医学微生物学与免疫学重点
1、微生物分类：真核细胞性微生物、原核细胞性微生物、非细胞性微生物。
2、细菌以微米作为计量单位、外形分为球形、杆形、螺形三种基本形态。
3、P9革兰氏阳性菌与阴性菌细菌细胞壁结构比较
4、细菌特殊结构特点与致病性的关系：荚膜：某些细菌在生长繁殖过程中能合成并向细胞壁外分泌一层疏松透明的粘液状物质，称粘液层。如粘液层较厚具有一定外形称荚膜。偶家莫的细菌在固体培养上形成光滑型菌落（S)，市区荚膜后菌落变为粗糙型(R)。在动物体内能保护细菌体抵抗吞噬细胞的吞噬和消化作用，因而和细菌的毒力有关并能是细菌对干燥和其他因素的侵害具有一定的抵抗力。鞭毛：鞭毛是身处于菌体表面细长弯曲的蛋白质丝状物，是细胞的运动器官。鞭毛可能有粘附作用，黏附于细菌表面，产生毒物导致病变。菌毛：分为普通菌毛和性菌毛。普通菌毛是细菌的粘附器官，具有粘附于诉诸细菌膜表面的能力，构成细菌感染的第一步，孤军冒雨细菌的致病力有重要关系。性菌毛：带有性菌毛的细菌具有致孕性。两菌通过性菌毛相互结合，传递某些遗传物质，使磁性菌获得雄性菌的某些特性。细菌的抗药性，某些菌的毒力因子，致育因子等可通过此种方式转移，这是某些肠道细菌易产生抗药性的原因之一。芽孢：革兰氏阳性菌产生，是细菌的休眠状态。医疗实践上以杀灭芽胞作为消毒灭菌是否彻底的指标，最有效的杀灭方法是高压蒸汽杀菌法。格兰染色的方法：初染、媒染、脱色、复染。结果：紫色为阳性，红色为阴性。
5、细菌的生物氧化方式不同，可将细菌分为三类：专性需氧菌：此类细菌具有完善的呼吸酶系统，需要分子氧作为受氢体，在无游离氧的环境下不能生长。转型厌氧菌：此类细菌缺乏完善的呼吸系统，只能进行无氧发酵。兼性厌氧菌：兼性厌氧菌兼有需氧呼吸和发酵两种酶系统，在有氧和无氧环境中都能生长繁殖，有氧生长好。
6、热原质：许多细菌能合成一种物质，注入人体或动物体能引起发热反应。
7、细菌在人工培养基的生长现象：（1）在液体培养基的生长现象：大多数呈现浑浊状态；少数如链状排列的细菌呈沉淀生长；专性需氧菌如枯草杆菌等在液面形成菌膜，液体澄清。（2）固体培养基：将细菌划线接种在固体培养基表面，经过一段时间，单个细菌即可繁殖成肉眼可见的细菌集团，称为菌落。各种细菌在平板培养基上形成的菌落这有特征，有助于鉴别细菌。（3）半固体培养基：细菌穿刺接种。若细菌有鞭毛，能运动，则呈羽毛状或云雾状浑浊生长，穿刺线模糊不清。无鞭毛的细菌，不能运动，仅沿穿刺线呈线性生长，周围培养基澄清透明、半固体培养基也用来检查细菌的动力。
8、正常为生物群的生理作用：（1）屏障作用：正常微生物群在人体内可形成一个天然的生物屏障，阻止病源微生物对人体的粘附、增殖和侵入。（2）营养代谢：正常为生物群可参与内德各种营养物质、胆酸、胆固醇及激素等地代谢、转化与合成；协助机体对各种营养物质的消化和吸收。（3）免疫效应：正常微生物群不断刺激机体免疫系统，引起免疫应答，并通过隐性感染而获得一定的免疫力，从而限制了其本身及类属微生物的有害作用。（4）解毒作用：肠道内正常寄生的微生物群，特别是双歧杆菌、乳杆菌等，可将大肠内种亚硝酸胺类的有害物质，讲解为仲胺和亚硝酸盐，从而避免这类物质的致癌作用。
9、条件致病菌：平时不致病，但在一定条件影响下而引起疾病的细菌称为条件致病菌。
10、消毒：是指杀灭物体上的病原微生物的方法。灭菌：是指杀灭物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物，细菌的繁殖体和芽胞）的方法。防腐：是指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。无菌：无菌是指物体中没有任何活的微生物存在。凡事经过灭菌的物品都是无菌的。防止微生物进入人体或其他物体上的操作方法称为无菌操作。
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细菌与真菌学实验
