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DNA Marker的实验室制备演讲稿-陶鹏飞
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基因定性检测方法及其标准化_李俊沈F伟武玉花吴刚
?研究报告?BIOTECHNOLOGY
BULLETIN生物技术通报2013年第12期Barnase基因定性PCR检测方法及其标准化李俊 沈F伟 武玉花 吴刚（中国农业科学研究院油料作物研究所
农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，武汉
430062）摘 要： Barnase基因编码核糖核酸酶，在基因工程育种中通常被用于创建雄性不育系。为了满足转barnase基因作物安全监管的需要，建立了barnase基因普通PCR、实时荧光PCR检测方法，具有良好的扩增特异性和检测灵敏度。barnase基因定性PCR检测方法经过了国内8家有资质的实验室的循环验证，结果表明该方法能够特异性检测样品中barnase基因，检测灵敏度均达到0.10%以上，且检测结果具有良好的重复性和重现性。符合标准方法检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求，为我国转barnase基因作物检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑。关键词： 转基因检测 Barnase基因 普通PCR 实时荧光PCR 循环验证Development and Standardization of Qualitative PCR DetectionMethod Targeting barnase Gene（Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan
430062）Abstract: Barnase gene, encoding a ribonuclease, is usually used for developing male sterility line in genetic engineering research. In order to meet the requirements of safety regulation of transgenic crops, the conventional PCR and real-time PCR detection methods targeting the barnase gene were developed, displaying exollent amplification specificity and test sensitivity. The qualitative methods targeting barnase gene were validated by 8 certified laboratories, results showed that this method could specifically detect the barnase gene from testing samples with satisfactory detection sensitivity of about 0.1%, fine repeatability and reproducibility, meeting the performance criteria of standard methods. This study established a suitable method for detection of the transgenic crops harboring the barnase gene, providing technical support for the safety management of transgenic crops in China.Key words: GMO detection Barnase gene Conventional PCR Real-time PCR ValidationLi Jun Shen Minwei Wu Yuhua Wu Gang随着转基因植物种植面积的增长，全球公众对于转基因植物及其产品的安全性倍加关注，为加强转基因生物的安全监管，保护消费者的知情权，全球已有50多个国家颁布实施了转基因生物标识制度［1］。