[植物基因组DNA及总RNA提取技术]&幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，核较大而胞质较少，核酸浓度高，且内含物少、次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS或&CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取的DNA、RNA的产量高，纯度好。提取DNA所&[植物&DNA&RNA&幼嫩&提取&氯仿&灭菌&乙醇]
幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，核较大而胞质较少，核酸浓度高，且内含物少、次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在或 CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取的DNA、RNA的产量高，纯度好。提取DNA所用的提取液、、等需要高压灭菌以灭活DNase。RNase存在于所有的生物中，并且耐沸腾、蒸煮，所以在提取RNA的过程中要防止rna酶污染，用具如、、水、药品等都要经RNase的抑制剂DEPC处理，即每100mL溶液中加入0.1～0.2 mL DEPC溶液，37℃过夜，然后高压灭菌20 min以灭活DEPC。由于RNA容易降解，所有的提取步骤都在冰浴中进行。DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB作为一种，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA（RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准确。本实验介绍植物DNA、RNA提取及检测的方法步骤。一、试材及用具试材:植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根）。仪器、用具:、离心管、紫外、微量、吸头、吸水纸、锅、冰箱、、液氮罐、、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、、电泳槽等。需配置的药品和:提取DNA（CTAB法）: 2% CTAB(W/V),100 mmol/L -HCI pH 8.0, 20 mmol/L
pH 8.0, 1.4 mol·L-1 NaCl，2% PVP (灭菌后加入2% PVP ，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）?-巯基乙醇。CTAB提取RNA缓冲液为：2% CTAB(W/V)，2% PVP(W/V)，25 mmol/L ，100 mmol·L-1 -Cl pH 8.0，2.0 mol·L-1 NaCl， 0.5 g·L-1 Spermidine（亚精胺）。灭菌后加入2%（V/V）?-巯基乙醇。SSTE buffer为：1.0 mol/L NaCl，0.5%，10 mmol/LTris-Cl pH 8.0，1 mmol/L EDTA。TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0，再用水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。5× RNA电泳缓冲液的配制：依次加入以下成分: 10.46 g
、1.7 g乙酸钠，0.93 g EDTA，调pH 7.0，定容到500 mL。RNA 加样缓冲液:1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油，高压灭菌。二、方法步骤（一）植物基因组DNA提取在提取过程中用到的吸头、、提取缓冲液等先高压灭菌20 min，取出后待用，按照下述步骤提取基因组DNA。（1）在65°C中预热CTAB提取液。（2）在液氮中研磨2～3 g新鲜或 -20°C冷冻的样品材料。注意，要研成很细的粉末，动作要快。（3）迅速加入CTAB提取液，混匀，倒入离心管中，65°C水浴30 min。其间不断轻轻摇动离心管。（4）加入5mol/L的乙酸钾充分混匀，在冰浴中放置30 min中，4°C 12000 rpm离心5 min，吸上清。注意，对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。（5）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置10 min，12000 rpm常温离心10 min。（6）吸上清到新离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次。（7）吸上清到新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20°C放置10～30 min沉淀DNA。（8）10000 rpm常温离心10 min。（9）倒掉乙醇，用400 μL70%乙醇洗沉淀，然后用400μL100%乙醇洗沉淀，吹干后用200～500 μL TE溶解DNA。（10）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一遍.（11）吸上清到新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20°C放置10～30 min ,沉淀DNA。（12）离心，弃上清，70%乙醇洗沉淀，再用100%乙醇洗沉淀，吹干后，用200 μLTE 溶解DNA。用紫外测定浓度后，按要求的浓度（如200 μg·μL-1）再向DNA溶液中加入适量TE。在 -20°C冰箱中可长期保存。注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和切割非常重要，不能振荡，不能使用太细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物，提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试材较老、多糖含量高，在提取缓冲液中应提高?-巯基乙醇的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚: 氯仿:异戊醇抽提一遍，这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色，若呈褐色则有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液中CTAB的浓度可增至3%或更高。琼脂糖电泳检测DNA:制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液 5 μL，电泳检测，具体方法见实验47。用λDNA做分子量大小的Marker，如果带型不弥散，在与Marker 20 kb的带的相应位置出现整齐明亮的条带，说明基因组DNA完整，没有降解。
