利用位点特异性整合酶生产无抗生素筛选标记的转基因奶牛--《西北农林科技大学》2013年博士论文
利用位点特异性整合酶生产无抗生素筛选标记的转基因奶牛
【摘要】：转基因家畜是生物医学和农业研究领域的重要材料。而转基因动物生产过程中一般都需要用到抗生素筛选标记基因。获得转基因动物后，其体内残留的抗生素筛选标记存在生物安全方面的隐患，对转基因动物安全及环境安全造成了潜在的威胁。本研究旨在建立一种安全高效的方法，为体细胞核移植（SCNT）提供无抗生素筛选标记的具有良好发育潜能的转基因供体细胞，为培育无抗生素筛选标记的转基因动物奠定基础。研究内容如下：
1.基于假attP位点整合的通用型表达载体构建及功能验证
利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）合成attB序列及其他载体元件，构建基于假attP位点整合的通用型表达载体pARNG，评估载体pARNG的主要功能元件。结果显示：通过SOE-PCR合成的attB片段能够在phiC31整合酶的介导下发生位点特异性重组，载体中的双荧光报告系统可以正确指示转染阳性细胞和Cre介导的重组反应。
2.利用phiC31整合酶mRNA生产转基因胎牛成纤维细胞
通过体外转录制备phiC31整合酶（Int）mRNA和突变失活型整合酶（mtInt）mRNA。构建验证phiC31整合酶功能的载体pPBstop-eGFP并与phiC31mRNA共电转胎牛成纤维细胞，通过流式细胞术（FACS）分析和γ-H2AX免疫荧光染色确定转染试验中phiC31IntmRNA最优使用剂量为1μg。构建含有attB位点的HBD3乳腺特异性表达载体pARNG-HBD3，在phiC31mRNA的介导下转染胎牛成纤维细胞，在稳定转染的细胞克隆中检测到7个假attP位点，其中BFF2为整合热点，28%稳定转染克隆中存在该位点的整合。利用生物信息学软件分析这些位点序列特征，并按照“基因组安全港”标准重新评估牛基因组中已公布的所有假attP位点。经过进一步鉴定获得HBD3基因单拷贝整合在BFF2“基因组安全港”的细胞克隆。
3.利用Cre穿膜肽切除转基因细胞中的抗性筛选标记
原核表达、纯化His-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白，同时构建验证Cre重组酶功能的胎牛成纤维细胞株BFF2-L2stop优化Cre穿膜肽转导条件。结果显示使用终浓度为100μg/mLHis-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白转导胎牛成纤维细胞时，重组效率可达70%，并且对细胞无明显毒性。通过细胞免疫荧光染色证实His-NLS-TAT-Cre重组蛋白在细胞中主要定位于细胞核。利用His-NLS-TAT-Cre重组蛋白转导单拷贝整合pARNG-HBD3的转基因胎牛成纤维细胞并进行FACS分选，Southern blot证实分选得到的只表达绿色荧光的细胞即是切除了抗生素筛选标记的转基因细胞。此外，本研究还证实了phiC31Int mRNA介导的BFF2位点的整合及后续His-NLS-TAT-Cre重组蛋白介导的抗生素筛选标记的切除不会对整合位点旁侧基因的表达造成影响，且获得的转基因细胞染色体数目正常（2n=58+XX）。
4.通过SCNT生产无抗生素筛选标记的转HBD3基因克隆牛
以去除抗性筛选标记的转HBD3基因胎牛成纤维细胞作为供体细胞进行体细胞核移植，获得转基因囊胚后经过胚胎移植，最终获得12头健康的无抗生素筛选标记的转基因奶牛，对其中5头泌乳期的转基因奶牛进行分析，在乳汁中均能检测到HBD3表达，含量为3.9~10.4μg/mL。利用体外琼脂糖扩散试验和乳腺内攻菌试验检验转基因牛抗S.aureus和E.coli感染能力。在分别灌注S. aureus和E.coli细菌培养物的15个转基因奶牛乳房中，检测到33.3%和6.7%的乳腺发生感染，而灌注非转基因奶牛的15个乳房分别检测到93.3%和86.7%的乳腺发生感染。结果表明，转HBD3基因克隆牛可以显著抵抗S. aureus和E. coli的感染。值得注意的是，HBD3基因整合在BFF2位点的转基因奶牛乳汁中HBD3含量较高,在攻菌试验中从未感染。
研究表明通过联合使用phiC31整合酶mRNA、His-NLS-TAT-Cre穿膜蛋白、双荧光报告系统和FACS分选技术可以安全高效地生产无抗生素筛选标记的转基因供体细胞，为SCNT准备具有良好发育潜能的转基因供体细胞，并培育出对乳腺炎致病菌具有抵抗能力的转基因克隆牛。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：S823【目录】：
摘要6-8ABSTRACT8-14文献综述14-34 第一章 转基因动物的应用14-21
1.1 利用转基因动物乳腺生产药用蛋白14-15
1.2 转基因家畜在农业方面的应用15-18
1.2.1 利用转基因家畜提高动物的生产性能15
1.2.2 动物转基因抗病育种15-18
1.3 转基因动物生产技术18-21
1.3.1 体细胞核移植技术18
1.3.2 慢病毒介导的转基因技术18
1.3.3 条件性转基因表达18
1.3.4 人工染色体载体18-19
1.3.5 精原细胞介导的转基因技术19
1.3.6 RNA 干扰19
1.3.7 锌指核酸酶技术19-21 第二章 PhiC31 整合酶介导的位点特异性整合21-34
2.1 位点特异性重组酶21-23
