 质控－运行FACSComp........................................................................48
5.6.2 优化.......................................................................................................50
5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件.......................................52
5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值.........................................53
5.6.5 设置淋巴细胞Region...........................................................................53
5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压）...........................................53
5.6.7 调节荧光补偿.......................................................................................55
5.7 实验练习：3色/4色预获取............................................................................55
5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口...........................................................56
5.7.2 设置Parameter Description....................................................................57
5.7.3 编辑Reagent Panel.................................................................................58
5.8 实验练习：数据获取.....................................................................................59
5.9 储存、恢复仪器设置.....................................................................................60
5.9.1 储存仪器设置.......................................................................................60
5.9.2 恢复仪器设置.......................................................................................60
5.10 储存实验模板文件.......................................................................................60
5.11 练习：数据分析...........................................................................................60
5.11.1 画Region..............................................................................................61
5.11.2 限定象限marker..................................................................................61
5.11.3 分析四色..............................................................................................63
5.11.4 批分析其余数据..................................................................................63
5.11.5 分析数据..............................................................................................64
5.11.6 将分析文件以模板形式保存..............................................................64
5.11.7 创建文具簿（stationery pad）...........................................................64
5.11.8 将统计改为电子表格..........................................................................65
5.12 Regions 和Gating（画门）..........................................................................65
5.12.1 设置Region..........................................................................................65
5.12.2 改变Region..........................................................................................65
5.12.3 用Region 统计来分析数据.................................................................66
5.12.4 门.........................................................................................................66
5.12.5 多色门.................................................................................................66
5.12.6 组合门.................................................................................................67
5.12.7 在直方图上使用组合门分析.............................................................68
第六章 FACSCalibur 分选...........................................................................................69
6.1 分选概述.........................................................................................................69
6.1.1 收集系统...............................................................................................69
6.1.2 分选模式...............................................................................................70
6.2 分选窗口.........................................................................................................71
6.2.1 Sort Setup...............................................................................................71
6.2.2 Sort Counters.........................................................................................72
6.3 准备收集管.....................................................................................................72
6.4 分选.................................................................................................................73
6.4.1 清洗分选管线.......................................................................................73
6.4.2 准备.......................................................................................................73
6.4.3 收集分选前数据...................................................................................74
6.4.4 分选条件设置.......................................................................................74
6.4.5 分选目的细胞.......................................................................................74
6.4.6 清洗分选管路.......................................................................................75
6.4.7 浓缩样本...............................................................................................76
6.5 检验分选纯度.................................................................................................76
6.6 分选问题讨论.................................................................................................77
6.7 FACSCalibur无菌分选...................................................................................79
6.8 分选细胞浓缩系统.........................................................................................80
6.8.1 系统简介................................................................................................80
6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备.......................................................81
6.8.3 确定气压参数........................................................................................82
6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选............................................................82
6.8.5 分选浓缩细胞.......................................................................................84
6.8.6 从分选管路中回收细胞.......................................................................84
6.8.7 回收细胞做进一步分析.......................................................................85
6.8.8 清洗分选管路.......................................................................................85
6.8.9 清洗浓缩器...........................................................................................85
第七章 DNA分析.........................................................................................................87
7.1 概述.................................................................................................................87
7.2 细胞周期.........................................................................................................87
7.3 DNA检测的常用术语....................................................................................87
7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数........................................87
7.3.2 DNA index（DI）：DNA指数............................................................88
7.3.3 Ploidy：倍体.........................................................................................88
7.4 影响流式DNA分析的因素............................................................................88
7.4.1 分辨率（CV）......................................................................................88
7.4.2 线性度...................................................................................................88
7.4.3 碎片.......................................................................................................88
7.4.4 细胞双粘体...........................................................................................89
7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles）..........................................................89
7.5.1 样本制备...............................................................................................89
7.5.2 上机检测...............................................................................................89
7.5.3 常见错误排除.......................................................................................90
7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据.............................................................91
7.6.1 样本制备...............................................................................................91
7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据.....................................................92
7.6.3 质量控制...............................................................................................95
7.7 用ModFit 软件分析DNA数据.......................................................................95
7.7.1 运用ModFit 进行自动分析..................................................................96
7.7.2 运用ModFit 进行手动分析..................................................................96
7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析..............................................................98
7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析.................................................................98
第八章 HLA-B27分析.................................................................................................99
8.1 检测HLA-B27的意义.....................................................................................99
8.2 HLA-B27的检测方法.....................................................................................99
8.2.1 传统方法...............................................................................................99
8.2.2 流式细胞术.........................................................................................100
8.2.3 试剂盒介绍.........................................................................................100
8.2.4 实验原理.............................................................................................100
8.2.5 样本的收集和准备.............................................................................101
8.2.6 流式检测.............................................................................................102
8.3 质量控制.......................................................................................................110
附录1： 组织相容性抗原和疾病的关系........................................................... 111
附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病................................112
第九章 MultiSET软件........................................................................................113
9.1 简介...............................................................................................................113
9.2 MultiSET运行条件.......................................................................................114
9.3 MultiSET文件类型.......................................................................................115
9.4 MultiSET软件内容.......................................................................................116
9.4.1 MultiSET界面功能分区.....................................................................116
9.4.2 MultiSET命令菜单.............................................................................116
9.4.3 MultiSET实验报告.............................................................................117
9.4.4 MultiSET运行程序.............................................................................117
9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences......................................................126
9.6 Control Panels (绝对计数质控)....................................................................128
9.7 MultiSET画门及Attractor方案.....................................................................128
9.8 注意事项及常见问题处理...........................................................................129
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