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标题: 高分辨率荧光显微镜：突破科研的极限(高分辨率,荧光显微镜,显微镜,分辨率)
摘要: [高分辨率荧光显微镜：突破科研的极限(高分辨率,荧光显微镜,显微镜,分辨率)] 在经历了一段时期测量技术的发展和近期物理学家带来的技术革新的冲击后，2008年，生物学家强有力的工具——高分辨率荧光显微镜问世了。Kelly Rae Chi报道。2005年夏，细胞生物学家Jennifer Lippincott-Schwartz拆除了她在马里兰国立卫生研究院暗室的红灯。Lippinc [关键词:显微镜 高分辨率 分辨率 荧光显微镜 荧光 蛋白质 生物学家 单分子]……
在经历了一段时期测量技术的发展和近期物理学家带来的技术革新的冲击后，2008年，学家强有力的工具——高分辨率荧光显微镜问世了。Kelly Rae Chi报道。2005年夏，细胞学家Jennifer Lippincott-Schwartz拆除了她在马里兰国立卫生研究院暗室的红灯。Lippincott-Schwartz 给两位赋闲在家的物理学家Eric Betzig 和 Harald
Hess腾出房间。他们致力于研究光敏定位显微镜（PALM），一种他们希望可以显著提高荧光成像分辨率飞新技术，可用来观测纳米级生物。Betzig， Hess和 Lippincott-Schwartz小组整个冬天工作在那间小屋，在那间无暖气的房间穿着棉衣，戴着帽子，收集数据。Hess说他和Betzig现在都在弗吉尼亚的霍华德休斯医学研究所的珍妮莉娅法姆研究校园，对生物学知之甚少。15年来，他们一直思考高分辨率成像。当他们知道Lippincott-Schwartz 和George Patterson 发现的光敏绿色荧光蛋白后，他们认为它正是他们探寻提高成像分辨率过程中的缺失环节。“他们非常兴奋，”Lippincott-Schwartz回忆说，“我还记得第一次的影像，很难确定我们到底在看什么。”直到她在电子显微镜下看到荧光影像，Lippincott-Schwartz才相信这种方法成功了。“我想，‘这确实是正确的。’它太令人惊奇了。”在过去的几年间，高分辨率荧光显微镜跨越了一大步，使得研究者可以从纳米级观测细胞突起的伸展。解释200—750纳米大小范围的模糊团块的时代结束了。虽然高分辨率显微镜这一设想上世纪80年代末在研究院提出并开展，最近几年才有技术上的突破，并伴随着商业化的启动。现在，很多实验室建起了他们自己的仪器并细调他们的样品，尤其是像 Lippincott-Schwartz这样的生物学家，最令人激动的时刻是看见它们能工作。 Stefan Hell冲破障碍自从1873年，Ernst Abbe 首次提出衍射限制成像的规则，研究者们确信分析两个相邻的点的能力取决于波长的限制。一个多世纪过去后，Stefan Hell，现在德国马克思普朗克生物物理化学研究所的领导者，第一次从理论上和实验中被展示，可以使用光学显微镜来分析纳米级的物体，在衍射限制下。作为上世纪80年代中期的毕业生，像他的指导教授一样工作于德国的海德堡大学，研究低温固态物理，Hell第一次意识到，不使用单镜头聚焦光线到一个点上而使用两个大孔径的镜头聚焦可能会提高分辨率。基于这一观点他发明了4Pi显微镜，他在自己家中工作，当他1990年完成博士论文时他的同伴去世了。“我思考，‘你怎样实现使用两个相对的镜头来提高分辨率这一想法呢？’”他回忆，“我设想着并把它写在纸上。”Hell需要一个地方来展示这一理论。后来，他想到一个办法，他来到海德堡的欧洲分子生物学实验所（EMBL），他1991年开始工作的地方，由德国科学基金博士后支持。早期，很多研究者，包括杰出的物理学家，认为Hell在提高分辨率方面不会走的太远。Hell是在冒险，因为没有财政独立（支撑）。但他在尝试打破衍射障碍的想法。“我留在这里仅仅是因为我想提高空间分辨率，”他说。Sunney Xie，现在马萨诸塞州哈佛大学剑桥学院的化学教授，在20世纪90年代遇见Hell并看到一些他早期关于高分辨率4Pi显微镜的言论。“他太有创意了，”Xie 说，“当他着手去做他相信的东西时，他一点都不惧怕挑战传统智慧。Hell的冒险很值得。1992年，他第一次展示了4Pi显微镜比传统显微镜提高了3-7倍分辨率。但尽管它沿着z轴提高了分辨率，仍没有克服衍射限制规则。在芬兰土尔库大学他的又一个博士后期间，一个星期六早晨当他躺在学生宿舍的床上看一本关于光的量子理论的书时，Hell有了一个想法。他想到，使用激光，他能荧光激活一个点，然后收缩那个点来消灭它周围圆环区域的散射。“我立即冲到实验室去验证，”他回忆到，“那是我经历的最激动的时刻。”在土尔库，“Stefan 工作了很长时间，”他的长期同事Pekka H?nninen回忆，他第一次与Hell合作4Pi显微镜是他们都在EMBL时。Hell 说了很多他着迷的想法。H?nninen也记得较为轻松的时刻：小组工作到深夜时，Hell吹萨克斯的声音有时会穿过新建筑的走廊回响。1994年，Hell在光学快报上发表了STED理论。但几年以后它才用于实践，这是Hell职业生涯中渐近而必要的步骤。在那期间，Hell花光了积蓄，为继续他的工作，卖掉了他的4Pi显微镜的专利权。但Abbe的理论在当时仍然占据主流。很多物理学家拒绝Hell的理论并关注于其他成像方法。尽管如此，1997年，Hell 得到马科斯普朗克生物物理化学研究所一个五年合同来展示STED工作。1999年，他把终稿送至《自然》和《科学》。都拒绝了。“他们问我，‘你研究的是哪种新生物学？’他们没看出这可以改变显微镜，”他说。但在2000年，PNAS出版的数据中，STED被用来产生第一次真实的纳米级的荧光影像，而Hell 2002年在该研究所获得终身职位，继续研究和运用新的成像方法。由于这些先驱的工作，大量的高分辨技术在学院的研究所被发展起来。现在珍妮莉娅法姆的物理学家兼工程师Mats Gustafsson领导的研究者们，研究了机构化照明显微镜，或者说SIM。这些技术背后的理论是用一连串的光图形照亮样品，这样可使不可见的超微结构以莫尔条纹的形式变成可见。这种条纹的信息可被计算机程序提取并产生高分辨的影像。2000年，在Hela 细胞肌动蛋白细胞骨架成像中，Gustafsson在横向分辨率方面进行了双重改进，与传统显微镜相比。他的小组后来利用非线性效应改进了分辨率到总因子4. 飞速发展2006年，这一领域开启了新篇章，3个小组，包括Betzig 和 Lippincott-Schwartz，同时报告他们使用了另一种办法提高了分辨率。Samuel