2、掌握平板、斜面、液体和半固体培养基等接种方法。3、掌握细菌在液体、固体、半固体培养基中生长现象和意义。 一 细菌的接种技术 【材料】 1、菌种：葡萄球菌和大肠埃希菌混合液、痢疾志贺菌、枯草芽胞杆菌、链球菌。 2、培养基：液体(肉汤)、半固体、固体(琼脂平板和斜面)培养基。 3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。 【方法】 1、平板划线接种法： 主要用于临床标本中混杂着多种细菌的分离培养，经过划线接种，将细菌分散到固体培养基的表面，以获得单个菌落。常用的平板划线接种法可分为以下两种： （1）分区划线法 图2-4-1分区划线法 注意事项： 此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁、痰液等标本的细菌分离培养。 具体操作如下： 1）右手以持毛笔式握住接种环，垂直在火焰上烧灼灭菌。 2）待接种环冷却后，取葡萄球菌和大肠埃希菌混合液一环。 3）左手持平板培养基，左手拇指、食指开启平皿盖，右手将取菌后的接种环在平板培养基表面一角来回划线涂布，密而不重叠，接种环与培养基表面呈30～45o角度，作为第一区，约占平板总表面积的1/5。 划线时，以腕力在平板表面作 轻快的滑动动作，不可用力太大，以免划破培养基表面，并注意无菌操作，防止空气中微生物的污染。 4）再次烧灼接种环，以杀灭接 种环上剩余的细菌，待冷。 将平皿转动一定角度进行第2区划线，第2区划线与第1区划线开始相交2～3条，以后可不必相交。约占平板表面积的1/4。再灭菌接种环后用相同方法进行第3区、第4区划线。
5）种完毕，烧灼接种环，放回原处，平板底部做好标记（姓标本名称等），倒置（平板底部向温箱中培养18～24h，观察结果（图名、日期、上）于37℃2-4－1）。 ①严格无菌操作：操作时不能说话，不能离酒精灯太远，平皿盖不能开得太大，以免空气污染； ②划线时，力量要适中，切勿划破培养基表面； ③充分利用平板表面，但第四区不能与第一区划线相交。 （2）连续划线法
图2－4-2连续划线法 连续划线法又称平行划线法，此法多用于含菌量不多的标本或咽拭、棉拭的细菌分离培养。 具体操作如下： 1）将接种环在火焰上烧灼灭菌。 2）待接种环冷却后，以无菌操作取标本或少许菌液，涂布于培养基的1/5处， 3）然后在培养基表面连续左右划曲线，密而不重叠，并逐渐下移，将整个平板布满曲线。 4）接种完毕，烧灼接种环，放回原处。平板底部做好标记（姓名、日期、标本名称等），平板底部向上于37℃温箱中培养18～24h，观察结果（图2－4－2）。 2、斜面培养基接种法:
图2－4-3斜面培养基接种法 主要用于纯培养、保存菌种及生化反应试验等。通常是从平板培养物上调取某一单个菌落，移种至斜面培养基上。 （1）左手持平板培养基（或同时持菌种管和接种管，见图2－4－3），右手持接种环或接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷后挑取单个菌落。 （2）左手换取待接种的斜面培养基，斜面部向上，以右手手掌与小指拔取并夹持试管塞，管口通过火焰灭菌。 （3）将取菌后的接种环（针）伸入斜 面管内，先从斜面底部到顶部划一条直线，然后再从斜面底部由下而上做蛇形划线。接种环（针）进出试管时，均不应触及试管口内壁。
（4）将试管口和接种环（针）灭菌后放好，塞上试管塞。 （5）注明标记，置37℃温箱培养18～24h后观察生长情况。 3、液体培养基接种法： 主要用于增菌培养和生化反应试验。 （1）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的肉汤管。 （2）接种环灭菌冷却后，分别从菌种管（大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌）挑取少量菌苔或菌落移种到肉汤管中。在接近菌面上方的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤与之调和，使细菌混合于肉汤中。 （3）灭菌试管口和接种环，加塞、标记，置37℃温箱培养18～24h后观察生长结果。大肠埃希菌可出现均匀混浊生长；链球菌可出现沉淀生长；枯草芽胞杆菌为表面生长，形成菌膜。 图2－4－4液体（左）及半固体（右）培养基接种法 4、半固体培养基接种法： 主要用于检查细菌的动力和保存菌种。 （1）同液体培养基接种法，左手握住菌种管与待接种的半固体培养基。 （2）右手持接种针灭菌冷却后，挑取接种管少量大肠埃希菌或痢疾志贺菌菌苔，垂直刺入半固体培养基的中央，深入管底至3/4处（不必穿至管底），随即沿原穿刺线退出。 （3）试管口灭菌后加塞，注明标记，置37℃温箱培养18～24h后观察结果（图2－4－4右）。有鞭毛的细菌（如大肠埃希菌）能够沿穿刺线向四周扩散生长，为动力实验阳性；而无鞭毛的细菌（如痢疾志贺菌）只能够沿穿刺线生长，为动力实验阴性。 二 细菌的培养技术 【材料】 1、器材：温箱、磨口玻璃干燥器、厌氧培养箱、厌氧袋或厌氧罐、二氧化碳培养箱等。 2、试剂：重碳酸钠、盐酸、焦性没食子酸等。 【方法】 常用的细菌培养方法可分为四类，即普通培养法、二氧化碳培养法、厌氧培养法和微需氧培养法。
