[免疫荧光双标实验操作方法与注意事项]&在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double&immunofluorescence&labeling&method)也分为直接法和间接法。(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光&[免疫荧光标记&双重免疫荧光&抗体&染色&荧光]
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光，在下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：
(1) 阳性对照：阳性+荧光标记物;
(2) 阴性对照：阴性+荧光标记物;
(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈
1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。
5、其余事项同免疫荧光单标操作。
免疫组化双重染色方法和步骤
在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
SP法双重染色步骤
1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：
7.切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟
8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;
9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟
10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;
11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色);
12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;
13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5分钟;
14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟：
15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟
16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟
17.苏木精复染细胞核;
18.水溶性封片剂封片。
在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统进行详细设计。购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂。在选择一抗时应避免定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不可避免，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种不同颜色的荧光重叠后呈现另一种颜色的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光)，它比SP法的显色系统更容易区别和辨认阳性结果。
在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。
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这个帖子发布于2年零168天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
这两天在做免疫荧光，第一次做，遇到几个问题，一是整个过程中每次用pbs冲洗后加抗体前要不要把玻片擦干净，擦的话用什么擦呢，二是新买的盖玻片要不要处理还是直接用呢，处理的话是用酸泡么，三是封片的时候怎么避免有气泡啊，要加甘油么，还有就是一般做完后多长时间内观察效果比较好呢。
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甲醛 @被点名了黑苦荞茶 wrote:这两天在做免疫荧光，第一次做，遇到几个问题，一是整个过程中每次用pbs冲洗后加抗体前要不要把玻片擦干净，擦的话用什么擦呢，二是新买的盖玻片要不要处理还是直接用呢，处理的话是用酸泡么，三是封片的时候怎么避免有气泡啊，要加甘油么，还有就是一般做完后多长时间内观察效果比较好呢。要努力的训练自己发现问题，然后分析问题，最后解决问题的能力。你已经发现了问题，我们现在来分析和解决：一：加抗体之前为什么为什么要擦，为什么不擦。原则就是无论擦或者不擦，只要能保证组织或者细胞上加的抗体不被周围的pbs稀释，怎样都行。怎么样达到这个目的，最简单的选择就是把组织周围的pbs擦干净，就是你说的擦了，抗体加上后，由于周围没有有问题，利用表面张力，就在组织上形成一个小滴，对组织进行很好的孵育。但是我们说，只要能保证抗体接触的是抗体，不被周围的pbs稀释就行，要是能有一种东西在组织周围画个圈，阻止pbs流到组织周围是不是也行了。当然可以，比如常用的免疫组化笔，石蜡等都可以达到这个效果，利用pbs与石蜡或其他油性试剂不相容的特点形成隔离，防止抗体与周围的液体接触从而稀释。所以，掌握好原则，只要能达到目的，怎么样都行。二：新买的盖玻片要不要处理，原则是你需要什么样的盖玻片。我理解你的处理不处理，主要是觉得盖玻片的清洁度不够。问题就来了，你需要什么样清洁度的盖玻片呢。可能你自己也不清楚，我只能说，肯定是越干净越好。但是到底多干净，没有一个具体的标准。我一直用的都是碧云天生物技术研究所生产的盖玻片（其他公司也有），直接使用，不做任何处理，。建议买精装真空包装的，用不了多少，关键是干净，至少没有对我的荧光染色造成任何影响。想来这个答案应该让你很满意，因为不需要处理，省了很多事。三：封片避免气泡的方法百度一下就有很多，课本上也有，就是从一侧慢慢盖过去，一点一点让盖玻片和封片剂接触。为了让你尽可能的没有气泡，你可以多加一些封片剂，最后的时候用剪成小块的滤纸将多余的封片剂吸走就可以了。还可以避免因封片剂过多导致的盖玻片滑来滑去。至于封片剂的配置，现在有很多商品化的，搜索一下就有很多很多。自己配置的话，一般就是PBS和甘油按比例混合，这个比例各有说法，我个人常用的是1:1.总之，要多思考，多问几个为什么，不要做技术匠，要知其所以然，出了问题才好分析。供你参考，祝你好运。
