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白介素6类细胞因子对成人成肌细胞增殖和分化影响的实验研究
白介素6类细胞因子家族，调控着细胞的分化、存活、凋亡和增殖，参与多种复杂的细胞过程如抗炎、造血和神经分化等，是一类重要的细胞因子。白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)和睫状神经营养因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)是其中较重要的三种因子，它们对于血液系统和神经系统的影响已经被广泛研究，但在人源成体成肌细胞的增殖和分化中的作用还未见报导。而成肌细胞做为一种能够提供丰富细胞来源的细胞群体，除了在肌肉萎缩等疾病中有重要作用外，由于它们可以自体取材，因此在以神经细胞变性为特征的中枢神经系统退行性疾病如帕金森病中，也具有较大的应用价值。
我们研究所前期的工作已经证实，一定浓度的CNTF可以抑制成肌细胞向成熟骨骼肌分化，而形成具有向多种细胞类型包括神经元分化潜能的更加原始的干细胞。因此，在本实验中，将应用IL-6、LIF和CNTF三种因子处理成人骨骼肌来源的单克隆化的成肌细胞，观察并比较三种因子对成人成肌细胞增值和分化的影响，并初步探讨它们的作用机制，以证实这些细胞因子是否是一类新的成肌细胞增殖和分化调控分子。同时进行成人成肌细胞脑移植的初步实验，验证成肌细胞做为中枢神经系统疾病移植治疗的替代细胞的可能性。
1、原代培养成人成肌细胞体外增殖、传代、冻存与复苏连续贴壁法筛选获得的成人成肌细胞纯度不高，多混杂有成纤维细胞的干扰；应用96孔培养板进行的细胞单克隆化，使成肌细胞纯度明显增高，成肌细胞标志蛋白—结蛋白(Desmin)染色结果表明，由此获得的成肌细胞是Desmin阳性、纯度一致、稳定的细胞群体。
2、IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞增殖的影响细胞增殖曲线和流式细胞术检测结果稍有不同，总结两种方法进行的细胞增殖研究，可明确10ng/mlLIF能够明显促进成人成肌细胞的增殖。而IL-6和CNTF的作用不确切。
3、IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞分化的影响肌管融和实验表明，10ng/ml、50ng/ml的LIF和10ng/ml、50ng/ml的CNTF能够抑制成人成肌细胞在分化条件下向成熟肌管的分化，而IL-6没有此抑制作用。与对照组相比，LIF和CNTF在一定浓度下可抑制成肌细胞分化标志蛋白myosin和myogenin的表达。对调控成肌细胞成熟分化的转录因子MyoD/Myf5表达的检测，表明LIF和CNTF可抑制MyoD和Myf5的表达。
4、成人成肌细胞移植后在脑内的存活、迁移和分化成人成肌细胞移植入正常大鼠纹状体中，可以存活，但存活率较低，分化能力较差，不能分化形成神经元和胶质细胞，而仍表达成肌细胞标志抗原MyoD，维持原有的成肌特性。
结论：本研究首次比较了IL-6类细胞因子家族中IL-6、LIF和CNTF细胞因子，对来源于成人骨骼肌组织的单克隆化的成肌细胞增殖和分化的影响，证实10ng/mlLIF可明确地促进成人成肌细胞的增殖，10ng/mlLIF、50ng/mlLIF、10ng/mlCNTF以及50ng/mlCNTF可抑制成人成肌细胞的分化。选取抑制作用较强的LIF(10ng/ml)和CNTF(50ng/ml)浓度进行机制研究，结果提示，LIF和CNTF可能通过抑制调控成肌细胞分化的转录因子MyoD/Myf5的表达，从而抑制成肌细胞向成熟肌管的分化。成人成肌细胞脑内移植实验的初步结果表明，未在体外进行去分化诱导的成肌细胞不能在脑内微环境下向神经细胞分化，提示成肌细胞并不具备多向分化的潜能。本研究为成人成肌细胞的基础和临床应用研究提供了一定的实验和理论基础。
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万方数据电子出版社细胞因子、生长因子 提供重组蛋白高纯度及高活性细胞因子
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&细胞因子、生长因子 提供重组蛋白高纯度及高活性细胞因子&的 详 细 说 明
MPBIO各类细胞因子重组蛋白 ――-美国MPBIO 产品概述： 细胞因子（cytokine,CK）是指有免疫细胞（如单核-吞噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（如血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白。 优点： 重组蛋白 高纯度 高活性 低内毒素 人，小鼠，大鼠 按功能分，可分为以下几种： 1.白细胞介素（Interleukin，IL） 由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由白细胞产生且又在白细胞间发挥作用，所以得名，现仍沿用此名。 2.干扰素（interferon，IFN） 具有干扰病毒复制的能力，故得名。其具有十分广泛的生物活性，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用，也是主要的促炎细胞因子之一。干扰素分为：I型（7种，如IFN-α和IFN-β）和II型（仅有IFN-Y） 3.肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF） 由于在体内外均可直接杀伤肿瘤细胞而得名。其家族成员约有30个。 主要成员： 1）& TNF-α，一种单核因子主要由单核细胞和巨噬细胞产生 2）& TNF-β，一种淋巴因子，主要由淋巴细胞、NK细胞等产生，其生物学活性与TNF-α相类似 4.集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF） 一组在体内外均可选择性刺激造血祖细胞增殖、分化并形成某一谱系细胞集落的细胞因子，包括巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、巨噬细胞/粒细胞CSF、干细胞因子等。 5.生长因子（growth factor，GF） 一类可介导不同类型细胞生长和分化的细胞因子，根据其功能和所作用细胞的不同，分别命名为转化生长因子（TGF）、神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等。 6.趋化性细胞因子（chemokine） 一类对不同靶细胞具有趋化效应的细胞因子家族，可由白细胞和某些组织细胞分泌，是一个包括60多个成员的蛋白质家族。大部分成员含4个保守的半胱氨酸（cysteine，C）根据其N端半胱氨酸的排列方式，可分为CXC、CC、C、CX3C四个亚族。 & & 厂家说明： MP Biomedicals生物医学公司是位于美国加利福尼亚州的知名生命科学和生物技术厂商。2004年底成功收购Qbiogene、ICN，现在全球有5个大型仓库，能够及时供应各行业需求，亚洲仓库位于新加坡。它致力于生命科学领域的基础研究和探索。目前它提供55000多种产品，是世界上能全面提供生命科学产品和临床诊断产品的几家厂商之一。 北京毕特博生物技术有限责任公司是此美国MPBIO的代理商，同时经营此品牌已有几年的历史了。 & & & & 具体产品信息，欢迎来电或来邮咨询！ & 北京毕特博生物技术有限责任公司 颜小姐 电话：010- 传真：010- QQ： 邮箱：yyy_ly@126.c o m 网站：www.bitebo.c o m &
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细胞因子对培养的人视网膜色素上皮&细胞胶原合成的影响
来源：青年人()&更新时间： 19:20:00 &【字体： 】
　　【摘要】　目的　观察转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)和干扰素γ(interferon-gamma,IFN-γ)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)胶原合成的影响。　方法　用3H-脯氨酸掺入、免疫细胞化学及分子杂交技术观察TGF-β和IFN-γ分别及联合作用下培养的人RPE胶原合成活性。　结果　TGF-β在10 ng/ml浓度使RPE对3H-脯氨酸的摄取增加130．87％，并增强Ⅳ、Ⅰ和Ⅲ型胶原荧光染色和mRNA表达。IFN-γ在10 000　U/ml浓度抑制54．72％的脯氨酸摄取，并减弱Ⅳ型胶原染色和3种胶原的mRNA表达。　结论　TGF-β和IFN-γ对RPE的胶原合成分别具有正向及负向调控作用，IFN-γ可能用于抑制RPE胶原合成。　　【关键词】　生长物质　　干扰素Ⅱ型　　色素上皮，眼　　胶原/生物合成　　细胞，培养的　　中国图书资料分类法分类号　R329．2-33
Effects of cytokines on collagen synthesis in human retinal pigment epithelial cells
FENG Xuefeng,HUI Yannian, WANG Yusheng．Department of Ophthalmology,Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xian 710032,China
　　【Abstract】　Objective　To investigate the effects of transformin growth factor-beta (TGF-β) and interferon-gamma(IFN-γ)on collagen synthesis in human retinal pigment epithelial cells(RPE)．　Methods　TGF-β(0．01～-10　ng/ml),recombinant IFN-γ(100～-10　000　U/ml)or a combination of two were added to cultures of RPE and collagen synthesis of the cells were measured by 3　H-proline incorporation assay,indirect immunofluorescence staining and dot-blot hybridization．Results　TGF-β at 10 ng/ml increased cell uptake of 3　H-proline to 130．87% of controls．It intensified Type IV,I and Ⅲ collagen fluorescent staining as well as mRNA expression．