1、普通培养法 用于无须特殊要求的需氧菌和兼性厌氧菌的培养。 是指需氧菌和兼性厌氧菌在有氧条件下的培养方法。将已接种细菌的琼脂平板、斜面、半固体或液体培养基等，在空气中置于37℃温箱，培养18～24h，观察细菌的生长情况。一般细菌培养18～24h后即可出现生长迹象，但若标本中的细菌量少或为生长缓慢的细菌(如分枝杆菌)，需培养3～7天，甚至4～8周后才能观察到生长迹象。 2、二氧化碳培养法 用于肺炎链球菌、奈瑟菌属、布鲁菌属和流感嗜血杆菌等的培养。 是将已接种细菌的培养基置于5％～10％CO2环境中进行培养的方法。某些细菌特别是在初次分离时，需要在5％～10％CO2环境中培养才能生长良好。常用的二氧化碳培养法有以下三种。 图2－4－5烛缸法 （1）烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放人缸中，再放人蜡烛并点燃之，加盖密封。随燃烧产生的CO2增加，蜡烛自行熄灭，此时缸内CO2的浓度约为5％～10％，然后放置37℃温箱培养。 （2）化学法(重碳酸钠―盐酸法)：每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按0.4g与0.35m1比例，分别将两种试剂各置于一容器内（如平皿内），连同容器放置于标本缸或干燥器内，盖紧盖后倾斜容器，使盐酸与重碳酸钠接触而产生CO2。 （3）二氧化碳培养箱：能自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度，培养物置培养箱内，培养一定时间后能直接观察生长情况，使用较为方便，但价格较昂贵。 3、厌氧培养法： 用于专性厌氧菌的培养。必须将培养环境或培养基中的氧气除去，或造成低氧化还原电势的厌氧环境，以利于专性厌氧菌生长。 常用的方法有：肉渣（庖肉）培养法、焦性没食子酸法（见厌氧菌）、厌氧罐培养法、厌氧袋培养法及需氧菌共生厌氧法等（略）。 三 细菌生长现象观察 【材料】 1、菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌(无毒株)、痢疾志贺菌、大肠埃希菌。 2、培养基：固体培养基（普通琼脂平板和斜面）、半固体培养基、肉膏汤、血液琼脂培养基。
【方法】 1、接种细菌： （1）将金黄色葡萄球菌、炭疽芽胞杆菌(无毒株)分别用分区划线法，接种于普通琼脂平板和血液琼脂培养基，将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接种普通琼脂斜面。 （2）将枯草芽胞杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌分别接种于肉膏汤培养基。 （3）将痢疾志贺菌和大肠埃希菌分别用穿刺法接种于半固体培养基。
2、将上述接种细菌的培养基送37℃温箱培养18～24h。 3、观察细菌的生长现象： （1）液体培养基：均匀混浊生长（葡萄球菌）、沉淀生长（链球菌）、菌膜形成（枯草芽胞杆菌或铜绿假单胞菌）。观察细菌在其中生长时，应注意观察液体培养基的透明度，管底是否有沉淀，表面是否有菌膜。 （2）固体培养基：形成菌落和菌苔。观察菌落的大小、形状、突起（扁平、凹陷）、湿润度（湿润或干燥）、透明度（透明、半透明、不透明）、表面（光滑、粗糙、有无光泽）、边缘、颜色、溶血环、粘度及气味等情况。比较金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌(无毒株)的菌落特点。 （3）半固体培养基： 用于观察细菌有无动力。有鞭毛的细菌（如大肠埃希菌），动力阳性，沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线模糊、增粗或呈根须状，培养基变混浊。无鞭毛的细菌（如痢疾志贺菌），动力阴性，沿穿刺线生长，穿刺线清晰，周围培养基透明。 【思考题】 1、以上几种接种培养细菌的方法，各有何用途? 2、如何识别琼脂平板培养基上出现的菌落是种上去的，还是杂菌污染的? 实验五 细菌的生化反应 【目的】 1、了解细菌各种生化反应的原理、方法、步骤、结果判断及用途。 2、要求熟悉常见细菌生化反应试验的名称。
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