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凝血机理和凝血机制图
来源：好医生微信|作者：
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机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态和防止血液丢失的关键。机体的正常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能，有效的血小板质量和数量，正常的血浆凝血因子活性。其中，血小板和凝血因子是生理性止凝血的重要成分,(见图1)。抗凝系统不仅包括抗凝因子，还包括纤溶系统。
一、血管内皮细胞的作用
在正常情况下，血管壁内膜光滑。血管内皮细胞，是被覆于血管壁内表面的机械屏障膜，是维持血液流动状态的重要条件，也是机体重要的内分泌器官之一。内皮细胞之间的粘合质紧密相连，与内皮细胞一起发挥着阻止血细胞渗出血管外的屏障作用；内皮细胞下层的结缔组织(如胶原、弹力纤维等)结构完整，能维持血管壁一定的张力。此外，内皮细胞还通过产生促凝因子，如组织因子，促进血液凝固，形成血栓，或产生一些抗纤溶因子，如纤溶酶原活化剂抑制物(PAI)使已形成的血栓不被溶解。内皮细胞不仅参与了止血，还对血小板的止血作用起到调节作用。
1．内皮细胞的促凝血作用
内皮细胞损伤后，内皮下的IV和V型胶原以及微纤维暴露，使血小板聚集并释放TXA2，vWF还可加强血小板的粘附。vWF是因子VIII的辅助因子，最初以无活性的前体形式存在，经糖基化后水解成为成熟的亚单位。它是血小板与内皮细胞粘附的中介物。内皮细胞分泌的血小板活化因子是血小板、中性粒细胞和单核细胞的强激活剂，诱导血小板与炎症部位的内皮细胞粘附，同时还能趋化白细胞穿过单层内皮细胞；增加微血管的通透性。血管紧张素II、组织胺、ATP、缓激肽、凝血酶、肿瘤坏死因子和血管加压素等都能刺激内皮细胞合成血小板活化因子，前列环素(PGI2)则抑制其合成。
2．内皮细胞的抗凝血作用
血小板聚集时会释放出ADP和ATP，ADP可促进血小板聚集，ATP则舒张血管。内皮细胞通过其表面酶，快速改变血小板释放的ADP和ATP，将之转化为AMP和腺苷，从而抑制了血小板的活化功能。内皮细胞还能以花生四烯酸为原料合成PGI2，很强地抑制血小板的功能。许多生物活性物质能调节PGI2的合成和释放，活化的补体成分，腺嘌呤核苷酸，血管紧张素，缓激肽等都可促进内皮细胞合成PGI2。成纤维细胞生长因子，纤溶酶可抑制PGI2的合成。内皮细胞表面的硫酸乙酰肝素，通过与抗凝血酶-III结合起到抗凝作用。内皮细胞还可分泌血栓调节蛋白，它通过多种途径调节血液凝固系统。首先它可作为凝血酶激活蛋白C的辅助因子，其次它可抑制凝血酶对大分子凝血蛋白的酶解作用，另外它所含的氨基半乳糖聚糖可加速AT-III灭活凝血酶，从而发挥其抗凝作用。组织纤溶酶原激活物(t-PA)是纤溶系统的关键酶之一。它可由内皮细胞，巨核细胞和单核细胞产生。近年来，有报道，纤溶酶原和t-PA集合在内皮细胞的表面，可提高纤溶活性。凝血酶、丁酸等可使t-PA在内皮细胞中的基因表达增高。
二、血小板的作用
在正常的血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用，而是沿着毛细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损伤时，血小板的止血兼有机械性的堵塞伤口和生物化学性粘附聚集作用。止血时，首先是受损的血管壁发生收缩，使局部血液流动变慢或减少。血液中的血小板在vWF因子存在下迅速粘附于暴露的胶原纤维，此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集(血小板膜糖蛋白IIb/IIIa由纤维蛋白原介导发生互相粘附、聚集)，此为血小板第一相聚集，激活的血小板便发生释放反应和花生四烯酸代谢，其中许多物质，如血小板的ADP等，可加速血小板的聚集、变性成为不可逆的“第二相聚集”，形成白色血栓，构成了初期止血的屏障。与此同时，由血小释放和激活许多促凝物质参与血液凝固反应。血小板膜磷脂表面提供了凝血反应的场所，血小板第3因子在凝血过程多个环节中发挥重要作用，血小板合成释放的TXA2和5-HT促使进一步收缩，血小板收缩蛋白则最终可使纤维蛋白收缩(血块收缩)，使血栓更为坚固，止血更加彻底。
三、血液凝固
血液凝固简称凝血，是血液由流动状态变为凝胶状态的过程，它是止血功能的重要组成部分。凝血过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。迄今为止，参与凝血的因子共有14个。其中用罗马数字编号的有12个(从Ⅰ－Ⅷ，其中因子Ⅵ并不存在)。习惯上，前4个凝血因子常分别称为纤维蛋白原(因子Ⅰ)、凝血酶(因子Ⅱ)、组织因子(因子Ⅲ)和钙离子(因子Ⅳ)。凝血因子VI已知是血清中活化的凝血因子V，故不再视为一独立的凝血因子，详见表1。
表1　血浆凝血因子
凝血过程通常分为：①内源性凝血途径；②外源性凝血途径；③共同凝血途径，请见图2。内源性凝血途径和外源性凝血途径的主要区别在于启动方式和参加的凝血因子不同。但所谓内源性或外源性凝血并非绝对独立的，而是互有联系。