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我也比较讨厌私信我问题。有事直接@ 就行了。当然，我说的不是楼主。只是觉得现在的小孩儿好像都不太喜欢动脑子了，随便发句牢骚。
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wanliheng 要努力的训练自己发现问题，然后分析问题，最后解决问题的能力。你已经发现了问题，我们现在来分析和解决：一：加抗体之前为什么为什么要擦，为什么不擦。原则就是无论擦或者不擦，只要能保证组织或者细胞上加的抗体不被周围的pbs稀释，怎样都行。怎么样达到这个目的，最简单的选择就是把组织周围的pbs擦干净，就是你说的擦了，抗体加上后，由于周围没有有问题，利用表面张力，就在组织上形成一个小滴，对组织进行很好的孵育。但是我们说，只要能保证抗体接触的是抗体，不被周围的pbs稀释就行，要是能有一种东西在组织周围画个圈，阻止pbs流到组织周围是不是也行了。当然可以，比如常用的免疫组化笔，石蜡等都可以达到这个效果，利用pbs与石蜡或其他油性试剂不相容的特点形成隔离，防止抗体与周围的液体接触从而稀释。所以，掌握好原则，只要能达到目的，怎么样都行。二：新买的盖玻片要不要处理，原则是你需要什么样的盖玻片。我理解你的处理不处理，主要是觉得盖玻片的清洁度不够。问题就来了，你需要什么样清洁度的盖玻片呢。可能你自己也不清楚，我只能说，肯定是越干净越好。但是到底多干净，没有一个具体的标准。我一直用的都是碧云天生物技术研究所生产的盖玻片（其他公司也有），直接使用，不做任何处理，。建议买精装真空包装的，用不了多少，关键是干净，至少没有对我的荧光染色造成任何影响。想来这个答案应该让你很满意，因为不需要处理，省了很多事。三：封片避免气泡的方法百度一下就有很多，课本上也有，就是从一侧慢慢盖过去，一点一点让盖玻片和封片剂接触。为了让你尽可能的没有气泡，你可以多加一些封片剂，最后的时候用剪成小块的滤纸将多余的封片剂吸走就可以了。还可以避免因封片剂过多导致的盖玻片滑来滑去。至于封片剂的配置，现在有很多商品化的，搜索一下就有很多很多。自己配置的话，一般就是PBS和甘油按比例混合，这个比例各有说法，我个人常用的是1:1.总之，要多思考，多问几个为什么，不要做技术匠，要知其所以然，出了问题才好分析。供你参考，祝你好运。 非常感谢王版主的热情指导！我都学到了不少呢！其实一个好的实验室，能顺利成长起来，除了导师的作用，就是师兄师姐了。很多细节上的东西，都是靠师兄师姐来传。一个loser的师兄师姐，带出来的师弟师妹很难不loser。我呆过不少实验室，很庆幸的是，我接触过的很多师兄师姐都非常优秀。做实验喜欢问why，喜欢探究，也很细致。我第一个师姐非常热情，也非常认真。后来遇到的另一个师姐非常优秀，是一个院士的挂名弟子，她脾气很大，但是确实是非常优秀。大家也都很服，做实验更是细致得不得了。之后读研究生时带我的师姐是那种完美主义者，工作更是细致，一丝不苟，也是实验室的顶梁柱。等我开始带师弟师妹时，虽然我没有直接带的，但是跟我学技术的，我都会沿着以前师兄师姐的路来传。一个实验室能传承下去，很多时候就是一代一代同门人这么传下来的。如果不幸，作为开门弟子，没有师兄师姐怎么办？这时候就是发挥个人能力最好的机遇。多问，多想，多看，多学，总会是有收获的。我现在给实验室建一个新技术，在体多通道记录，难度很大，没可以学的，我就创造机会去学。比如我跟仪器公司联系，推荐了我去一个非常好的实验室学习观摩，我没有经过我导师，直接联系了对方教授，他非常慷慨答应了。然后我老板后来听说了之后，也非常开心，也答应给我报销air tickets和accomodation. 虽然我有一些多通道记录的经验了，但是对于人家，我还是菜鸟。所以我还是不停地学，记录，问，看，问，看，任何能学到的细节，我都记下来。然后等我回来，再做手术再记录，果然结果好很多很多，基本上所有通道都能记录到很清晰的spikes了。这是以我自己的经验，告诉大家，多看，多问，多学，多想，多记，是有多么的好处。再次感谢王版主！
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@甲醛，这个心态很好，比较乐观。
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土豆家 @甲醛，这个心态很好，比较乐观。 呵呵，你@的不对呢！应该这样@
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谁人知1989 请问版主，楼主问的用什么擦PBS呢？新手不好意思…… 剪成小方块的滤纸。原则就是擦干净，普通的卷纸也行。
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剪成小方块的滤纸。原则就是擦干净，普通的卷纸也行。谢谢版主！我的意思是问的用pbs冲洗后加抗体前，直接用滤纸擦吗？谢谢实验室没有做类似技术的师兄师姐，只能看看网上视频+dxy前辈的经验……
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丁香园助理版主
谁人知1989 谢谢版主！我的意思是问的用pbs冲洗后加抗体前，直接用滤纸擦吗？谢谢实验室没有做类似技术的师兄师姐，只能看看网上视频+dxy前辈的经验……吸水纸从边角吸干液体即可，勿擦！
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qq 吸水纸从边角吸干液体即可，勿擦！谢谢！
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受点儿“打击”也是好的 更何况这么温柔的拳头 都快成了娇嗔了Ps: 是两年前的帖子 你是多么挖坟般地认真呀
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杏林bf橘井
受点儿“打击”也是好的 更何况这么温柔的拳头 都快成了娇嗔了Ps: 是两年前的帖子 你是多么挖坟般地认真呀因为我在园子和虫子里受到了很多人的帮助啊
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