IFN-γ　at 10　000　U/ml caused 54．72% inhibition of 3　H-proline uptake by RPE,and decreased TypeⅣ collagen fluorescent staining as well as mRNA expression of Type Ⅳ,I and Ⅲ collagens．　Conclusion　TGF-β　and IFN-γ stimulated and inhibited collagen synthesis of human RPE,respectively．The combination of two had antagonistic effects．IFN-γ can be used for inhibition of collagen synthesis of RPE．　　【Key words】　Growth substances　　Interferon typeⅡ　　Pigment epithelium of eye　　Collagen/biosynthesis　　Cell,cultured
　　视网膜色素上皮细胞在增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)、创伤修复等眼病中能够增生、合成及分泌细胞外基质，使组织纤维化和形成瘢痕，但有关细胞外基质的产生和调节机制还不甚了解［1］。胶原是细胞外基质的主要成份。本实验采用RPE体外培养方法，通过3H-脯氨酸掺入、免疫细胞化学及分子杂交技术，观察TGF-β和IFN-γ对培养的人RPE胶原合成的影响。
1　材料与方法1．1　主要试剂　TGF-β(牛血小板提取纯化，纯度大于90%)由第四军医大学口腔病理科金岩惠赠。人重组IFN-γ为上海生物制品研究所产品。3H-脯氨酸为中国原子能研究所产品。鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体为美国Sigma产品，兔抗人Ⅲ型和Ⅰ型胶原多克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品。人Ⅰ型前胶原α1(Ⅰ)cDNA探针JM16，插入片段长4．6人Ⅲ型前胶原α1(Ⅲ)cDNA探针S413，插入片段长4．5鼠Ⅳ型前胶原α1(Ⅳ)cDNA探针PE123，插入片段长1．8kb，均由中国预防医学科学院劳卫所制备。1．2　RPE培养与鉴定　从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球，于死亡后12小时内进行分离和培养［2］。用鼠抗人角蛋白单克隆抗体作细胞鉴定。选3～6代细胞用于实验。1．3　3H-脯氨酸掺入实验　将已铺满的RPE(96孔板)分为4组，每孔分别加入200 μl、5%小牛血清DMEM液，其中含维生素C　100 μg/ml及不同浓度的TGF-β(0．01,0．1,1和10，单位　ng/ml)，IFN-γ(100，500，1 000和10 000，单位U/ml)以及TGF-β(10　ng/ml)+IFNU-γ(10 000U/ml)(两种因子单用时的最大作用浓度联合)，和空白对照。培养24小时后，同上换液，每孔加入2 μCi、3H-脯氨酸，继续培养24小时。收集细胞于F4玻璃纤维滤纸。自动液闪计数仪测定样品放射性CPM值。每个浓度设4孔。实验重复3次。1．4　Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原免疫细胞化学染色　RPE培养于盖玻片上至细胞铺满。然后按分组分别换成10%小牛血清DMEM培养液含维生素C　100 μg/ml及TGF-β(10 ng/ml)，IFN-γ(10 000　U/ml)或TGF-β(10 ng/ml)+IFN-γ(10 000　U/ml)，并设空白对照。48小时后捞出盖玻片，PBS漂洗，自然干燥。作常规间接免疫荧光染色。以正常人皮肤成纤维细胞为阳性对照，阴性对照组以PBS替代一抗。荧光显微镜观察与照相。1．5　Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原mRNA的表达　细胞样品制备及总RNA的提取：将培养铺满的RPE(200 ml培养瓶)根据实验分组换液。培养24小时，收集细胞，用异硫氰酸胍法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测样品OD260，OD280值，计算样品RNA浓度和纯度。dot-blot杂交：RNA样品变性、打点(每点4　μg)于硝酸纤维素膜上，80℃烘烤2小时。采用缺口平移法标记α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅳ)三种cDNA探针。杂交，洗膜，室温干燥，暗室中压上X光胶片，－20℃曝光3天，冲洗观察结果。1．6　统计学处理　结果以±s表示，作t检验。
2　结果2．1　培养人RPE的生长及鉴定　原代培养的人RPE呈六边形和多边形，胞浆内充满黑色素粒，传3代色素基本消失。免疫细胞化学染色显示细胞浆内呈特异性棕褐色网状阳性染色。2．2　3H-脯氨酸掺入实验　随TGF-β浓度增加，RPE对脯氨酸掺入CPM值逐渐增加，10 ng/ml时，为对照的130．87%。随IFN-γ浓度增加，CPM值逐渐下降，10 000 U/ml时，为对照的54．72%(P＜0．01)。而联合作用组与TGF-β(10 ng/ml)作用组相比，CPM值明显下降(P＜0．01)，接近对照组(表1)，说明与IFN-γ共同作用时，TGF-β的作用几乎不能显示。