2.2 PhiC31 整合酶的整合机理及在其它生物中的优化23-26
2.3 PhiC31 整合酶在不同生物中的应用26-29
2.3.1 PhiC31 整合酶在植物中的应用26
2.3.2 PhiC31 整合酶在非脊椎动物中的应用26-27
2.3.3 PhiC31 整合酶在脊椎动物中的应用27-29
2.4 PhiC31 整合酶在治疗学方面的应用29-31
2.4.1 PhiC31 整合酶在 in vito 基因治疗中的研究29-30
2.4.2 PhiC31 整合酶在 ex vivo 基因治疗中的研究30-31
2.5 PhiC31 整合酶在多能干细胞中的应用31-32
2.6 PhiC31 整合酶系统的安全性32-33
2.7 PhiC31 整合酶联合其他重组酶的应用前景33-34试验研究34-101 第三章 基于假 attP 位点整合的通用型表达载体构建及功能验证34-48
3.1 材料和试剂34-35
3.1.1 材料34
3.1.2 试剂34-35
3.2 方法35-40
3.2.1 通过重叠延伸 PCR 合成载体元件35-36
3.2.2 一种基于假 attP 位点整合的通用型表达载体的构建36-37
3.2.3 attB 序列功能评估37-40
3.2.4 双荧光报告系统功能验证40
3.3 结果40-45
3.3.1 attB 片段、LoxP2 片段和 MCS 片段的凝胶电泳检测40-41
3.3.2 通用型表达载体 pARNG 的鉴定41-42
3.3.3 attB 序列在 HEK293 细胞中的位点特异性整合42-44
3.3.4 双荧光报告系统在 HEK293 细胞上的功能验证44-45
3.4 讨论45-47
3.5 小结47-48 第四章 利用 phiC31 整合酶 mRNA 生产转基因胎牛成纤维细胞48-71
4.1 材料和试剂48-49
4.1.1 材料48-49
4.1.2 试剂49
4.2 方法49-55
4.2.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的原代培养与性别鉴定49-50
4.2.2 PhiC31 整合酶 mRNA 的制备50
4.2.3 PhiC31 整合酶 mRNA 在胎牛成纤维细胞中的功能验证及转染优化50-52
4.2.4 HBD3 乳腺特异性表达载体构建及转染胎牛成纤维细胞52-53
4.2.5 稳定转染细胞克隆的鉴定53-55
4.2.6 数据统计55
4.3 结果55-68
4.3.1 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定55
4.3.2 PhiC31 整合酶 mRNA 的体外转录55-56
4.3.3 PhiC31 整合酶功能验证载体构建及功能验证56-57
4.3.4 PhiC31 整合酶 mRNA 在胎牛成纤维细胞中的功能验证57-59
4.3.5 PhiC31 整合酶 mRNA 转染对胎牛成纤维细胞的潜在毒性59-60
4.3.6 HBD3 乳腺特异性表达载体的构建及稳定转染单克隆细胞的获得60-62
4.3.7 稳定转染的胎牛成纤维细胞克隆的鉴定62-68
4.4 讨论68-70
4.5 小结70-71 第五章 利用 Cre 穿膜肽切除转基因细胞中的抗性筛选标记71-89
5.1 材料与试剂71-72
5.1.1 材料71-72
5.1.2 试剂72
5.2 方法72-77
5.2.1 Cre 穿膜肽的原核表达与纯化72-73
5.2.2 His-NLS-TAT-Cre 重组蛋白转导胎牛成纤维细胞的优化73-74
5.2.3 用流式细胞术分选无抗生素筛选标记的转基因细胞74
5.2.4 无抗生素筛选标记的转基因细胞的鉴定74-77
5.2.5 数据统计77
5.3 结果77-86
5.3.1 Cre 穿膜肽的原核表达与纯化77-78
5.3.2 His-NLS-TAT-Cre 重组蛋白对胎牛成纤维细胞转导条件的优化78-82
5.3.3 基于 FACS 技术分选无抗生素筛选标记的转基因细胞82-84
5.3.4 FACS 分选的转基因细胞的鉴定84-86
5.4 讨论86-87
5.5 小结87-89 第六章 通过 SCNT 生产无抗生素筛选标记的转 HBD3 基因克隆牛89-101
6.1 材料与试剂89-90
6.1.1 试验动物89
6.1.2 试剂89-90
6.2 方法90-92
6.2.1 卵母细胞的采集、成熟培养和去核90
6.2.2 无抗生素筛选标记的转 HBD3 基因的胎牛成纤维细胞的准备90
6.2.3 核移植及转基因克隆胚获得90
6.2.4 转基因克隆胚 PCR 检测90
6.2.5 转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定90-91
6.2.6 转基因牛的 Southern blot 鉴定91
6.2.7 转基因牛乳汁采集和成分分析91
6.2.8 HBD3 在转基因牛乳汁中的表达分析91
6.2.9 转基因牛乳汁中重组 HBD3 的体外抗菌活性检测91-92
6.2.10 乳腺表达 HBD3 转基因牛的攻菌实验92
6.2.11 数据统计92
6.3 结果92-99
6.3.1 转基因克隆胚的获得与鉴定92-93
6.3.2 SCNT 效率及转基因胚胎发育情况93-95
6.3.3 转基因克隆牛的获得与 Southern blot 鉴定95
6.3.4 转基因牛乳汁成分分析95-96
6.3.5 转基因牛乳汁中 HBD3 的表达96-97
