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层析填料选择
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1/Superdex 75Superdex 75 10/300 GL , Superdex 200&&10/300&&GL
的使用及维护
Superdex 系列层析柱的选择
&根据待分离样品分子量的大小不同进行选择：
&Superdex 75 分离范围：3000～70000（球蛋白）；
&Superdex 200 分离范围：10000～600000（球蛋白）；
&如果是分离范围重合的组分，则优先使用分离范围窄的填料；
&缓冲液的准备：
缓冲液及样品的要求
所有缓冲液必须经过0.45um滤膜过滤后方可使用；&样品的准备：
1.样品蛋白总量应控制在10mg以下
2.样品体积推荐控制在500ul左右
3.样品必须经过0.45um滤膜过滤或者10000g离心10min后方可上样
禁止使用以下缓冲液&使用氧化剂将破坏层析填料的化学结构，造成填料报废；
&使用未过滤的溶液将引起层析柱堵塞导致柱反压升高而使层析柱无法正常使用（如果发现此种情况请联系维护人员更换柱内滤片）
操作流速及压力
&推荐流速：
Superdex 75 10/300 GL 及Superdex 200 10/300 GL 推荐使用0.5ml/min
&&使用压力： &
&&不超过1.5MPa，15bar，218psi；
Superdex 75 10/300
GL& and Superdex 200 10/300 GL 的保存
&应使用脱气后的20％乙醇保存，并置于4～30°C范围的恒温环境
Superdex 75 10/300
GL& and Superdex 200 10/300 GL 使用维护流程小结
1.所有使用缓冲液的脱气、过滤；
2.样品过滤或者离心；
3.层析柱的连接，应防止气泡进入；
4.层析柱连接后应使用不少于半个柱体积（层析柱体积为24ml）的去离子水（经脱气）冲洗，防止高盐缓冲液和乙醇接触而产生沉淀；
5.层析柱使用结束后也同样应使用去离子水（经脱气）冲洗不少于半个柱体积后再用20％乙醇保存；
离子交换填料的使用和维护
&&按照其所带的交换功能基的特性可以分为阳离子交换填料（SP、CM）和阴离子交换填料（Q、DEAE）；
离子交换填料的种类
&按照功能基上酸或碱的强弱程度分为强酸阳离子交换树脂（SP）、弱酸阳离子交换树脂（CM）；强碱阴离子交换树脂（Q）、弱碱阴离子交换树脂（DEAE）;
离子交换填料的选择
&离子交换填料的选择首先应考虑保持欲分离物质的生物活性，以及在不同PH环境中此物质所带的电荷和电荷的强弱；
&例如polymyxin、 cytochrome C这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中比较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换填料；其它像heparin、nucleic
acid这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换填料；
&如果要分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为离子交换填料的选择。以胰岛素（insulin）为例，它的等电点为pH
5.3，因此在pH&5.3（酸性）溶液中，因带有正电荷，故采用阳离子交换填料，在pH&5.3的碱性溶液中，带有负电荷，使用阴离子交换填料。
常用离子交换填料的流速、压力
常用的离子交换填料包括：&&&&&&&&&&&&&&&&&&
SP-Sepharose、CM-Sepharose、&&&&&&&&&&&
Q-Sepharose、DEAE-Sepharose
使用流速：
最大流速750cm/h
： 2(内径16mm层析柱截面积)X750/60min＝25ml/min
使用压力：
最大耐压0.3MPa、3bar、44psi
常用离子交换填料的载量
缓冲液及样品的要求
缓冲液的准备：
所有缓冲液必须经过0.45um滤膜过滤后方可使用；
样品的准备：
样品必须经过0.45um滤膜过滤或者10000g离心10min后方可上样
禁止使用以下缓冲液
使用氧化剂将破坏层析填料的化学结构，而使填料报废；
使用未过滤的溶液将引起层析填料污染，影响填料性能；
离子交换填料的再生
去除一般杂质使用2M
NaCl 3CV(column volume)；
去除沉淀蛋白、疏水蛋白、脂蛋白使用
1M NaOH 3CV 并保持接触30min；
去除强疏水蛋白、脂质可以使用70％乙醇或者&
30％异丙醇；
同一蛋白使用5～10次清洗一次（保护填料），使用不同蛋白则每次都需清洗（防止交叉污染）；
离子交换填料再生后处理
清洗后应当用去离子水把填料冲洗干净（到流出PH到中性）后，如果不再使用应保存于20％乙醇，如需再次使用则用buffer再次平衡；
离子交换填料的保存