1．内源性凝血途径
内源性凝血途径是指参加的凝血因子全部来自血液(内源性)。临床上常以活化部分凝血活酶时间(APTT)来反映体内内源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子Ⅻ激活，到因子X激活的过程。当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子Ⅻ即与之结合，在HK和PK的参与下被活化为Ⅻa。在不依赖钙离子的条件下，因子Ⅻa将因子Ⅺ激活。在钙离子的存在下，活化的Ⅺa又激活了因子Ⅸ。单独的Ⅸa激活因子X的效力相当低，它要与Ⅷa结合形成1：1的复合物，又称为因子X酶复合物。这一反应还必须有Ca2+和PL共同参与。
2．外源性凝血途径
外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子Ⅹ被激活的过程。临床上以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状况。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜蛋白。当组织损伤后，释放该因子，在钙离子的参与下，它与因子Ⅶ一起形成1：1复合物。一般认为，单独的因子Ⅶ或组织因子均无促凝活性。但因子Ⅶ与组织因子结合会很快被活化的因子Ⅹ激活为Ⅶa，从而形成Ⅶa组织因子复合物，后者比Ⅶa单独激活因子Ⅹ增强16000倍。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。外源性凝血途径主要受组织因子途径抑制物(TFPI)调节。TFPI是存在于正常人血浆及血小板和血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过与因子Ⅹa或因子Ⅶa-组织因子-因子Ⅹa结合形成复合物来抑制因子Ⅹa或因子Ⅶa-组织因子的活性。另外，研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。
3．凝血的共同途径
从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
(1) 凝血酶的生成：即因子Ⅹa、因子Ⅴa在钙离子和磷脂膜的存在下组成凝血酶原复合物，即凝血活酶，将凝血酶原转变为凝血酶。
(2) 纤维蛋白形成：纤维蛋白原被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，并交联形成稳定的纤维蛋白凝块，这一过程可分为三个阶段，纤维蛋白单体的生成，纤维蛋白单体的聚合，纤维蛋白的交联。纤维蛋白原含有三对多肽链，其中纤维蛋白肽A(FPA)和B(FPB)带较多负电荷，凝血酶将带负电荷多的纤维蛋白肽A和肽B水解后除去，转变成纤维蛋白单体。从纤维蛋白分子中释放出的FPA和FPB可以反映凝血酶的活化程度，因此FPA和FPB的浓度测定也可用于临床高凝状态的预测。纤维蛋白单体生成后，即以非共价键结合，形成能溶于尿素或氯醋酸中的纤维蛋白多聚体，又称为可溶性纤维蛋白。纤维蛋白生成后，可促使凝血酶对因子ⅩⅢ的激活，在ⅩⅢa 与钙离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。纤维蛋白与凝血酶有高亲和力，因此纤维蛋白生成后即能吸附凝血酶，这样不仅有助于局部血凝块的形成，而且可以避免凝血酶向循环中扩散。
在凝血共同途径中有两步重要的正反馈反应，有效地放大了内外源凝血途径的作用。
一是Xa形成后，可反馈激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ；
二是凝血酶形成后，可反馈激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ、以及凝血酶原。凝血酶还可促使血小板发生聚集和释放反应，刺激血小板收缩蛋白引起血块退缩。但大量凝血的产生却反过来破坏因子Ⅷ、和因子Ⅴ，这是正常凝血的负反馈调节，以防止不适当的过度凝血。
四、纤维蛋白溶解系统
纤维蛋白溶解系统，简称为纤溶系统，主要作用是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，以保证血管通畅，防止血栓形成和促进伤口愈合等。纤溶系统的组成成分详见表2。
表2 纤溶系统的组成成分
&纤溶酶的激活又包括内激活和外激活两种途径。在内激活途径中，激活的Ⅻa与HMWK可使PK转变为激肽释放酶，后者可激活纤溶酶原为纤溶酶。在外激活途径中，组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶型PA(u-PA)和链激酶(SK)，也可使纤溶酶原转变为纤溶酶。但t-PA、u-PA和SK受纤溶酶原活化剂抑制物(PAI 1和PAI 2)的抑制。纤溶酶不仅能降解纤维蛋白和纤维蛋白原还能分解凝血因子、血浆蛋白和补体。但纤溶酶能与血浆中的α2-抗纤溶酶结合，形成纤溶酶-抗纤溶酶复合物，从而抑制纤溶酶的丝氨酸蛋白酶的酶解活性。具体过程见图3。纤溶酶对基质中纤维连接蛋白等大分子粘附分子的降解作用，在胚胎发生，排卵，神经发育，肿瘤细胞的植入和转移等过程中具有重要意义。