为确保转基因生物标识制度的顺利实施，转基因生物及其产品检测方法的研究和标准化十分重要。在转基因产品检测过程中，PCR技术因其灵敏度高、重现性好等特性，应用最为广泛［2］。以PCR技术为基础的转基因检测，根据其检测特异性的高低分为筛选、基因特异性、构建特异性和转化体特异性检测4个层次［3，4］。其中转化体特异性检测方法特异性最高［5］，目前我国已经针对批准进口和在国内取得安全证书的转基因品种建立了完善的转化体特异性检测标准体系。但在检测工作中，只采用转化体特异性检测方法进行检测非常耗时耗力。为了提高检测效率，通常先采用筛选或基因特异性检测方法对样品进行初步的筛查检测，然后有针对性的采用转化体特异性检测方法对样品进行身份鉴定。因此，以转基因品种中的目的基因为检测靶标建立基因特异性检测标准，不仅会提高检测工作的效率，收稿日期： 基金项目：国家自然科学基金项目（），国家转基因生物新品种培育重大专项（-003）作者简介：李俊，女，硕士，研究实习员，研究方向：基因工程与转基因检测；E-mail：通讯作者：吴刚，男，博士，副研究员，研究方向：基因工程与转基因检测；E-mail：130生物技术通报 Biotechnology
Bulletin2013年第12期而且会进一步完善我国现行的标准体系。Barnase基因来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus ，编码区长330 bp，编码一种含amyloliquefaciens）110个氨基酸残基的核糖核酸酶［6］尚未建立barnase基因标准化的检测方法。本研究将以barnase基因作为检测靶标，建立特异性强、灵敏度高、重复性好的barnase基因定性PCR检测方法，并使其标准化，为监管转barnase基因作物服务。。这种小分子的RNA酶，在细胞中表达可以非特异性降解胞内RNA，产生强烈的细胞毒性，其在特异细胞中的表。Barnase基因这一达通常都会导致宿主细胞死亡［7］特性，已经在控制肿瘤细胞的再生以及病毒复制等。在植物研究领域，barnase基因最领域得到应用［8］为重要和最为成功的应用还是通过其在花粉绒毡层中的特异表达导致花粉败育，进而培育出转基因植物雄性不育系［9］。自从Mariani等［10，11］首次获得烟草和甘蓝型油菜雄性不育系植株之后，barnase基因在转基因育种中获得广泛应用，陆续有育种家将该基因转化到不同植物中并成功获得转基因雄性不育、白菜［13］、花椰菜和菊苣［14］等。性植株，如棉花［12］现在，通过组合使用转化barnase基因的雄性不育系、转barstar基因的育性恢复系和非转基因受体育性保。持系，已经成功实现了三系配套的杂交育种［15，16］例如，拜耳公司（Aventis CropScience）将barnase基因转化到油菜中，培育出了雄性不育转基因油菜MS1、MS8、Phy14、Phy23、Phy35和Phy36，并利用雄性不育系MS1和MS8培育出耐除草剂甘蓝型油菜杂交种MS1×RF1、MS1×RF2和MS8×RF3；另外，将barnase基因转化到玉米中，培育出玉米雄性不育品系MS3和MS6［17］；荷兰Bejo种子有限公司（Bejo Zaden BV）将barnase基因导入到菊苣（Cichorium intybus Chicory）中培育出了菊苣雄。目前，含有性不育系RM3-3、 RM3-4、RM3-6［18］barnase基因的转基因作物已经在多个国家被批准商业化种植和销售，如商业化的转基因杂交油菜品种。MS1×RF1、MS1×RF2和MS8×RF3［9］国内的一些研发者将barnase基因转化到黑杨、西瓜、玉米、水稻及甘蓝等植物中，获得了育性改。Barnase基因在三系配套育变的转基因植物［19-24］种中应用潜力巨大，研制标准化的barnase基因检测方法，可有效监管转barnase基因的转基因作物。潘良文等［25，26］为检测抗草丁膦油菜籽，初步研究了barnase基因的检测方法，但未考察该方法的扩增特异性及检测灵敏度等参数。迄今为止，国内外1 材料与方法1.1 材料转基因材料种子粉末均由农业部科技发展中心提供，包括转基因油菜MS1、MS8、RT73、RF1、RF3、OXY235、Topas19/2和T45；转基因棉花Mon531、Mon1445和Mon88913；转基因玉米Mon88077，Bt176、Mon863和GA21；转基因大豆Mon89788、A2704-12和GTS-40-3-2；转基因水稻科丰6号和TT51-1。