Hess小组是三个其中之一。Hess，缅因州大学的物理学副教授，2005年夏与该大学化学和生物学工程师做了关于怎样才能提高分辨率以观察到肝细胞中的脂质筏的交谈。此后，那个夏天的一个晚上，他被隔壁邻居聚会的声音吵醒了。半睡之中，他下楼并描绘了一个镜头和激光的可能方案的草图，该方案能使用可光敏的蛋白使细胞成像。“我想早上的时候我将对此大笑，”他回忆。但第二天早上，他无法找出这个想法的任何错误，因此他把带到了物理系同事那里，“他们也没发现问题，”他说。因此Hess开始制作这个显微镜，虽然他的启动基金即将结束，需要时间和钱来使其运转。显微镜组装后，被实验室破裂的蒸汽管阻挠，Hess和他的同事急于收集数据，唯恐他们被超过。不到两天里，该大学表面科学与技术实验室的研究者就准备了一个蓝宝石晶体，使得他们可以证明成像工作。“他们做的如此迅速并超出他们的范围来帮助我们，这是难能可贵的，”Hess说。他的小组2006年在生物物理杂志发表了数据，称为荧光激活定位显微镜技术，简称FPALM。2007年，该小组证实FPALM可以用来检测脂质筏中聚集的蛋白。与此同时，哈佛大学霍华德休斯医学院的研究员Xiaowei Zhuang的实验室，也研究高分辨成像。支持该方法的理论是所有三个小组的理论—利用单分子发射源成像的能力，编集成千上万个这样的影像来获得高分辨率—不可思议的简单。“我们一直疑惑是否其他人也这样想，”Zhuang说。2004年初，Zhuang和她的同事偶然发现某种花青染料具有光控开关，也就是说，通过使用不同颜色的光，可以随意地把它们激活成荧光状态和失活成黑暗状态。从那以后，已经研究单分子成像多年的Zhuang，与两个学生开始研究这些光控探针，用它们来短暂地分离个体分子在空间上的重叠影像从而提高分辨率。相同的基本概念也很好地支持了Eric Betzig 和 Samuel Hess的研究，尽管他们依靠活化和永久脱色的光敏探针而不是依靠光控开关。2006年Zhuang的小组在《自然方法》上发表了他们的想法，称他们的为随机光重建显微镜（STORM），并使用它以20纳米的分辨率观测DNA 和DNA蛋白质复合体。与此同时，Lippincott-Schwartz，Betzig， 和 Harald Hess在《科学》上发表了他们的PALM方法，使用它里给细胞黏着斑和特定细胞器的蛋白质成像。 投入实践那些开始使用高分辨成像的生物学家的热情显而易见。劳伦斯伯克利国家实验室的生物物理学家Jan Liphardt记得第一次看到Betzig2006年在《科学》上的关于PALM的论文的情况。当他看到标记的线粒体蛋白质的影像，他立即想到怎样把它运用到自己关于微生物的研究中。“通常我们荧光成像大肠杆菌(Escherichia coli)，你大概得到20像素的信息，甚至可能更少，”Liphardt说。“现在突然这里能成像包括不止20像素，而是成千的像素。”Liphardt 与 Betzig和其他人合作研究大肠杆菌(Escherichia coli)的趋化性。“我真的完全无法想象有能力看见、计数和定位单个细胞中的各个蛋白质，”他说。“对我而言，我好奇很多事情精确地与哪些蛋白质在什么地方和什么时间有关系。有很多间接的办法来确定它们，但这可能是很长时间来我看到的最发人深思的技术革新。”Nicholas Barry领导的一个小组也与Betzig的小组合作，丹佛科罗拉多大学的一个医学副教授，装备了一个商业化的蔡斯显微镜，专为全内反射荧光成像（TIRF）设计，研究蛋白质怎样聚集到肾细胞的顶膜。Barry说有了蔡斯系统和平均计算机，其他部分的组装相对简单。他们增加了两个估价约3万美元的激光器。他们可以集成一个影像，使用大约10分子每帧，8分钟10，000帧。文件大小约三分之一gb。他们用一种免费程序语言—Perl 编写自己的软件。“在单分子literature有很多背景信息可用来辅助计算PALM图像，”他说。Barry 打赌很快会有人编写运行可插入成像的程序，来自国立卫生研究院的一种免费分析程序。“几乎可以肯定，”他说。加利福尼亚帕罗阿尔托的斯坦福大学的化学与应用物理学教授W.E. Moerner，1989年第一次尝试看单分子光学，他说这些年来高分子成像经历了惊人的演变，现在通过使用单分子作为超高频发射器达到定点。“这个发展太棒了，在研究单分子几乎20年后，”他说。 2008及展望自从2006年STORM和PALM问世以来，研究者兴奋地研究改进和新应用软件。2008年也不例外。Lippincott-Schwartz的小组把PALM和单粒子失踪结合起来探测肝细胞膜蛋白的运动。《科学》中，Zhuang的小组展示了3D STORM成像，比三维空间衍射极限空间分辨率好十倍，并使用此方法在猴肾细胞中成像微管和其他分子结构，后来扩展此方法为整个细胞的多色3D成像。Gustafsson和其他报告使用3D SIM—一种使用三束干扰光线代替二束的方法—来观测哺乳动物(mammalian)细胞核无法被共聚焦显微镜探测的部分。总部位于德国的蔡斯，进一步发展了SIM 和PALM 技术，期待2009年末公布彻底的成像系统。Hell的小组，2008年初，使用STED方法视频展示活神经元里突触泡的活动，与标记抗体有关的蛋白质。后来，他们把4Pi和STED结合起来产生了固定细胞线粒体的3D影像，以40—50纳米的分辨率。进来，他们运用高分辨成像研究脑膜的形态学可塑性和重建活神经元树突的3D影像。Gustafsson说，伴随3D和肝细胞的能力，过去几年该领域爆发了。“现在很明显，随着PALM和STORM等的出现，及近期的进展，这些技术使得过去不可能的很多事情成为可能，”他说。虽然很多研究人员从此技术中获益，仍有空间改进它的可及性。很多实验室能成功的运用此技术是由于研究人员精通物理学和生物学，他们能把显微镜组装起来并使它检测生物样品。Moerner指出编写软件不是一个小事，定位和报告你探测的光子需要仔细的计算来定义最终的分辨率。高额的费用也限制了可及性。 Leica的TCS STED显微镜最高一百万美元，丹佛科罗拉多大学光学显微镜实验室的Bill Betz说，接受资助仍是一个挑战。Betz 为显微镜申请联邦基金但被拒了。“它新但昂贵。现在，管理者试图到处扩展资金，”他说，还说他们计划再申请基金。然而，Stefan Hell指出新激光设备使研究者在自己的实验室花费低于10万美元就组装一个STED仪器成为可能。