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哥伦比亚CNA血琼脂平板 培养基系列产品
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医学微生物学实验指导
实验七 化脓性感染的细菌学检查
(The Bacterial Examination of Pyrogenic Infection ）
&&&&&&&&化脓性细菌是一类能够感染人体并引起化脓性炎症的细菌。该类细菌常引起人类的皮肤、皮下软组织、深部组织、乃至内脏器官的局部化脓性感染；除引起局部感染外，还可引起败血症、脓毒血症等全身感染。化脓性细菌根据形态可分为两大类：化脓性球菌和化脓性杆菌。常见的化脓性球菌有 G + 的葡萄球菌、链球菌， G — 的脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等，常见的化脓性杆菌有铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等。
【 目的要求 】
1 、了解葡萄球菌、链球菌的形态、菌落特征。
2 、掌握致病性葡萄球菌的特征。
3 、熟悉触酶试验、血浆凝固酶试验的原理。
4 、掌握抗链球菌溶血素 O （ SLO ）抗体的测定方法及其意义。
【 临床资料 】
患者，男性， 60岁，糖尿病患者。2周前颈部背侧出现一肿块，伴有红、肿、热、痛，界限不清，逐渐向四周发展。昨日患处化脓破溃，表面有多个溃孔，脓液呈粘稠黄色。辅助检查；血中白细胞总数和嗜中性粒细胞数明显增加。经皮肤科诊断为“痈”。
问题： 1 ．此阶段应采集何种标本进行微生物学检查？
2 ．可能引起该疾病的病原体？
3 ．若病人出现高热、寒战，肝脾肿大，躯干皮肤出现瘀斑，则病情发生了什么变化？
此阶段应采集何种标本做检查？
【化脓性感染的细菌学 检测程序 】
呕吐物、粪便或肛拭子
直接涂片染色 / 悬滴、压滴镜检&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 分离培养&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 增菌培养
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 需氧培养&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 厌氧培养&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&& （血琼脂、 SS 平板）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&& （厌氧血琼脂平板）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&
&&&& 挑取可疑菌落
直接涂片染色 &
&&&&&&&&&&&&&&&&&& 三糖铁琼脂（ TSIA ）或克氏双糖 / 动力、吲哚、脲酶试验管（ KIA/MIU ）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 血清学鉴定&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 生化鉴定&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 动力鉴定&&&&&&&&&&&&&&& 药敏试验
&&&&&&&&&& &&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&确定致病菌
?????? ?????????????????????????????????
??????????
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&
&&&&& 发报告
&&&&&&&&&&&
一、标本采集
1 、 脓液标本的采集
（ 1）开放性感染分泌物或脓液常先用无菌生理盐水冲洗表面，用2支无菌棉拭子取溃疡深处的脓液及分泌物送检，一支为涂片检查用，一支为培养用。
（ 2）封闭式脓肿常于局部消毒后，用无菌注射器抽取脓液置于无菌试管送检。应注意严格无菌操作。
（ 3）如疑为脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌，则采集标本后应立即床边接种，或保暖、保湿并立即送检。疑为厌氧菌感染时，当即作床边接种或置于厌氧培养基内送检。
2 、血液标本的采集
一般在病人发病初期或发热高峰期，或根据不同的发热情况在未使用抗生素前采集做细菌培养，为提高阳性率常需连续三次采血进行血培养。采血时要 严格无菌操作。 一般在肘静脉采集血液，在采血前局部皮肤应消毒，先用碘酒消毒，然后用 75% 酒精擦拭。采血量为成人一次 5~10ml ，婴幼儿 1~5ml ，骨髓 1~2ml 。抽取的血液应以无菌要求立即注入含增菌肉汤的培养瓶内，迅速轻摇，使之充分混合，以防血液凝固。培养基与血液之比以 10 ： 1 为宜，以稀释血液中原有的抗生素、抗体、补体和溶菌酶等抗菌物质。