1.未使用过的新填料的保存：
置于4～30度保存；
2.已使用过填料的保存：
在20％乙醇中置于4度保存；
离子交换填料使用简易流程
3CV去离子水冲洗填料
5～10CV Elution Buffer（含高盐）平衡（应测流穿PH及OD280基线稳定）
Start Buffer （不含盐或含低盐）(测流穿PH)
进样（样品电导不得高于Start
洗涤 (一般为Start Buffer) 5～10CV（至OD280基线稳定）
洗脱 Elution Buffer(含高盐)线性梯度洗脱或者分步洗脱
去离子水清洗10CV
20％乙醇5CV
保存 （4度）
所有溶液都应经0.45um滤膜过滤方能使用；
3.Ni-NTA填料的使用和维护
Agarose 操作流速、压力、载量等
推荐流速：
2(16mm内径柱截面积)X100/60min＝3.3ml/min
使用压力：
重力，此填料不耐压（最大耐受压0.2bar、2.8psi）
分子量20KDa的样品5～10mg/ml
Agarose 在各种缓冲液中的稳定性
&鳌合剂：EDTA、EGTA，最高1mM（Ni
还原剂：B-巯基乙醇，最高20mM；不推荐使用DTT、DTE（最高1mM）
变性剂：Urea
最高8M；Gu-HCl，最高6M；
其他试剂：
NaCl，最高2M，推荐0.3M用于防止离子吸附；
imidazole，低浓度20mM用以防止非特异性吸附，100mM以上通常用于洗脱目标蛋白；
禁止使用以下缓冲液
使用氧化剂将破坏层析填料的化学结构，而使填料报废；
使用未过滤的溶液将引起层析填料污染，影响填料性能；
缓冲液及样品的要求
缓冲液的准备：
所有缓冲液必须经过0.45um滤膜过滤后方可使用.
样品的准备：
样品必须经过0.45um滤膜过滤或者10000g离心10min后方可上样
如果使用预装柱样品应源自E.coli表达系统，真核表达系统因含脂类杂质较多样品难以处理应当选用散装填料；
Agarose 的简易再生
用0.1M EDTA 5CV
用6M Gu-HCl或者0.5M NaOH 3CV 接触30min
用去离子水10CV
再平衡或者20％乙醇保存
每次使用完毕都应尽快处理（一周内），如果不能当天处理也应该把填料置于20％乙醇
Agarose 的彻底再生
1：从层析柱下端流干所有溶液，用2CV的0.2mM Acetic Acid/ 6M
guanidine HCl洗；
2：用2CV的去离子水洗；
3：用3CV的2% SDS
4：用1CV的25%乙醇洗；
5：用1CV的50%乙醇洗；
6：用1CV的75%乙醇洗；
7：用5CV的100%乙醇洗；
8：用1CV的75%乙醇洗；
9：用1CV的50%乙醇洗；
10：用1CV的25%乙醇洗；
11：用1CV的去离子水洗；
12：用5CV的0.1M EDTA pH
8.0洗；然后用3CV的去离子水洗；
建议简易再生五次后进行一次彻底的再生；
Ni-NTA填料的保存
再生后的填料应当保存于20％的乙醇中并置于4度冰箱
Agarose使用简易流程
3CV 去离子水洗
B. 2CV 0.1M
5CV 去离子水洗
5～10CV Start Buffer(一般≤20mM imidazole)平衡，（应测流穿PH）
进样（样品内避免有EDTA、EGTA）
洗涤(Start Buffer)5～10CV（至基线稳定）
洗脱（一般选择≥100mM imidazole)
去离子水清洗5CV
20％乙醇5CV
保存 （4度）
所有溶液都须0.45um滤膜过滤；
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一、离子交换层析
离子交换层析根据化合物的净电荷进行分离。带负电荷或正电荷的官能团共价结合于固相载体基质，分别成为阳离子交换剂和阴离子交换剂。当一个带电荷的分子加入到带有相反电荷的交换剂时，它就会被吸附，同时，带相同电荷的离子和中性分子则被洗脱到层析柱的外水体积里。带电荷分子的结合是可逆的，通常可用盐或PＨ梯度洗脱吸附的分子。
离子交换层析可以有多种应用，包括分离和纯化生物分子，分离无机离子，试剂和水的去离子化，盐转换以及去除金属离子、溴化乙锭和ＳＤＳ。
两性化合物的分离策略。如果分子在ＰＨ高于其等电点时稳定，可使用阴离子交换树脂。如果分子在ＰＨ低于其等电点时稳定，则使用阳离子交换树脂。
美国GE（原安玛西亚）层析填料（常用型号）
离子交换填料：
17-0510-01QSepharoseF.F
17-0510-04QSepharoseF.F
17-0510-05QSepharoseF.F
17-0729-01SPSepharoseF.F
17-0729-04SPSepharoseF.F
17-0729-05SPSepharoseF.F
17-0709-01DEAESepharoseF.F
17-0709-05DEAESepharoseF.F
17-0719-01CMSepharoseF.F
17-0719-05CMSepharoseF.F
17-1275-02SOURCE30Q
17-1275-03SOURCE30Q
17-1014-03QSepharoseH.P.