除了生物学家技术到手，研究人员说他们在目的在于更广阔的更多样化的范围的荧光探针。好的探针最终转变成好的分辨率和更快的图像处理。“为观察活的哺乳动物(mammalian)细胞，你必须有整套的光敏化和光控开关蛋白质，”纽约医学院阿尔伯特爱因斯坦学院的解剖和结构生物学的副教授Vladislav Verkhusha说，PALM促进了他自己在荧光蛋白的研究。虽然研究这持续的改进，新的一年将标记着超分辨荧光显微镜方法广泛使用的开始，Harald Hess说。“它将真正进入生物学家手里，”他说。“与此同时，我们不断问他们，‘什么是实验的魔力杀手？’有很多好答案。”Xiaowei Zhuang，她的小组在进行的很多方向之一是与Alice Ting和她在剑桥马萨诸塞技术学院的实验室合作研究允许小而亮的光控探针与细胞中的特定蛋白结合的标记策略，那样可使活细胞成像。“标记基因与小而亮的光控探针的结合将是未来分子水平高分辨成像的策略，”她说。
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>> 《自慢》 第二部分
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《自慢》 突破自己的能力极限
&&&&没有人天生英明神武，也没有人生来就聪明绝顶，所有的能力都是一点一滴慢慢培养的。关键在于每一个人是否有计划地一步一步自我训练、自我突破、自我调整。
&&&&出版是一件有趣的事，经常会遇见全新的工作经验，而每一次新经验，都代表自己在挑战未知，测试自己的能力极限。
&&&&新书的投标就是典型的自我挑战过程。记得刚开始时，我只敢，也只能用最低的预付金出价，因为我的出版能力不足，不敢出高价抢标。但随着经验的增加，我的投标金也水涨船高，从一两千美元，到三五千美元，到一万美元。记得我第一次投标超过一万美元时，我十分兴奋，我告诉自己，这本书绝对不能做输，我要证明我有做万美元大书的能力。
&&&&接着，我又从一万美元，到三五万美元，到十万美元，现在我最高的经验是近二十万美元。一本书要付到二十万美元的权利金，这代表这本书如果没有卖到六万本以上，我就要赔钱，而以台湾这么小的市场，二十万美元的预付版税，这绝对是天价。
&&&&当然经过这些历练，三五万美元对我变成“家常小菜”，轻松愉快！我知道人的成长与学习，是在不断自我挑战、自我突破中，能力的极限不断扩大，视野、企图也不断延伸。
&&&&我也要求自己的团队，复制我的经验。我要求他们也要不断扩张他们的能力极限，但并不顺利。遇到大书，要拉高投标金，要扩大工作规格，他们愿意出的投标金额，总比我的想象差很多。我知道，他们信心不足，自我挑战的企图不够。
&&&&我不愿揠苗助长，我让他们按他们的想象出价，但经常失之交臂，对手们的气派、想象力总比我们丰富。拿不到大书，这是我让团队自由成长的代价。
&&&&我曾经尝试，要求某些高级主管，每年至少要买一本预付五万美元的大书。可是他们面有难色，问我：“何先生，你要我故意拉高预付，达到你的标准，却让公司损失吧！”我无言以对。
&&&&我仔细回想，他们遇到大书，投标金超过几万美元时的情境：他们感受到的是压力、是困惑；而投标失利时，反而是轻松、是解脱。做能力以内的事，他们应付自如；超过他们能力极限，他们害怕，他们踌躇不前！
&&&&我回想自己的成长历程，当每一次遇到挑战，面临超过我经验值的事时，我知道我退无可退，做了过河卒子，只能勇敢向前，那颇有狗急跳墙的味道，但也因为如此，我打起精神、全力以赴，也就关关难过关关过，我的能力极限不断扩大成长。
&&&&在学习成长的初期，我的挑战、我面临的困难，都是老板逼的，都是老板命令的，我无法拒绝。但后来，我逐渐知道，我可以的，不用怕，于是我开始习惯挑战，习惯不断自我测试能力的极限，甚至对没有难度的事，兴味索然。
&&&&我应该这么说，能力是挑战出来的。每一段时间就要设立一个更高的目标，让自己陷入困难，然后全力以赴完成。每一次的挑战，都是成长的机会，遇到超过能力以外的事，应该兴奋、要高兴，那是人生最关键的时刻！
&&&&后记
&&&&每一个人的成长，都有两股力量，一是内心，自我的期待；一是外力的压迫。这两者相互为用，重点是自己要愿意承受挑战，否则会崩溃。
&&&&好公司、好主管通常都会塑造一个高度挑战的环境，迫使每一个人不断突破自己的极限。
&&&&一个杰出的人才，更不会满足现状。
&&&&你是不断面对极限挑战的人吗？
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一起来阅读《自慢》吧！作者：何飞鹏
书籍简介：　　“自慢”的职场私房学，是你增强专业竞争力的捷径。　　“自慢”，形容自己最拿手、最有把握、最专长的事。自己的拿手与在行，是不是比别人更好，其实不知道，但绝对是自己最自信、最有把握的事。每个大厨都有“自慢”的料理，每个职场高手都有自豪的本事。面对职场上的竞争与起落，成功的最关键之处在于态度。
当当网免费试读此书地址：/book_49?ref=read-7-share１２９８中国情况；
１２９８中国情况。２．８．２基于荧光寿命测量的ＦＲＥＴ显微镜在ＦＲＥＴ发生时，除厂荧光光强发生变化外，供体的荧光寿命也会改变。利用荧光寿命显微镜（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＬｉｆｅｔｉｍｅＩｍａｇｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＩ，ＩＭ）Ｊ６９￣１７ｈ观测ＦＲＥＴ过程，可以获取极高的空间和时间分辨能力。适合捕捉活细胞中的动态过程０７２￣１７５。。在基于荧光强度测量ＦＲＥＴ时，荧光分子浓度增加与ＦＲＥＴ效率降低所带来的供体荧光光强增强足无法区分的。这一情况在ＦＲＥＴ―ＦＩＩ。Ｍ中得到有效改善。因为荧光寿命是一种荧光分子的内秉属性，在浓度不太大的情况下。荧光寿命不受浓度变化影响１７㈠。测量发生ＦＲＥＴ前后的供体荧光寿命ｒ。＋Ａ和ｎ一。，由式（５ｂ）计算得到ＦＲＥＴ效率。或采用双指数模型拟合荧光衰减曲线。获得发生ＦＲＥＴ与未发生ＦＲＥＴ的荧光分子的比例１７ｈ。利用荧光寿命的唯一惟还可以去除非供体荧光信号从而提高ＦＲＥＴ效率的精确度。另外ＦＲＥＴ―ＦＩ。ＩＭ只测量供体的荧光寿命，不涉及受体，较少受到ＳＢＴ影响，无需进行ＳＢＴ修正，简化了实验和数据处理过程”孔”引。ＦＲＥＴ－ＦＩ。ＩＭ实现方式有时域法和频域法两类。１７５’１７７｜。