6.3.6 转基因牛乳体外抑菌活性97-98
6.3.7 转基因牛攻菌实验结果98-99
6.4 讨论99-100
6.5 小结100-101全文结论101-102创新之处和进一步研究的课题102-103参考文献103-118附录118-120致谢120-121个人简介121
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【参考文献】
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马会明;[D];西北农林科技大学;2010年
王勇胜;[D];西北农林科技大学;2009年
【共引文献】
中国期刊全文数据库
倪斌;;[J];安徽农学通报;2007年16期
郑艳玲;彭树英;张涌;;[J];安徽农业科学;2006年16期
管晓斌;李春笑;赖松家;;[J];安徽农业科学;2006年23期
孙伟;张江丽;黄丛林;王永勤;吴忠义;张秀海;;[J];安徽农业科学;2007年25期
杨鹏华;倪凤娥;李宁;;[J];安徽农业科学;2008年35期
杨慧婷;王洪梅;侯明海;高运东;仲跻峰;何洪彬;;[J];安徽农业科学;2011年11期
梅兴林;李木旺;汪生鹏;;[J];安徽农业科学;2011年22期
杨慧婷;王洪梅;孙涛;高运东;仲跻峰;何洪彬;;[J];现代农业科技;2011年02期
孙艳;戴绍军;魏建华;王宏芝;;[J];现代农业科技;2012年03期
刘恩岐;郑华东;赵四海;杨鹏辉;;[J];动物学杂志;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库
王鹏雁;陈创夫;蒋建军;李彦芳;;[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十四次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十三次学术研讨会论文集[C];2006年
袁玉国;安礼友;杨廷佳;于宝利;赵俊辉;曹玉娟;成勇;;[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库
郭荆哲;[D];武汉大学;2010年
马会明;[D];西北农林科技大学;2010年
韩冰;[D];南京大学;2011年
许明;[D];福建农林大学;2011年
张东;[D];内蒙古农业大学;2011年
张霖;[D];复旦大学;2011年
吕自力;[D];石河子大学;2011年
周焕城;[D];南方医科大学;2011年
刘志滨;[D];西北农林科技大学;2009年
张艳丽;[D];南京农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
曹甲;[D];安徽农业大学;2010年
胡一飞;[D];安徽农业大学;2010年
马连杰;[D];山东农业大学;2011年
田风龙;[D];山东农业大学;2011年
季丽丽;[D];吉林农业大学;2011年
张丽更;[D];四川农业大学;2011年
李淑君;[D];四川农业大学;2011年
周羽;[D];东北农业大学;2011年
梅兴林;[D];江苏科技大学;2011年
陈秋菊;[D];西北农林科技大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
富国文;武海军;靳亚平;;[J];安徽农业科学;2007年24期
佟慧丽;尹德云;李庆章;高学军;;[J];东北农业大学学报;2008年08期
多曙光;吴应积;罗奋华;旭日干;;[J];动物学研究;2006年03期
胡菡;王加启;李发弟;卜登攀;李喜艳;周凌云;;[J];动物营养学报;2010年05期
乔利敏;黄成定;李向臣;关伟军;马月辉;;[J];中国畜牧兽医;2009年02期
朱振营;林祥梅;刘建;吴绍强;仇松寅;王建武;薛振华;;[J];中国畜牧兽医;2010年06期
李喜艳;王加启;魏宏阳;卜登攀;胡菡;周凌云;;[J];华北农学报;2010年S1期
鲁进,刘凤军,王勇胜,赵晓娥,张涌;[J];黑龙江畜牧兽医;2005年03期
吴庆洲;佟明华;张伟永;蔡咏芬;刘光泽;孔祥平;;[J];华南国防医学杂志;2010年03期
郭继彤,李煜,安志兴,李雪峰,李裕强,郭泽坤,张涌;[J];中国科学(C辑:生命科学);2002年01期
中国博士学位论文全文数据库
王勇胜;[D];西北农林科技大学;2009年
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郑晓鹰,李丽,邢宝田;[J];华北农学报;2001年01期
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金勇丰;陈英豪;金慧清;;[A];浙江省生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2005年
郭长奎;罗淑萍;何天明;李疆;高启明;;[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第八次学术研讨会论文集[C];2008年
李臻;孙质健;赵洁;张远强;;[A];2008年神经内分泌暨神经免疫内分泌学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
王慧中;胡滨;陈观平;施农农;应奇才;;[A];中国遗传学会植物遗传和基因组学专业委员会2007年学术研讨会摘要集[C];2007年