17-1087-03SPSepharoseH.P.
二、亲和层析
亲和层析过程中，配体与待分离分子具有特定的亲和力，共价结合于固体之上。样品混合液加入到这些基质形成的层析柱载体时，目标分子（如蛋白、多肽、ＤＮＡ片段等）与固定在基质上的配体结合，而混合液中不具亲和力的组分则析出。通过改变ＰＨ值、浓盐度、使用有机溶剂或加入与配体竞争性结合的分子，则可以将目标分子洗脱下来。
美国GE（原安玛西亚）层析填料（常用型号）
亲和层析填料：
17-0575-02ChelatingSepharoseFastFlow
17-0575-04ChelatingSepharoseFastFlow
17-1279-03rProteinASepharoseFastFlow
17-1279-04rProteinASepharoseFastFlow
金属螯合填料：
17-0920-07填料名称：IMACSepharoseHighPerformance
17-0921-09填料名称：IMACSepharose6FF
三、分子量排阻层析（又名分子筛层析、凝胶过滤层析）
分子量排阻层析（ＳＥＣ）又称凝胶过滤层析，它根据分子量大小来分离分子。凝胶基质由特定大小孔隙的球形小珠组成不同分子量的分子从孔中排阻通过，发生分离。小分子进入孔内，会延滞它们通过层析柱，而大分子避开孔，洗脱入层析柱外水体积。因此，样品根据分子量大小进行分离，并依照分子量递减顺序洗脱。
依据层析目的和所需的分辨率来选择操作条件和介质。分子量排阻层析中一种常规的方法为基团分离，包括：
脱盐－目标分子洗脱出来，而小分子保留在凝胶孔内。为了获得理想的分离，基质的分子量排阻限度应比目标分子小。
分级分离-一定分子量范围的分子在凝胶基质内分离。使用这种方法时，目标分子应当在凝胶的分级分离范围以内。
分子量排阻层析常规应用包括蛋白分级分离及分子量确定、核酸分离、质粒纯化和多糖分级分离。
层析分辨率取决于颗粒大小，孔径大小、流速、层析柱尺寸和样品体积。通常，低流速（2-10cm/hr）、细长柱、小颗粒凝胶、小样品体积（总床体积的1-5%）、2倍的分子量差异以及相同的溶液粘度，可以获得最高分辨率。如果用于脱盐，品体积则可达总床体积的30-40%，并可使用短粗柱。
美国GE（原安玛西亚）层析填料（常用型号）
凝胶过滤填料：
17-0612-01SephacrylS-100HR
17-0612-05SephacrylS-100HR
17-0584-01SephacrylS-200HR
17-0584-05SephacrylS-200HR
17-0149-01Sepharose4FastFlow
17-0149-05Sepharose4FastFlow
17-0033-01SephadexG-25Medium
17-0033-02SephadexG-25Medium
17-1044-01Superdex75prepgrade
17-1044-02Superdex75prepgrade
17-1043-01Superdex200prepgrade
17-1043-02Superdex200prepgrade
四、疏水作用层析
疏水作用层析（HIC）根据化合物的疏水性进行分离；带有疏水和亲水基团的样品分子在高盐缓冲液中加入到HIC层析柱，缓冲液中的盐降低了样品的溶解度。由于总溶解度下降，裸露在外的疏水基团就被介质吸附。化合物的疏水性越强，需要加入用来提高结合力的盐就越少。通常依照疏水性的递增次序，用递减盐梯度来洗脱层析柱内的样品，也可以在洗脱中加入温和的有机调节物或洗涤剂来完成。
美国GE（原安玛西亚）层析填料（常用型号）
疏水层析填料：
17-0980-01ButylSepharose4FastFlow
17-0946-02OctylSepharose4FastFlow
17-0965-05PhenylSepharose6FastFlow(lowsub)
17-0965-03PhenylSepharose6FastFlow(lowsub)