时域法采用短于皮秒的脉冲激发供体荧光分子，测量荧光寿命有多种方式，主要有时间相关单光子计数法（ＴｉｍｅＣｏｒｒｅｌａｔｅｄＳｉｎｇｌｅＰｈｏｔｏｎＣｏｕｎｔｉｎｇ，ＴＣＳＰＣ）［１７８］和多时域测鼍法（ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｍｅ―ｇａｔｉｎｇＭｅｔｈｏｄ）［１７９’１８“等，前者具有皮秒级的高时问分辨率，后者具有快速获取图像的能力。频域法采用调制光源（一般是正弦光强分布）照明，由于荧光寿命的存在会使发射光相对于激发光产乍相位移动以及调制深度变化，通过测量它们就可以计算获得荧光寿命－１７７１。２．８．３基于其他物理量测量的ＦＲＥＴ显微镜事实上除＿『以上介绍的通过测量荧光光强和荧光寿命获得ＦＲＥＴ效率外，也可以通过测量荧光分子其他光学特性的变化。如极化率、受体光漂白等。文献［１８１－］歹１Ｊ举的ＦＲＥＴ测量方式达２２种之多，除了已介绍的两类，常用的还有受体光漂白成像。１８２“８３｜，光谱成像：１８¨８５］，荧光极化成像…６Ｊ刚等，它们具有各自的用途和特点。单ＦＲＥＴ局域化作用决定了它们都可以达到纳米级的分辨率。ＦＲＥＴ在生物活细胞研究领域已经获得广泛的应用。例如测量细胞内钙离子浓度２９０１８８＂，研究蛋白质～蛋白质相互作用。”９￣１９１，蛋白质分子内部构造变化：１９２叫９４一等。万　方数据激光３５卷许多新型荧光分子的出现加速了ＦＲＥＴ显微术的发展。获取光谱匹配好、高激发效率和高量子产率的荧光分子是ＦＲＥＴ显微术发展的关键。ＣＦＰ和ＹＦＰ因其光谱苇氇面积较大，ＦＲＥＴ效率高，是目前最好的ＦＲＥ７Ｆ探针对，但另一方面也带来较严重的串扰。一些高激发系数和量子产率的荧光分子的出现缓解了上述问题，例如优化的ＣＦＰ：ｍＣｅｒｕｌｅａｎＪ％一和ＳＣＦＰ３～¨６。，优化的ＹＦＰ：ｍＣｉｔｒｉｎｅＬｌ９７：，ＳＹＦＰ２Ｅ１９６一和ｍＶｅｎｕｓ！”８｜。值得注意的一点是ＦＲＥＴ显微术中获取的图像反映的审问信息是一个相对距离（以Ｆｏｓｔｅｒ半径尺。为标度），往往没有准确的数值。ＦＲＥＴ作用的局域性也将测量范围限定在ｌ～１０ｎｍ范围内ＬＩＳｌＪ。２．９单分子显微镜２．９．１单分子显微术的早期发展Ａｂｂｅ理论指出在远场无法分辨相距２／２ｎ的两个荧光分子所成的像，但并没有限制单个荧光分子“位置”可以达到的精度，如果在２／２ｎ内仅有一个荧光分子发光，光学显微镜町以获得极高的定位精度，如１．５ｎｍ【１９９］。将单个荧光分子发射的大量光子所形成的ＰＳＦ用高斯函数拟合，以高斯函数的中心作为荧光分子的位置，这一过程被称作ＰＳＦ的数字化。忽略探测器像素有限尺寸和背景噪声的影响，单分子的定位精度与发射光子数的关系为拉００矗０１ｊ：‰≈者，（６）式中以．，为定位误差，ｓ为模拟ＰＳＦ高斯函数的标准差，Ｎ为收集的光子数。荧光波长５００ｎｍ对应的ｓ约为２００ｎｍ，荧光分子漂白前发射１０４个光子，精确度达２ｎｍ。单分子显微镜以单个分子或几个单分子为研究对象。相对于其他光学显微镜分辨率的概念，单分子定位精确度和可分辨的两个单分子间距更适合用来描述这类显微镜的性能。为了减弱布朗运动的影响。早期的单分子研究都是在低温下进行的：２０２舢１，随着单分子的捕捉和固定技术的应用：２“’２０５］，室温下的单分子研究蓬勃发展：２０６，２０７］，对ＤＮＡ，ＲＮＡ，酶的研究已被广泛地报道［２０８￣２１２］。利用单分子Ｃｙ３标记肌球蛋白结合ＰＳＦ数字化，观察到肌球蛋白几十纳米的步进距离，精度达１．５ｎｍ［１９９ｊ，揭示了肌球蛋白ｈａｎｄ―ｏｖｅｒ―ｈａｎｄ的运动方式（相应的方法被称为ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｍａｇｉｎｇｗｉｔｈ１－ｎｍＡｃｃｕｒａｃｙ，ＦＩＯＮＡ）。单分子显微术的精度非常高，但一个爱里斑巾只允许标记一个分子，高定能精度并没有转９期毛峥乐等：超分辨远场生物荧光成像――突破光学衍射极限１２９９化为高分辨率，只适用于单个分子行为的研究。２．９．２几种区分一个爱里斑中多个荧光分子的方法为了克服一个爱里斑中只允许标记一个分子的限制，有人提出利用不同发射波长的荧光分子同时标记，利用光谱特性分离各类荧光分子的信息［２”］。例如同时使用Ｃｙ３和Ｃｙ５荧光分子标记肌球蛋白，可获得１０ｎｍ距离的测量精度，这一方法被称为Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅＨｉｇｈ―ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＣｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ度增加，计算精度的要求逐步提高，当接近单分子所能达到的极限时，这种方法就失效了。目前这种方法所允许的标记浓度仅为２～５个／ＤＩ。Ｒ［２１６］，对分辨率的提高有限，仅适合大分子中简单结构的研究‘２１７１。２．９．３区分一个爱里斑内高密度标记的荧光分子的方法２．９．３．１ＰＡＩ。Ｍ（ＰｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＨＲＥＣ）ｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓＥ２１４’２１５｜。但要保证Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）ＰＡＬＭ［ｚｌｇ～ｚｚｚ３采用与上述几种方法相反的途每个衍射限制区域（ＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎＬｉｍｉｔａｔｉｏｎＲｅｇｉｏｎ，ＤＩ。Ｒ）内各种荧光分子有且只有一个是非常困难的，而且在室温下也不可能在一个ＤＬＲ范围内标记过多种类的荧光分子，另外色散的存在也增加ｒ实验的复杂性。将单分子显微术的高定位精度转化为高分辨率的关键在于如何在一个ＤＬＲ内区分多个荧光分子，荧光分子漂白的现象为增加荧光分子的密度提供了一种途径。它的思想是在一个ＤＬＲ内将多个荧光分子逐个漂白。如图２２所示［２１６］，通过每次漂白事件发生前后光场统计分布的变化计算得出该次漂白分子的准确位置。利用Ｃｙ３标记可以分辨相距１０ｎｍ的两个荧光分子，精度达２．５ｎｍ（相应的方法被称为Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ－ｌｏｃａｔｅｄＭｕｌｔｉｐｌｅＳｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ径，使一个ＤＩ。