非转基因玉米苏玉糯1号，非转基因油菜中油821，非转基因棉花中棉35，非转基因大豆中豆29，非转基因水稻明恢63均由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 植物基因组DNA提取 用QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit（No.69104，Qiagen，Germany）试剂盒提取种子粉末基因组DNA，具体操作步骤详见说明书。提取的DNA用超微量分光光度计NanoDrop 2000（Thermo，USA）检测纯度和浓度。1.2.2 PCR反应体系及反应条件 普通PCR：根据barnase基因的核苷酸序列，用Primer Premier 5.0设计正向、反向普通PCR引物各5条（表1），并委托上海生工生物技术公司合成。以转基因油菜MS8质量百分含量为0.5%的油菜基因组DNA为模板，将表1中的正向引物和反向引物进行两两组合，进行PCR 扩增，每个反应设置2个重复，筛选扩增条带最亮、重现性最好的引物组合。普通PCR反应体系：50 ng 基因组DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25.0 mmol/L MgCl2 1.8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L primer 0.5 μL，1 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL，加ddH2O至总反应体积为25 μL。普通PCR反应条件为94℃变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35次循环；72℃延伸7 min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，根据电泳结果筛选出最佳扩增引物组合。设置不同的Mg2+浓度、退火温度梯度优化反应体系，确定普通PCR最李俊等：Barnase基因定性PCR检测方法及其标准化佳反应体系和反应条件。PCR反应体系中，Mg2+浓度尤为重要，直接影响引物的扩增特异性，以及酶［27］。本研究设置1.5、1.6、1.8、2.0 的催化能力的准确性0.5%转基因油菜MS8；（2）阴性对照，非转基因油菜中双9号；（3）特异性测试样品：1%转基因油菜MS8，1%转基因油菜MS1，转基因混合样（转基因油菜GT73、T45、RF1，转基因水稻TT51，转基因大豆GTS-40-3-2，转基因玉米MON810和转基因棉花MON1445混合，每个转化体质量分数为1%），非转基因混合样（非转基因油菜、水稻、高粱、大麦、黑麦、棉花、玉米、大豆，各1个品种等量混合）；（4）普通PCR方法灵敏度测试样品，0.4%转基因油菜MS8；（5）实时荧光PCR方法灵敏度测试样品，0.05%转基因油菜MS8；（6）加工品测试样品，用转基因油菜MS8与非转基因水稻、玉米、大豆混合后制成MS8质量分数为5%的样品，在高压灭菌锅中高温高压处理10 min。mmol/L 4 个Mg2+浓度梯度进行PCR分析。在PCR反应条件中以退火温度（Tm）最为重要，在Tm 值允许的范围内，适当提高反应的退火温度可使PCR产物的特异性增强［27］。根据引物设计时设置的Tm值范围，共设计了52℃、54℃、56℃、58℃、60℃ 5个退火温度，进行PCR分析。实时荧光PCR：用Beacon Designer 2.0设计实时荧光PCR引物和探针序列（表1），并委托上海生工生物技术公司合成。实时荧光PCR反应体系：50 ng基因组DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，25.0 mmol/L MgCl2 2.4 μL，10 mmol/L dNTPs 0.6 μL，10 μmol/L primer 0.4 μL，10 μmol/L probe 0.2 μL，5 U/μLSH Taq DNA 聚合酶 0.16 μL，加ddH2O至总反应体积为20 μL。实时荧光PCR反应程序为95℃、3 min；95℃、15 s，60℃、1 min，循环数45；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号。