17-0973-05PhenylSepharose6FastFlow(highsub)
17-0973-03PhenylSepharose6FastFlow(highsub)
五、羟基磷灰石层析
羟基磷灰石（Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ）２是磷酸钙的一种，对分离一些其它层析和电泳技术无法区分的蛋白具有独特的选择性和分辨率。羟基磷灰石层析适应从最初捕获到最完善的任何步骤。应用于以下分离和纯化：
?不同种类的单克隆和多克隆抗体?区分超螺旋与线性ＤＮＡ
?轻链组成不同的抗体?区分双链ＤＮＡ与单链ＤＮＡ
?抗体片断?病毒?同工酶
上海金达生化仪器有限公司（上海金达生化仪器厂）的前身是上海兴华电子仪器厂，始建于1974年，是最早生产生化仪器的厂家之一，具有三十年生产经验。主要产品有：核酸蛋白检测仪系列，紫外检测仪系列，紫外分析系列，低压层析分析系统系列，高效液相色谱检测系统，抗生素杂质分析系统，气相色谱仪、半自动生化仪器系列，电泳仪系列，电泳槽系列，高速分散器（又名匀浆机），超声波粉碎机，清洗机系列，凝胶图像分析系统等。产品广泛用于现代生物学研究，农业科研，生物工程, 医疗检验, 药物生产，药物测定, 化工食品等科学领域。
本公司拥有一批具有丰富的仪器开发经验和生产管理能力的技术人员，不断更新研究和开发生化等领域的仪器。近10年来市场调研和潜心研制，新开发UVD和HDL系列双光束紫外检测仪，申请了国家新型实用专利，专利号：ZL，经上海药物检验所，上海海军医学研究所，与上海交通大学医学院等单位实验证明，由于采用双光束测量原理，仪器的稳定性大大提高。仪器从开机到稳定使用只需10分钟。另外最近新开发的紫外光谱灯，使仪器的单色性大大提高，有效提高仪器检测的准确性。
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请教：层析柱（填料）清洁验证怎么做？如何定标准？
本帖最后由 hecpharm 于
14:53 编辑
我们在小试以及工厂生产的时候都会碰到一个问题：层析柱（包括亲和填料和离子交换填料）再生后走一个空白循环，洗脱的时候用A280检测还是会出现一个小峰，我想这样的情况应该是很难通过清洁验证的。想请教一下：层析柱清洁验证要怎么做，用什么标准来作为衡量的指标（例如TOC等），有没有这方面的法规指南。
望有经验的大神能给与指教。谢谢。
没做过生物药
但应该一样的道理
标准制定需要看你是否是产品专用的
如果专用的使用10ppm的标准即可
如果是非专用的
即还需要考虑千分之一和PDE标准
至于检测方法
可以使用紫外、HPLC、TOC等
考虑到你洗脱液不是纯水
TOC可能性不大
建议去看看PDA tr49 生物制品的清洁验证
没做过生物药
但应该一样的道理
标准制定需要看你是否是产品专用的
谢谢，生物药的层析柱和填料是需要专用的。10ppm是针对一般设备的清洁验证的标准吧？不知道用来纯化蛋白分子的层析柱和填料适不适用。
&专用的话已经很低了
所以如果能够通过则应该没有问题&
谢谢，生物药的层析柱和填料是需要专用的。10ppm是针对一般设备的清洁验证的标准吧？不知道用来纯化蛋白 ...
专用的话已经很低了
所以如果能够通过则应该没有问题
好专业的问题……
TOC可以。A280都能检出峰来说明杂质不小。
使用完毕用苛刻条件处理一下，比如离子交换你的正常洗脱用0.4M氯化钠，可以用1M氯化钠冲洗一下，并按说明书用0.5M氢氧化钠之类的处理一下，然后水冲洗，按正常程序再生、平衡、洗脱，应该就不会了。
还有柱子的筛网用久了容易积聚不容易洗脱的脂蛋白之类的东西，不能光靠在线清洗，需定期拆解清洗后重装。
建议做TOC和电导，限度高一点。做生物药肯定要升高限度
建议做TOC和电导，限度高一点。做生物药肯定要升高限度
TOC标准如何制定是个难题？
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