Ｒ内的荧光分子逐个激活发光，允许１０４～１０５／肚ｍ２高密度的标记。ＰＡｌ。Ｍ人选２００６年《Ｓｃｉｅｎｃｅ））十大进展。其核心思想为“ｏｎｅａｍｏｌｅｃｕｌｅａｔｔｉｍｅ”。为了实现这一思想，Ｂｉｅｔｚｉｇ等ｃ２１９卫２０３采用ｎｍ光敏荧光蛋白作为探针标记样品，以波长４０５的紫外脉冲光为激活光来敏化荧光蛋白，再用波长５６１ａｍ的连续光激发荧光，此时只有被敏化的荧光分子可以被激发发射荧光，其他荧光分子均处于非荧光态。采用超低光强的激活光（ｍＷ／ｃｍ２）使每次只有极少数的光敏蛋白质被敏化，因此只有极少数的光敏蛋白被激发发射荧光，从而实现“ｏｎｅｍｏｌｅｃｕｌｅａｔａｔｉｍｅ”。记录单个荧光分子的光子直至漂白并通过ＰＳＦ数字化计算出中心位置，如图２３所示［２１９］。反复．这?过稃ｉ至个获取数微斗∈尺度范围ＮＡＬＭＳ）Ｅ２１６］，类似地有人提出（Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅＨｉｇｈ―ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＩｍａｇｉｎｇｗｉｔｈＰｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ，ＳＨＲＩｍＰ）［２１７｜，证明了相似的分辨能力和精度。这一思想也可以利用荧光半导体量子点的光闪烁现象实现∽１８］，但是随着一个ＤＬＲ内荧光分子密石．兰△青＆葛兰ｊｏＵ图２２一个ＤＬＲ内５个荧光分子逐个漂白，光强逐步变化。通过漂白前后光强的变化计算得到上一个漂白分子的位置Ｆｉｇ．２２ＦｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｂｙｏｎｅａＤＬＲｂｌｅａｃｈｅｄｏｎｅ图２３ＰＡＩ。Ｍ计算每个分子的位置叠加得到整幅图像ＰＡＬＭｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓａｏｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈＦｉｇ．２３ａｔｍｏｌｅｃｕｌｅ’ｓｐｏｓｉｔｉｏｎｏｖｅｒａｌｌｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｔｉｍｅｔｏｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｉｍａｇｅ万方数据　１３００中国内所有荧光分子的中心位置。最后叠加币：构成一幅完整的图像。ＰＡＬＭ对１００ｎｍ厚的溶酶体和线粒体薄片样品的二维成像达到２～２５ｎｍ的单分子定位精度，其典型的单帧图像获取时间为０．５～１ｓ。这样获取一幅含有１０１～１０二个荧光分子的完整图像需要２～１２ｈ，而细胞内活体成像需要１００～１０００ｆｒａｍｅ／ｓ的速度，因此ＰＡＩ。Ｍ暂时只能用于同定结构０２“２２１。。图２４ＰＡＩ。Ｍ与ＲＥＳ（）Ｉ，ＦＴ显微镜成像过程对比Ｆｉｇ．２４ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍａｇｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓｂｅｔｗｅｅｎＰＡＬＭａｎｄＲＥＳＯＬＦＴｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｅｓＰＡＬＭ与ＲＥＳＯＬＦＴ显微镜具有一定的相似性。如图２４所示【１４引。它们都是选择性激发荧光分子，不同之处在于前者是随机激发，荧光分子每次循环产乍的光子都作为信号被收集，因此ＰＡＩ。Ｍ对荧光分子发射光子能力的利用更充分。许多光敏蛋白，如：ＫＡＥＤＥ。ＦＰ―ＧＦＰ，ＤＲ（）ＮＰＡ都适Ｊ｝Ｊ于实现ＰＡＬＭ机制０２３￣２２６Ｉ。由式（６）町知采用发射荧光光子能力强的荧光分子（即增大式（６）中的Ｎ值）日『以提高定位精度，但发射光子数量的增加町能导致单幅图像获取时间的延长。为了缩短成像时间，最直接的方法是降低荧光分子标记浓度，这会造成图像细节的丢失。缩短成像时间的另一途径是增加激发光强。光敏化后，对于理想的荧光分子，被抽运光激发时可由基态跃迂至激发态，随后再通过发射荧光跃迁同基态，反复这一过程直至完全被漂白。当抽运光强增加至饱和强度时，基态几乎一次性被耗尽，因此最终的图像获取时间将取决于荧光寿命。通常荧光分子的荧光寿命为纳秒量级，相应的单幅图像获取时间被缩短至毫秒量级。然而对于实际荧光分子，随着激发光光强的增大，光闪烁现象（ＰｈｏｔｏＢｌｉｎｋｉｎｇ）加剧：引乩２玎，万　方数据激光３ｊ卷电子跃迁争寿命长达１ｓ的暗态。这小仅增加ｒ单幅图像的获取时间。还町能成为ＤＩ，Ｒ内下一个激活荧光分子信哆的噪声。在ＤＩ。Ｒ内仅有一个荧光分子被激活的前提下，适Ⅵ１增火激活光光强使每次有较多的荧光分子被敏化能够减少单幅图像的数日。采用高受激吸收截面和高量子产率（高亮度）的荧光分子能够加速激发和漂白的过程，有效缩短单幅图像的获取时间，同时也提高ｒ荧光信号与自荧光发射的信噪比。在ＰＡｌ。Ｍ成像过程中除了敏化荧光分子发射的荧光外还存在非敏化荧光蛋白的自荧光发射产牛的背景噪声。由此信噪比的数值限制厂荧光分子的密度１９６。ＰＡｌ。Ｍ巾由于单分子荧光信号ｆ‘分微弱，需耍高灵敏的探测器。如增强ＣＣＩ）‘““比“，并结合ＴＩＲＦ技术收集信号¨。。ＰＡＩ．Ｍ暂时无法对厚样品内部三维成像。ＰＡＩ。Ｍ作为光学显微镜获得了与电子显微镜相近的纳米级的分辨率。然而棚对于后者，ＰＡＩ。Ｍ样品制备和试验装置更简单和廉价，采用双色荧光分子标记ＰＡＩ。Ｍ还有单进一步提高分辨率川９。２．９．３．２ＳＴ（）ＲＭ（ＳｔｏｃｈａｓｔｉｃＯｐｔｉｃａｌＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）ＳＴ（）ＲＭ２曲与ＰＡＩ。Ｍ基本原理类似，都足利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过ＰＳＦ数字化获得其中心位置。ＳＴＯＲＭ采用Ｃｙ３和Ｃｙ５分子组成探针对，通过二者间的相互作用控制明暗两念之问的转化，直至永久性漂白。具体过程如下：首先采用一束较强的红光使观测范围内所有的Ｃｙ５分子进入暗态。接着采用较弱的绿光（～１Ｗ／ｃｍ２）抽运Ｃｙ３分子剑激发态，通过处于激发态的Ｃｙ３分子与Ｃｙ５分子的卡Ｈ互作用使一小部分Ｃｙ５分子从暗态恢复至荧光态。