二、病原性球菌的形态与培养物观察（示教）
1 、病原性球菌的形态
【 材料 】
示教片：葡萄球菌、链球菌、 肺炎链球菌、 脑膜炎奈瑟菌 、淋病奈瑟菌
【 方法及结果观察 】
在显微镜油镜下，观察上述细菌并比较各菌的形态、排列、结构、染色性有何特点。
2 、培养物观察
【 材料 】
1、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血琼脂平板培养物。
2、乙型溶血性链球菌血琼脂平板培养物。
【 结果观察 】
1、取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的血琼脂平板培养物，观察二种葡萄球菌单个菌落的形态、大小、边缘、湿润度、透明度、颜色及溶血环。
2、取金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的血琼脂平板培养物，同上法进行观察比较。
三、 生化反应
（一）触酶试验
【 原理 】
具有过氧化氢酶（即触酶）的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而生成分子氧出现气泡。葡萄球菌产生过氧化氢酶，而链球菌为阴性，故本试验可用于葡萄球菌和链球菌的属间初步鉴别。
【 材料 】
1、菌种：由血液标本中分离出来的菌株（1 ~ 3号斜面标本）
2、3%过氧化氢试剂
【 方法 】（玻片法）
1、取洁净玻片一块，用记号笔划分三格。每格滴加一滴3%过氧化氢试剂。
2、用接种环从1号斜面标本中沾取少许培养物，置于第一格的过氧化氢试剂中混匀。烧灼后取2号标本置于第二格，同法取3号标本置第三格。
【 结果观察 】
立即观察结果，过氧化氢试剂中有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。
（二）血浆凝固酶试验
【 原理 】
葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种：
一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，是菌株的表面纤维蛋白原受体，可与血浆中的纤维蛋白原结合，通过交联作用使细菌凝聚。纤维蛋白原在凝固酶作用下变成纤维蛋白而附着于细菌表面。结合凝固酶可用玻片法测出。
另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，作用类似凝血酶原物质，可被人或兔血浆中的协同因子激活变成凝血酶样物质，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，可用试管法测出。
凝固酶可增强葡萄球菌的致病性，故可做为致病性葡萄球菌的鉴定指标之一。
【 材料 】
1、菌种：同触酶试验。
2 、人或兔血浆（ 1 ： 2 ）。
3 、生理盐水、玻片等。
【 方法 】（玻片法）
取玻片两张，用记号笔各划两格。一格滴加一滴生理盐水，另一格滴加一滴人或兔血浆，
然后从 1号斜面标本上刮取适量细菌加入生理盐水混匀，再取同一细菌加入血浆中混匀。同法对2、3号标本进行检测。
【 结果观察 】
静置片刻后观察，出现颗粒状凝集者为阳性。
四、血清学试验
乙型溶血性链球菌能产生链球菌溶素O（SLO），其化学成分为蛋白质，抗原性强，乙型溶血性链球菌感染患者85 ~ 90%在感染后2 ~ 3周血清中即可检出SLO抗体。 检测SLO抗体的试验即称为抗链球菌溶素O试验（antistreptolysin O test，ASO test），简称抗O试验。风湿热患者血清中抗SLO抗体显著增高，活动期增高更为显著，一般超过400单位。因此抗O试验常用于风湿热及其活动性的辅助诊断。
【 原理 】（乳胶凝集法）
血清中产生的抗SLO抗体（ASO），与溶血性链球菌中的A、C、G簇能发生免疫反应。本试验用特殊技术制备高纯度的稳定的链球菌溶素O（SLO）致敏颗粒。当血清中ASO含量达到或高于200IU/ml时，即可引起致敏乳胶颗粒的凝集。本试验检出临界值为200IU/ml，而健康人血清中ASO含量通常低于200IU/ml,所以不会引起致敏乳胶颗粒的凝集。
【 材料 】
1．待检病人血清标本1、2号
2 ．致敏乳胶试剂 5ml
3 ．阳性对照血清 0.5ml
4 ．阴性对照血清 0.5ml
5 ．其他：搅拌棒、玻片等
【 方法 】
试验前将试剂和血清标本恢复到室温。
1．取两张玻片，将玻片用记号笔做好标记，每张划分两格。在四个格中分别加入病人血清1号、2号、阳性对照血清和阴性对照血清。
2．将胶乳试剂轻轻摇匀，然后在每个格中分别加入一滴胶乳试剂。
3．用洁净的搅拌棒，在每格的反应物中分别轻轻搅拌混合。
4．轻轻摇晃玻片，2min后在光亮处观察结果。
【 结果观察 】
阳性对照应出现明显胶乳凝集现象，阴性对照不应出现凝集。病人血清出现乳胶凝集者，即为阳性，反之则为阴性。
【 思考题 】
1、简述致病性葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的主要鉴别要点。
2、致病性葡萄球菌有哪些主要鉴定指标有哪些？
3、简述抗O试验的原理及应用。
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