表1 引物及碱基组成目标定性PCR检测引物名称Barnase-F1Barnase-F2Barnase-F3Barnase-F4Barnase-F5Barnase-R1Barnase-R2Barnase-R3Barnase-R4Barnase-R5qBarnase-F引物序列（5'-3'）TGACGGGGTTGCGGATTATCTAAATCAGAAGCACAAGCCCTCACGGGGTTGCGGATTATCTGGTTGCGGATTATCTTCAGGGGGTTGCGGATTATCTTCTAAAGGTCTGATAATGGTCCGTTTTGTAAATCAGCCAGTCGCGGGAGTTTGCCTTCCCTGTTTATCAGCCAGTCGCTTGAGTAACCGTTGTTTTGTAAATCAGCCAATCAGAAGCACAAGCCCTCG
2 结果2.1 检测靶标序列的确定将barnase基因的编码序列（GenBank Accession No. M14442.1）在NCBI数据库中进行Blast检索，发现该序列与数据库中登记的所有序列完全同源（100% identity），但构建到载体上的序列均少了5'端信号肽序列；分析转基因油菜MS1、MS8中的barnase基因序列发现，转基因油菜中barnase基因序列同样在5'端少了信号肽序列，但序列完全相同。因此本研究确定将不包含5'端信号肽序列的336 bp的序列作为barnase基因的检测靶标（图1）。2.2 Barnase基因普通PCR方法的建立用25个引物组合，以转基因油菜MS8质量百分含量为0.5%的油菜基因组DNA为模板，对每个反应进行两次重复，barnase基因进行PCR扩增，选择重现性好、特异性高、扩增条带最清晰的引物组合。根据电泳结果（图2），初步筛选出了5个引物组合：Barnase-F4/R2、Barnase-F4/R3、Barnase-F5/R2、Barnase-F5/R3、Barnase-F5/R5，扩增产物大小均在150-300 bp之间。为了进一步筛选出最佳引物组合，用非转基因油菜的基因组DNA梯度稀释转基因油菜MS8的基因组DNA，稀释后的MS8基因组DNA的质量分数分别为10%、1%、0.5%、0.25%和0%。以梯度稀释的基因组DNA作模板，用筛选出5个引物组合分实时荧光PCR检测qBarnase-F1ATCAGAAGCACAAGCCCTCGqBarnase-F2CAAAATCAGAAGCACAAGCCCTCqBarnase-RAGTTTGCCTTCCCTGTTTGAGAAqBarnase-R1GAGTTTGCCTTCCCTGTTTGAGqBarnase-R2GGAGTTTGCCTTCCCTGTTTGqBarnase-PFAM-TGTCTCCGCCGATGCTTTTC-CCCG-BHQ11.2.3 循环验证试验 邀请国内有资质的8家实验室，采用本研究建立的普通PCR和实时荧光PCR方法对统一制备的样品进行检测：（1）阳性对照，
132生物技术通报 Biotechnology
Bulletin2013年第12期图1 Barnase 基因定性PCR引物位置图，箭头代表最佳引物的设计位置和方向好，当DNA模板浓度低至0.25%时，依然有清晰的扩增条带，扩增产物277 bp；而其他的引物组合的扩增灵敏度只能达到0.5%或1%，而且重现性较差。为获得Barnase-F/R引物对最佳反应体系，分别对Mg2+浓度、退火温度进行比较优化。PCR检测结果表明引物组合Barnase-F5/R5在4个Mg2+浓度梯度下，均有良好的扩增，而且扩增结果没有差异（图4-A）。因此反应体系中采用终浓度为1.8 mmol/LM：DL2000 Marker（TaKaRa）；1：Barnase-F1/R1；2：Barnase-F1/R2；3：Barnase-F1/R3；4：Barnase-F1/R4；5：Barnase-F1/R5；6：Barnase-F2/R1；7：Barnase-F2/R2；8：Barnase-F2/R3；9：Barnase-F2/R4；10：Barnase-F2/R5；11：Barnase-F3/R1；12：Barnase-F3/R2；13：Barnase-F3/R3；14：Barnase-F3/R4；15：Barnase-F3/R5；16：BarnaseF4/R1；17：Barnase-F4/R2；18：Barnase-F4/R3；19：Barnase-F4/R4；20：Barnase-F4/R5；21：Barnase-F5/R1；22：Barnase-F5/R2；23：Barnase-F5/R3；24：Barnase-F5/R4；25：Barnase-F5/R5；共有25个引物组合，每个引物组合设置2个平行Mg2+浓度。