此时，再次利川红光（～３０Ｗ／ｃｍ２）可以激发这一小部分Ｃｙ５分子发射荧光。发射荧光后的Ｃｙ５分子将再次暂时进入一个稳定的暗念，等待下次被激活。通过红绿激光对Ｃｙ３一Ｃｙ５荧光分子进行交替照明，町使（、ｙ５荧光分子反复经历“激发一荧光发射一暂时漂白恢复一再激发”的循环达数百次，直到最终被永久惟漂ｒｉ。由此可见，Ｃｙ５分子单次循环类似于ＰＡｌ。Ｍ。将单次循环获得的光子信号利用ＰＳＦ数字化得到中心点。不同的是瞥次循环后Ｃｙ５分子只是暂时漂白。在Ｃｙ３分子的作用Ｆ叮以恢复进入下一次循环。多次循环得到多个中心点，最后将所有的中心点使用高斯函数拟合，以高斯函数中心点作为Ｃｙ５分子的位９期毛峥乐等：超分辨远场牛物荧光成像一一突破光学衍射极限１３０１置。所有探针分子对都经历以上过程确定它们的位置，从而实现整幅图像的重构。ＳＴＯＲＭ的定位精度依赖于单次循环荧光分子发射光子的个数，文献ｒ２２列报道了单个探针对经过２０次循环，样品漂移校正之后，Ｃｙ５分子中心点拟合的高斯函数半峰全宽（ＦｗＨＭ）约１８ｎｍ。理论上相距２０ｎｌＴｌ的两个Ｃｙ５分子可被分辨。如图２５所示。２２９］，对ｄｓＤＮＡ双链标记观测中，相距４０ｎｍ的两个Ｃｙ５分子可被分辨，定位精度约２０ｎｍ。图２５（ａ）利用Ｃｙ３一Ｃｙ５分子对标记ｄｓＤＮＡ；（ｂ）Ｃｙ５分子多次循环后确定ＰＳＦ中心点（标度为２０ｎｍ）Ｆｉｇ．２５（ａ）ｄｓＤＮＡｔａｇｇｅｄｂｙＣｙ３一Ｃｙ５ｐａｉｒｓ；（ｂ）ＰＳＦｃｅｎｔｅｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｉｍａｇｉｎｇｃｙｃｌｅｓ（ｓｃａｌｅｂａｒｓ，２０ｎｍ）ＳＴＯＲＭ在超低激发光光强下实现了Ａｂｂｅ分辨率极限的突破，利用不同频率的光分别控制荧光激发和荧光态恢复，与ＰＡＬＭ相比具有更好的可控性。另外值得强调的是：ＳＴＯＲＭ采用多次测量ＰＳＦ中心（每次测量的荧光光子数目较少），最后将所有ＰＳＦ中心进行高斯拟合重构中心位置；而ＰＡｌ。Ｍ采用的是单次测量（一次性探测所有的荧光光子）计算得到中心位置。从统计学意义上说，在荧光分子静止不动且发射荧光光子总数相同的情况下，ＳＴＯＲＭ和ＰＡＬＭ两种成像方式的成像精度相同，但当成像过程中荧光分子发生微小随机漂移时，ＳＴＯＲＭ短时间常数多次测量的方式受到荧光分子随机运动的影响更ｄ，ｃ２３０｜。Ｃｙ３分子与Ｃｙ５分子的光可控性非常适用于ＳＴＯＲＭ机制的实现，但它们不能像自荧光蛋白一样通过基因编码入细胞。Ｃｙ３一Ｃｙ５分子植入细胞中的方法还需要进一步探索。３结论本文概览了当前超分辨远场生物荧光成像领域的一系列新发展、新技术。成像――或者更一般地说――观测几乎是一切科学研究的出发点。纵观历史，每一次成像技术的革新都会带来一系列重大发万　方数据现，多位科学家凭借在成像领域的工作获得诺贝尔奖。Ｗ．Ｃ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎ因发现Ｘ射线获得１９０１年诺贝尔物理学奖；Ｆ．Ｚｅｒｎｉｋｅ发明相衬显微镜获得１９５３年诺贝尔物理学奖；Ｅ．Ｒｕｓｋａ发明电子显微镜，Ｇ．Ｂｉｎｎｉｎｇ和Ｈ．Ｒｏｈｒｅｒ发明扫描隧道显微镜共同获得１９８６年诺贝尔物理学奖以及Ｐ．Ｃ．Ｌａｕｔｅｒｂｕｒ和Ｐ。Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ因发明核磁共振成像技术共同获得２００３年诺贝尔生理学或医学奖等。在生命科学技术和纳米技术逐步融合的今天，超分辨成像的重要性不言而喻，层出不穷的新型光学成像技术纷纷突破衍射极限，将分辨率提高至几十纳米甚至单分子量级，揭示了许多前所未见的生物微观结构和现象。尽管如此，荧光分子的光漂白、生物样品的光毒性、成像速度慢、分辨率不高、成像装置复杂昂贵等一系列问题仍然存在并阻碍着超分辨远场光学技术的进一步发展，这也为今后的科研工作者提供了广阔的研究空间。我们相信随着现有超分辨光学成像技术的不断完善，以及全新的成像机制和发光性能更优异的荧光分子的出现，超分辨远场生物荧光成像技术将会为人类揭示更加丰富多彩的生物纳米世界。致谢作者由衷感谢第二军医大学神经科学研究所陈宜张院士阅读全文并提出宝贵意见。感谢中国科学院上海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室周增会博士、孙海轶博士以及何飞和乔玲玲同学给予的热情帮助。参考文献１ｈｔｔｐ：／／ｎａｎｏ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｒｅｓｏｕｒｃｅ―ｃｅｎｔｅｒ／ｔｅｃｈ―ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｅｒ．ａｓｐ２Ｒ．Ｈｏｏｋｅ．Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｉａ［Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ：ＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＬｏｎｄｏｎ．１６６４３Ｅ．Ａｂｂｅ．ＣｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔＯｔｈｅｔｈｅｏｒｙｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｔｈａｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ａｎａｔ．，１８７３。９：４１３～４６８（ｉｎＧｅｒｍａｎ）４Ｄ．Ａｔｔｗｏｏｄ．Ｎｅｗｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓａｔｓｏｆｔ―Ｘ―ｒａｙｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓ．Ｔｏｄａｙ，１９９２，４５（８）：２４～３１５Ｍ．Ｖ．Ｍａｔｚ，Ａ．Ｆ．Ｆｒａｄｋｏｖ。Ｙ．Ａ．Ｌａｂａｓｄａ１．．ＦｌｕｏｒｅｓｅｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＡｎｔｈｏｚｏａｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ０１．