李青春;梁淑娟;刘艳艳;王焕芹;肖伟玲;张素华;;[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
王成伟;王志刚;孙金龙;曲春城;潘顺;郝晓光;张庆林;;[A];中国医师协会神经外科医师分会第二届全国代表大会论文汇编[C];2007年
张彦雷;张厚双;蔺智兵;周勇志;曹杰;周金林;;[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
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平萍;[N];新华每日电讯;2002年
梁雪芹 刘建东;[N];健康报;2005年
衣晓峰　董宇翔;[N];大众卫生报;2009年
孟刚;[N];中国消费者报;2009年
衣晓峰　董宇翔;[N];中国医药报;2009年
衣晓峰 李华虹 乔蕤琳;[N];健康报;2006年
袁立新;[N];南方日报;2004年
张建松;[N];人民日报海外版;2000年
衣晓峰 聂松义 李华虹;[N];中国医药报;2006年
衣晓峰 本报记者　
李华虹 乔蕤琳;[N];中国中医药报;2006年
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余源;[D];西北农林科技大学;2013年
欧海龙;[D];上海交通大学;2008年
潘卫;[D];重庆医科大学;2004年
平晓川;[D];北京协和医学院;2009年
罗斌;[D];武汉大学;2013年
王磊;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
徐伊琳;[D];武汉大学;2010年
曹卫东;[D];中国农业科学院;2000年
王辉;[D];东北农业大学;2001年
程谟斌;[D];北京协和医学院;2010年
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罗国兰;[D];广西医科大学;2013年
郑会芹;[D];河北农业大学;2010年
朱作斌;[D];中南大学;2013年
赵振;[D];重庆医科大学;2013年
乔秀强;[D];兰州大学;2011年
方荣;[D];暨南大学;2012年
严剑;[D];南昌大学医学院;2013年
王俊妨;[D];重庆医科大学;2007年
毛小鸿;[D];福建农林大学;2010年
岳彩黎;[D];重庆大学;2011年
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如何使用G418来筛选稳定转染的细胞
在分子遗传实验中，氨基糖苷类抗生素G418()是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。G418全名为Geneticin，白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
1、工作原理：
它通过抑制转座子Tn601，Tn5
的基因,干扰80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
转座子序列(neo抗性基因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
2、利用G418筛选细胞：
(1)准备工作
① G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
② 在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。每种细胞对G418
的敏感性不同，一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。
表1 《分子克隆》推荐几种常用细胞系G418筛选的最佳用量：
细胞系或机体
G418浓度（ug/ml）
中国仓鼠卵巢细胞
Madin-Darby犬肾细胞
人上皮A431细胞
猿CV-1细胞
盘基网柄菌属
(2)预实验确定最佳筛选浓度
最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
① 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，培养6小时左右开始加药;
② 加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基;
③ 制备筛选培养：
G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,ug/ml等12个级别,
培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可;
④ 加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基;
⑤ 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3～5天更换一次筛选培养基。
(3)通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了：
① 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50%～70%汇合时‘