在5个退火温度下均能检测出barnase基因，而且在不同的退火温度下，扩增结果没有显著差异，因此选用58℃退火。图2 Barnase基因引物初步筛选别进行PCR扩增，设置两个平行，考察这5个引物组合的扩增灵敏度。凝胶电泳结果（图3）表明引物组合Barnase-F5/R5的扩增灵敏度最高，重现性最A：Mg2+浓度的优化，M：marker DL2000（TaKaRa））；1，2：1.5 mmol /L；3，4：1.6 mmol/L；5，6：1.8 mmol/L；7，8：2.00 mmol/L；B：退火温度的优化；M：marker DL2000（TaKaRa）；1，2：52℃；3，4：54℃；5，6：56℃；7，8：58℃；9，10：60℃图4 Barnase基因检测体系的优化利用梯度稀释的MS8 基因组DNA做模板，测试barnase基因候选引物组合的灵敏度，每个模板设置2个平行。1-5分别对应质量分数为10%、1%、0.5%、0.25%和0%的MS8基因组DNA；A-E分别对应引物组合BarnaseF4/R2、BarnaseF4/R3、BarnaseF5/R2、BarnaseF5/R3和BarnaseF5/R52.3 Barnase基因实时荧光PCR方法的建立在barnase基因的靶标序列上设计探针qBarnase-P，然后在探针序列的两侧分别设计3条正向引物和3条反向引物。将3条正向引物和3条反向引物图3 Barnase基因候选引物组合灵敏度测试
2013年第12期李俊等：Barnase基因定性PCR检测方法及其标准化133两两配对组合9对引物，分别与探针qBarnase-P组合，以0.5 ng的MS8基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个反应设置两个平行。根据扩增曲线，筛选出在相同条件下扩增信号最强的引物探针组合。结果（图5）显示，引物/探针组合qBarnase-F/qBarnase-R/qBarnase-P与其他组合相比，扩增信号最强，且 重复性良好。因此将引物/探针组合qBarnase-F/qBarnase-R/qBarnase-P用于barnase基因的实时荧光PCR检测。M：marker DL2000（TaKaRa）；1，2：MS1；3，4：MS8；5，6：转基因油菜混样（RT73、RF1、RF3、OXY235，Topas，T45）；7，8：5大作物非转基因作物混样（玉米、大豆、棉花、油菜和水稻）；9，10：转基因棉花混样（Mon531、Mon1445、Mon88913）；11，12：转基因玉米混样（Mon88077，Bt176、Mon863、GA21）；13，14：转基因大豆混样（Mon89788、A2704-12、GTS-40-3-2）；15，16：转基因水稻混样（科丰6号和TT51-1）图6 Barnase基因普通PCR检测方法特异性检测片段。转化barnase基因的转基因植物由于纯合致死，在繁殖过程中，必须用非转基因植株与其杂交才能保留转基因的种子，因此收获的种子中转基因成分的含量为25%（1/4）。本研究中转基因油菜MS8中barnase基因的检出下限是0.25%，相当于0.05%的图5 B arnase基因实时荧光定量PCR方法引物/探针组合筛选纯合体，符合定性PCR方法对检测灵敏度的要求（0.1%）。将barnase基因普通PCR方法的相对检出下限定为4 g/kg（相当于0.1%的纯合体）。2.4 Barnase基因检测方法的验证2.4.1 普通PCR 特异性检测：分别以转基因油菜MS1，转基因油菜MS8，转基因油菜混样（RT73、RF1、RF3、OXY235，Topas，T45），5大非转基因作物混样（玉米、大豆、棉花、油菜和水稻），转基因棉花混样（Mon531、Mon1445、Mon88913），转基因玉米混样（Mon88077，Bt176、Mon863、GA21），转基因大豆混样（Mon89788、A2704-12、GTS-40-3-2）和转基因水稻混样（科丰6号和TT51-1）共8份基因组DNA作为PCR扩增的模板，进行PCR扩增。扩增结果（图6）显示，转基因油菜MS1和MS8中均扩增出单一清晰的条带，而其他6份混样均无扩增，表明引物组合Barnase-F5/R5能从测试样品中特异性的检测出barnase基因。