，１９９９，１７（１０）：９６９～９７３６Ｋ．Ｋｏｎｉｇ．Ｔ．Ｋｒａｓｉｅｖａ?Ｅ．Ｂａｕｅｒｅｔａ１．．ＣｅｌｌｄａｍａｇｅｂｙＵＶＡｒａｄｉａｔｉｏｎｏｆｆｌｍｅｒｃｕｒｙｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｌａｍｐｐｒｏｂｅｄｂｙａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，ｃｌｏｎｉｎｇａｓｓａｙ，ａｎｄｃｏｍｅｔａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．?１９９６，ｌ：２１７～２２２７Ｌ．Ｒｅｉｍｅｒ．ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＰｈｙｓｉｃｓｏｆＩｍａｇｅＦｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄＭｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ［Ｍ］．Ｂｅｒｌｉｎ：ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，２０００８ＪｉｎｔａｏＹａｎｇ．ＷｅｎｄｏｎｇＸｕ．Ｓｃａｒｍｅｄ―ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒａｔｏｍｉｃｆｏｒｏｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｗｉｔｈｌａｒｇｅｓｃａｎｎｉｎｇｒａｎｇｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．，２００６，４（１０）：５８０～５８２１３０２中同０ＹａｎｇＪｉｎｔａｏ．ＸｕＷｅｎｄｏｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎｏｆｏｐｔｉｃａｌｔｒａｃｋｉｎｇｆｏｒｓｃａｎｎｅｄｃａｎｔｉｌｅｖｅｒａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪ．Ｌａｓｅｒ３．２００６．３３（１）：２６～３０杨金涛．徐文东．针，犬ｆＩ描原子力牡微镜的光点跟踪设计ＥＪ］．中国激光．２００６．３３（１）：２６～３０∽ＷｕＳｈｉｆａ．ＺｈａｎｇＪｉａｎ．ＰａｎＳｈｉｅｌａ１．．Ｐｈｏｔｏｎｓｃａｎｎｉｎｇｔｕｎｅｌｉｎｇｍｉｃｒｏｓｏｐｅｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉ，ｈａｔｏｍｉｃｆｏｒｅｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ［Ｊ］．Ａ‘’ｔａＯｐｔｕａＳｉｎｉｔａ．２００５．２５（８）：１０９９～１１０４吴ｆＩｔ法．章健．潘，ｒｉ等．原ｆ力‘ｊ光十ｆ描组合显微镜［Ｊ］。光学学报。２００５．２５（８）：１０９９～１１０４ｎＧ．Ｂｉｎｎｉｇ．Ｈ．Ｒｏｈｒｅｒ。Ｃｈ．Ｇｅｒｂｅｒｅｌａ１．．Ｓｕｒｆａｃｅｓｔｕｄｉｅｓｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｔｕｎｎｅｌｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，ｌ９８２，４９：５６～６０心Ｅ．Ｈ．Ｓｙｎｇｅ．Ａｓｕｇｇｅｓｔｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｔｅｎｄｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｔｏｔｈｅｕｌｔｒａ―ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｒｅｇｉｏｎＬＪｊ．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｍａｇ．．１９２８．６：３５６”Ｊ．Ｍｉ（?ｈａｅｌｉｓ．【’．Ｈｅｆｔｉｃｈ．Ｊ．Ｍｌｙｎｅｋｅｌａ１．．（）ｐｔｉｃａｌｍｋ∞＂ｏｐｙｕｓｉｎｇａｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ．２０００．４０５１３２５～３２７ＨＺｈｅｎｇＪｉａｎｙａ．ＹｕＸｉａｏｍｉｎｇ。ＺｈａｎｇＴｉａｎｈａｏｅｌａ１．．Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅｏｎｇｏｌｄｆｉｌｍｕｓｉｎｇｓｃａｎｎｉｎｇｎｅａｒ―ｆｉｅｌｄｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ａ（ｔａＯｐｔｉｔａＳｔｎｕ‘ａ．２００６．２６（８）：１２３６～１２３９郑建弧．ｊ：晓明．张天浩等．用ｆｌ描近场光学硅微镜技术研究仑膜表面等离了．体共振ｉＪ］．光学学报。２００６．２６（８）；１２３６～１２３９¨Ｉ。ｉｕ（’ｈｕｎｇ．ＹａｎＣｈａｎｇｃｈｕｎ。ＧａｏＳｈｕｍｅｉ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｇｌｅａｎｄｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃｉｍａｇｉｎｇｗｉｔｈｎｅａｒ―ｆｉｅｌｄｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．ＡｃｔａＯｐｔｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００６，２６（３）：４２５～４２９刘诚．ｆｑ长存．高淑梅．近场硅微ｆ：涉成像中的探测角度和偏振『ｎＪ题研究ｉＪｊ，光学学报．２００６．２６（３）；４２５～４２９¨ＸｕＴｉｅｊｕｎ。ＸｕＪｉｙｉｎｇ．ＷａｎｇＪｉａｅｌａ１．．Ｎｕｍｅｒｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｔｕｒｈａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｅｖａｎｅｓｃｅｎｔｆｉｅｌｄａｎｄｐｒｏｂｅｉｎｏｐｔｋ－ａｌｆｉｅｌｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙＳＮ（）Ｍ［Ｊ］，ＡｃｔｓＯｐｔｉｃａＳｉｎｉｔ“，２００５．