② 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
③ 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3～5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后;
挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
⑤ 单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
3、注意事项：
(1)汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%!
(2)加药时间
①一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选(由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆)。
②每3~5d更换一次含有G418的筛选液(因为随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降)，这时药物浓度可以降至200ug/ml。
(3)培养液的使用
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡：
①非选择性死亡：死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡。
②阳性细胞的状态不佳甚至死亡：孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，导致阳性细胞死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：转染前，在细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
(4)挑选单克隆的优化(筛选阳性克隆)
方法：加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。之后：
①套环法(结合有限稀释法)：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
②刮除法(结合有限稀释法)：刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
(5)鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。
A 细胞克隆----有限稀释法
有限稀释法采用梯变倍数稀释的原则，将稀释的细胞悬液接种于微孔培养板中(也可在板上的96孔中直接稀释)培养一定时间后，孔中可出现单个细胞克隆。本法不需特殊设备，操作简单快速，适合大大批量克隆化培养。现已广泛用于异质性细胞系的克隆化培养、诱导和分离，如耐药性细胞株或高转移性细胞株或突变细胞株以及单克隆抗体杂交瘤细胞株的克隆筛选中。
取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度(细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上)。
② 将细胞悬液在试管中稀释，用培养基将细胞稀释至50个/ml、10个/ml、5个/ml，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中，每孔100
μl，于37℃、5% CO2下培养。
③ 次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加100 μl培养基继续培养。
④ 培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养基，1周左右，孔中有明显克隆出现。
⑤ 待克隆长直孔底面的1/3-1/2时，可用消化法将96孔板中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。
B 稳转的方法(有限稀释改良)：
① 3.5cm皿铺细胞，长到大概80%以上的时候作转染。
② 转染后一天消化，传到一个大皿(1：6)或者两个大皿(1：12)。
③ 再过一天后加入带G418的培养基。
④ 依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。
⑤ 单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。
⑥ 于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。
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1)&&In vitro gene transfer
体外基因转染
2)&&extrachromosomal gene
染色体外基因
3)&&gene transfection
Effects of FATE/BJ-HCC-2 gene transfection on biological beh
FATE/BJ-HCC-2基因转染对肿瘤细胞生物学行为的影响