灵敏度检测：用非转基因油菜的基因组DNA梯度稀释转基因油菜MS8的基因组DNA，梯度稀释样品的质量分数依次为10%、2%、1%、0. 5%、0. 25%和0%。用梯度稀释的DNA进行PCR扩增，结果（图7）表明，在质量分数为0.25%以上的样品中均能特异性地扩增到barnase基因的预期DNA每个模板设4次平行。M：marker DL2000（TaKaRa）；1-4：MS8 质量分数为10%；5-8：MS8质量分数为2%；9-12：MS8质量分数为1%；13-16：MS8质量分数为0.5%；17-20：MS8质量分数为0. 25%；21-24：MS8质量分数为0%图7 Barnase基因普通PCR检测方法灵敏度检测加工品检测：将MS1油菜籽与大豆、玉米和水稻混合，油菜籽的质量百分比分别为1%和2%。将混好的样品放在高压灭菌锅中在121℃、0.2 MPa下灭菌25 min，以模拟加工品的加工过程。然后将高温高压处理过的样品进行研磨并提取基因组DNA。以提取的基因组DNA做模板，用普通PCR引物进行PCR扩增，每个样品设4个平行。扩增结果（图8）显示，2%的样品有3个平行反应有扩增，1%的样品4个平行反应均有扩增。表明引物组合
134生物技术通报 Biotechnology
Bulletin2013年第12期BarnaseF/R能够稳定地检测深加工产品中的barnase基因。及以上的样品中均有明显的扩增曲线，表明该检测方法的检测灵敏度达到0.25 g/kg，符合定性PCR方法对检测灵敏度的要求（0.1%）。根据检测结果，将barnase基因实时荧光PCR方法的相对检测下限定为0.5 g/kg。M：marker DL2000（TaKaRa）；1-4：2% MS1 加工品的4个平行；5-8：1% MS1加工品的4个平行.图8 Barnase基因普通PCR检测方法加工品测试2.4.2 实时荧光PCR
特异性检测：用引物/探针组合qBarnase-F/qBarnase-R/qBarnase-P扩增转基因油菜MS1，转基因油菜MS8，转基因油菜混样（RT73、Rf1、Rf3、OXY235，Topas，T45），5大作物混样（玉米、大豆、棉花、油菜和水稻），转基因棉花混样（Mon531、Mon1445、Mon88913），转基因玉米混样（Mon88077，Bt176、Mon863、GA21），转基因大豆混样（Mon89788、A2704-12、GTS-40-3-2）和转基因水稻混样（科丰6号和TT51-1）共8份样品的基因组DNA，每个样品设置3个平行。扩增结果（图9）显示，转基因油菜MS1和MS8的3个平行PCR反应均有明显的扩增曲线，而其他6份混样均无扩增曲线，表明实时荧光PCR 反应的引物/探针组合能特异性的检测出barnase基因。图10 Barnase基因实时荧光PCR检测方法灵敏度检测加工品检测：用实时荧光PCR方法扩增高温高压处理样品的基因组DNA，这两份样品中MS1基因组DNA的质量百分比分别为1%和2%，每个反应设置4个平行。扩增结果（图11）显示，两个样品均有barnase基因的扩增曲线。表明实时荧光PCR引物探针组合能够稳定的检测深加工产品中的barnase基因。图11 Barnase基因普通PCR检测方法加工品测试2.5 Barnase基因检测方法循环验证普通PCR方法：在特异性检测中，8家验证单图9 Barnase基因实时荧光PCR检测方法特异性检测位只从油菜样品MS1、MS8中检测出预期DNA片段，其他样品中未检测出预期DNA片段，表明本研究建立的barnase基因普通PCR检测方法具有良好的扩增特异性；灵敏度检测中，8家单位在0.4%的转基因油菜MS8样品中均能检测出预期DNA片段，表明barnase基因的普通PCR检测方法符合灵敏度要求；加工品测试中，6家验证单位在MS8油菜加工灵敏度检测：用超纯水梯度稀释转基因油菜MS8的基因组DNA，浓度依次为5、0.5、0.05、0.025和0 ng。用梯度稀释的基因组DNA作模板进行实时荧光PCR扩增，每个反应设置3个平行。结果（图10）表明，在MS8基因组DNA模板浓度为0.025 ng李俊等：Barnase基因定性PCR检测方法及其标准化品中检出预期DNA片段，两家单位在MS8油菜加工品中未检出预期DNA片段，表明barnase基因的普通PCR检测方法适用于油菜加工品的测试。