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等你回答的问题：萝卜贮藏根组织细胞中是否存在蛋白质和DNA？某生物小组对此进行了研究，他们从网上查阅资料得知：①蛋白质在10%NaCl溶液中可沉淀析出；②在蛋白质溶液中，加入双缩脲试剂，溶液呈现特有的颜色；③DNA溶于10%NaCl溶液但在95%酒精中呈白色絮状沉淀，析出。实验材料：白萝卜。实验用具：粉碎机、烧杯、漏斗、试管、滤纸、玻棒、镊子、载玻片、天平、纱布。药品及试剂：蒸馏水、NaCl、95%酒精、甲基绿染液、双缩脲试剂、蛋白质标准样品。请你根据所提供的条件参与实验设计并完成实验。一、材料处理：称取50g冼净切块，加水30ml，粉碎机粉碎，将匀浆经纱布过滤。二、提取：1．向经纱布过滤得到的滤液中加入　　，直至沉淀析出。经滤纸过滤，将滤纸上的沉淀物放入试管中，加入1ml蒸馏水，振荡，用于鉴定。2．除去蛋白质的滤液中，加入，用玻棒轻轻搅拌，见有白色絮状沉淀产生，经滤纸过滤，用镊子将滤纸上的絮状沉淀置于载玻片，用于鉴定。三、鉴定及结果：1．在用于蛋白质鉴定的试验试管中，加入双缩脲试剂，产生呈色反应，同时将和1ml蒸馏水放入另一试管，加入双缩脲试剂产生呈色反应。观察到两试管中颜色基本一致，说明。2．在用于DNA鉴定的载玻片上，滴加甲基绿染液，白色絮状沉淀呈现蓝绿色，说明。3．通过对白萝卜贮藏根匀浆液的检测，说明。四、讨论：1．蛋白质在萝卜贮藏根组织细胞中所起的作用是_______________。2．DNA主要来自萝卜贮藏根组织细胞的______________。 - 跟谁学
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SDS法提取植物基因组DNA
&#160;&#160;&#160;&#160; 本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。
一 材料、试剂和仪器
1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）
EDTA 50mmol/L （pH8.0）
NaCl 500 mmol/L
灭菌后加 -巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3. 仪器: 离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置
二 实验程序
1取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500 L提取液的离心管中,轻轻混匀。
2 向管中加入50 L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65℃保温10min，并不时摇动。
3 加入150 L 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。
4 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
6 加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
8 用400 L 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 电泳检测完整性。
三、结果分析
1． 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm和310nm波长分别读数。其中260nm
用琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测核DNA的完整性(见图2 )。
完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。
电泳前缘为未除干净的RNA。
2．如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。
3. DNA沉淀呈棕色，难以酶切
植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可在加入2 CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100 l DNA加5 l 0.1mol/L的亚精胺）。
4．DNA中含有多糖或盐类
将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂）
5．DNA已降解电泳条带呈弥散状
样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡，Tip头应剪去Tip头尖，避免反复冻融DNA。
收录时间:日 17:09:53 来源:未知 作者:匿名
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酒精为什么能沉淀DNA在DNA的粗提取和鉴定的方法中,其中最后一个步骤为沉淀DNA,必须用冷酒精.实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。请问原理是什么?
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此次试验一般会有两个疑问：1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相...
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无...
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酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用
1.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别：&&&&&&&&& 异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。
异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。
在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，
但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。<font color=#ff~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。
沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍
缺点是总体积较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤。
2.一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v），其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质步骤：
质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次，重复此步骤，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀，零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min，沉淀用75%乙醇洗涤一次，12000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于20～40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。
3 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
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