Effects of Canstatin gene transfection on growth and apotosis of HUV-ECC
Canstatin基因转染对体外培养血管内皮细胞增殖与凋亡的影响
Expression and biological effects of human BMP-2 gene transfectionon rabbit s bone mesenchymal
hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察
4)&&Gene transfer
Protective immunity effect of Sj26 gene transfer dendritic cells on Schistosoma
Sj26基因转染树突状细胞抗血吸虫感染作用
NT-3 gene transfer to facial muscle
大鼠失神经支配表情肌NT-3基因转染的实验研究
IL-10 gene transfer prolongs the survival o
白细胞介素10基因转染延长移植物存活的研究
5)&&Transfection
[英][traens'fek??n]&&[美][traens'f?k??n]
Methods The plasmid of bacteriophague expression vector pBK-bax, which contains human bax cDNA, was transduced into HCC cell line HCC-9204 cells with Lipid-mediated gene transfection method, and at the same time the HCC-9204 cells transfected with empty pBK-CMV plasmid and non-transfected HCC-9204 cells were taken as control.
方法用脂质体介导的基因转染法将含有人bax cDNA的噬菌粒表达载体pBK-bax质粒导入人肝癌细胞系HCC-9204细胞中,同时设转染pBK-CMV空载体的和未转染的HCC-9204细胞对照。
Objective: To observe the lethal effect of T cells activated by dendritic cells (DCs) with MUC1 gene transfection (MUC1-DCs) on BIU-87 cells in vitro, and to evaluate the possibility of dendritic cells transfected by MUC1 gene as a vaccine for bladder cancer immunotherapy.
方法应用脂质体将人MUC1基因转染体外培养的外周血来源的DCs,并活化T细胞,以流式细胞术和MTT法检测其转染率和免疫活性,以不同效靶细胞的比例对BIU-87细胞和膀胱正常上皮细胞进行体外杀伤实验,MTT法测定杀伤率。
Nonetheless,transfection of LMO2 into Molt-4 cells increased plating efficiency.
方法荧光实时定量聚合酶链反应;Western印迹实验;基因转染建立高表达LMO2的白血病细胞株;siRNA干扰技术;细胞克隆形成实验。
6)&&gene transduction
Investigation of the effect of C2 gene transduction on human gastric cancer cell SGC7901;
C2基因转染对人胃癌细胞SGC7901的影响
A recombinant adenovirus Adexl CAmILl0 enabled us to achieve very efficient gene transduction and hi.
鉴于C26结肠癌细胞转染了IL-10基因后在体内的致瘤性明显下降,本研究构建了一株对C26结肠癌细胞具有杀伤活性的CD8~+CTL并观察了IL-10基因转染的该细胞株对肿瘤的治疗作用。
补充资料：基因体外扩增技术
分子式：CAS号：性质：又称基因体外扩增技术或核酸体外扩增技术。利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95℃)使含目标DNA片段的DNA双链变性，分解为单链。在较低温度(37～63℃)与引物退火：然后变温到72℃左右，在耐高温DNA聚合物酶作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后又变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片段就按2n数递增。用此法可从mRNA中，cDNA库中扩增出目标基因。过去一般合成500～1000bp较好，现已发展出大片段(75kb)的PCR，且差错甚少。PCR技术的发展还可用于定点突变，质粒重组及FLP等方面。这一技术的作用范围日益扩大，已成为分子生物学工作者基本技术之一。这项专利技术1985年由美国塞特斯(Cetus)公司开发。是20世纪80年代分子生物学领域中的一项革命性突破，已在分子生物学、医学、法学等领域发挥了极大的作用。
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