２５（１）：１６５～４６９徐铁军．讷：，ｉ奖．Ｆ佳等．扣描近场光学显微镜探针１Ｊ光场相ｑ：作用的分析ｒｊ］．光学学报．２００５．２５（４）：４６５～４６９＂Ｄ．Ｔｏｏｍｒｅ．Ｄ．Ｊ．Ｍａｎｓｔｅｉｎ．ＬｉｇｈｔｉｎｇｔｉｐｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｗｉｔｈｅｖａｎｅｓｃｅｎｔｗａｖｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙＬＪ］．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉ０１．，２００１。１ｌ（７）：２９８～３０３埔Ｊ．Ｗ．Ｇｏｏｄｍａｎ．ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＦｏｕｒｉｅｒＯｐｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ！ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ。１９７６．１８～２３Ｊ．ｗ．顾德门．傅Ｌｔ！叶光学导沦［Ｍ］，北京：科学ｆｆｊ版社，１９７６。１８～２３珀Ｙ．Ｇａｒｉｎｉ，Ｂ．Ｊ．Ｖｅｒｍｏｌｃｎａｎｄ。Ｉ．Ｔ．Ｙｏｕｎｇ．Ｆｒｏｍｍｉｃｒｏｔｏｎａｎｏ：ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｈｉｇｈ―ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．（１ｕｒｒ．（）ｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｔｈｍｄ．．２（＿）０５，１６：３～１２加Ｉ，．Ｒａｙｌｅｉｇｈ．（）ｎｔｈｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅａｎｄｔｈｅｏｒｙｏｆｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ―ｇｒａｔｉｎｇｓ［Ｊｊ．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｍａｇ．。１８７４．４７：１９３肌Ｍ．Ｓｃｈｒａｄｅｒ．Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ．Ｈ．Ｔ．Ｍ．ＶａｎｄｅｒＶｏｏｒｔ．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｍｌｌｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈａ４Ｐｉ―ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｕｓｉｎｇｉｍａｇｅｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎＬＪ］．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，１９９８，８４：４０３３～４０４２毖Ｍ．Ｎａｇｏｒｎｉ．Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ．ＣｏｈｅｒｅｎｔｕｓｅｏｆｏｐｐｏｓｉｎｇｌｅｎｓｅｓｆｏｒａｘｉａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙＩ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｃｏｎｃｅｐｔｓ［Ｊ］．Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｔ＂．Ａｍ．Ａ，２００１，１８（１）：３６～４８船Ｍ．Ｎａｇｏｒｎｉ，Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ．Ｃｏｈｅｒｅｎｔｕｓｅｏｆｏｐｐｏｓｉｎｇｌｅｎｓｅ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　衍射极限1.13_物理_自然科学_专业资料。衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像...现在来说明一下倏逝场如何可以突破衍射极限,实现光子的空间局域的: 对 于给定... 　它是借助于某种能量与生物体的相互作用, 提取生物体...功能成像 等技术的应用, 使磁共振成像进一步突破了...一个薄层图像, 分辨率突破了 光学衍射极限,可达 10... 　因此,生物学研究迫切地需要“突破”衍射极限 的超高分辨率显微成像技术。 2 “...超高分辨率显微成像一般指在远场条件下基于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微... 　成为热门的研究领域, 并发展了突破衍射极限的超高分辨率荧光显微成像系 统[1]。...激光共聚焦显微镜是80 年代随着光学、视频、计算机等技术的飞速发展而 诞生的新... 　3. 突破光学衍射极限 前面的公式推导过程中,有两个隐含条件。 第一个隐含条件...超分辨显微成像,目前在生物学领域已经得到了广泛应用,因此,给三人颁发一 个... 　为了增强生物学家对于超分辨率荧光显微成像 (super-resolution...光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限...很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位.而当显... 　而研究使光学成像系 统突破衍射成像分辨率极限, 获得...荧光显微技术以及其他 各种频带展宽技术,实现成像分辨...扫描近场光学显 微镜由于对生物样品的灵敏度较低,... 　几个世纪以来, 光学显微镜的“衍射极限”一直被认为...新突破 超高分辨率荧光显微镜的应用 超分辨率荧光...投入实践 那些开始使用高分辨成像的生物学家的热情显...