实时荧光PCR方法：特异性检测中，8家验证单位在检测特异性测试样品时，只在油菜样品MS1和MS8中有明显的扩增曲线，且Ct值小于40，其它样品中没有明显的扩增曲线，表明barnase基因的实时荧光PCR检测方法具有很高的特异性；灵敏度检测中，8家单位在0.05%及以上含量的转基因油菜MS8样品中均有明显的扩增曲线，且Ct值小于40，表明barnase基因的实时荧光PCR检测方法的灵敏度符合要求；加工品测试中，8家单位在MS8油菜加工品中均有明显的扩增信号，表明barnase基因的实时荧光PCR检测方法可用于加工品的检测。8家验证单位的特异性检测结果和灵敏度测试结果非常吻合，表明研制的barnase基因定性PCR检测方法具有良好的重复性和重现性，而且适用于加工品的检测。适用性进行了分析，分析结果满足标准方法的要求，从而初步建立了barnase基因普通PCR检测方法。此外本研究还建立了barnase基因的实时荧光PCR方法，进行特异性、灵敏度、加工品检测测试，测试结果符合标准方法的要求。最后，邀请8家国内具有资质的实验室对本研究建立的方法进行循环验证，循环验证结果表明，本研究建立的barnase基因普通、实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，具有合理性、准确性、可操作性的优点，因此本研究建立的定性、定量PCR方法可以作为检测转Barnase基因的标准方法。在基因工程育种中，雄性不育barnase基因通常与育性恢复基因Barstar配对使用，建议在实际检测中将barnase基因检测方法与barstar基因检测方法组合采用。4 结论通过引物组合筛选、PCR反应条件和反应体系优化、特异性分析、灵敏度测试、加工品检测等实验，建立了barnase基因定性PCR检测方法。该检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，具有合理性、准确性等优点，可以作为检测barnase基因的标准方法，为监测转barnase基因作物服务。 致谢：农业部科技发展中心基因检定处组织了本方法的循环验证，农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（上海市农业科学院）、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（天津市农业科学院）、农业部转基因生物生态环境安全监督检验测试中心（农业部环境保护科研监测所）、 农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（中国农业科学院植物保护研究所）、农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心（中国农业科学院生物技术研究所）、农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心（浙江省农业科学院）、农业部转基因动物及饲料安全监督检验测试中心（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所）、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（吉林省农业科学院）共8家第三方检测机构参加了本方法的循环验证试验，特此致谢。3 讨论转基因生物安全监管工作中，通常以常用的调控元件和目的基因作为筛查检测的靶标，筛查检测能够大大提高检测效率。基因特异性PCR检测以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段，目前已建立了多种外源目的基因的特异性PCR检测方法，如bar、PAT和CP4-EPSPS等基因［28］。前期，曾有barnase基因定性PCR检测方法和定量PCR检，但先前建立的barnase基因测方法的报道［25，26］PCR检测方法未对其检测特异性、灵敏度、重复性等参数进行系统考察。本研究展现了研制barnase基因检测标准的完整过程。首先以缺少5'端信号肽序列的336 bp的barnase基因序列为检测靶标，设计不同正向引物和反向引物，将正、反向引物两两组合进行PCR 扩增，筛选出最佳引物组合BarnaseF/BarnaseR；然后优化了最佳引物的PCR反应条件如Mg2+、退火温度，最终确定了最佳引物对、最适反应体系及反应条件。然后，采用优化的反应条件，对引物对BarnaseF/BarnaseR的扩增特异性、灵敏度和重复性、136参 考 文 献生物技术通报 Biotechnology
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