表1　TGF-β和IFN-γ对RPE细胞3　H-脯氨酸掺入CPM值的影响Tab．1　Effects of TGF-β and IFN-γ　on collagen synthesis(CPM values,uptake of 3　H-proline)of retinal pigment epithelial cells
CPM value(±s）
TGF-β-treated　ng/ml
IFN-γ-treated　μg/ml
TGF-β　combined with IFN-γ
　0．0094**
　?compared to controls　**　compared to cells treated with TGF-β
at the same dosage2．3　Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原免疫细胞化学染色　空白对照组，Ⅰ和Ⅲ型胶原阳性反应类似，均呈黄绿色、细颗粒状，位于胞浆核周，细胞之间的染色强度不一致(图1，2)；Ⅳ型胶原胞浆内呈弱荧光，细胞外呈稀疏细网状分布(图3)。与空白对照组相比，TGF-β作用组：Ⅰ和Ⅲ型胶原着色强度及范围增加(图4，5)；Ⅳ型胶原在细胞外呈浓密网状结构(图6)。IFN-γ作用组，Ⅰ、Ⅲ型胶原染色无明显改变，而Ⅳ型胶原呈阴性(图7)。联合作用组的Ⅰ、Ⅲ型胶原在细胞内着色强度略有减弱，Ⅳ型胶原呈阴性。阳性对照片细胞外可见Ⅰ、Ⅲ型胶原呈网状及致密团块状(图8)，阴性对照未见荧光染色(图9)。
图1　对照组RPE细胞Ⅰ型胶原免疫荧光染色，核周胞浆阳性(黑箭头) 　×400　图2　对照组RPE细胞Ⅲ型胶原免疫荧光染色，核周胞浆阳性(白箭) 　×400　图3　对照组Ⅳ型胶原免疫荧光染色，细胞外稀疏网状着色(黑箭头)　×400　图4　TGF-β处理组RPE细胞Ⅰ型胶原免疫荧光染色，胞浆内强阳性(白箭)　×400Fig．1　Immunofluorescence staining for type I cllagen produced by retinal pigment epithelial cells (RPE) in controls showing positve reaction in the cytoplasm near the nucleus(black　arrowhesds)　×400　Fig．2　Immunofluorescence staining for type Ⅲ collagen produced by RPE in controls showing positive reaction in the cytoplasm near the nucleus(white arrow)　×400　Fig．3　Immunofluorescence staining for type Ⅳ collagen produced by RPE in controls showing fine net positive reaction in the intercellular matrix(arrowheads)　×400　Fig．4　Immunofluorescence staining for type I collagen produced by RPE treated with TGF-β showing strong positive reaction in the cytoplasm(white arrow)　×400
图5　TGF-β处理组RPE细胞Ⅲ型胶原免疫荧光染色，胞浆内强阳性(白箭)　×400　图6　TGF-β处理组RPE细胞Ⅳ型胶原免疫荧光染色，细胞外浓密网状着色(白箭)　×400　图7　IFN-γ处理组RPE细胞Ⅳ型胶原免疫荧光染色，细胞内、外均为阴性　×400　图8　阳性对照组(正常人皮肤成纤维细胞)Ⅲ型胶原免疫荧光染色，细胞外网状及团块状着色(黑箭)　×400　图9　阴性对照组，细胞内背景色　×400Fig．5　Immunofluorescence staining for type Ⅲ collagen produced by RPE treated with TGF-β showing strong positive reaction in the cytoplasm(white arrow)　×400　Fig．6　Immunofluorescence staining for type Ⅳcollagen produced by RPE treated with TGF-β showing dense poistive reaction in the intercellular matrix(white arrow)　×400　Fig．7　Immunofluorescence staining for type Ⅳ collagen produced by RPE treated with IFN-γ showing negative reaction in or outside of the cell　×400　Fig．8　Immunofluorescence staining for type Ⅲ collagen in positive controls(normal human skin fibroblast cells)showing net or dense positive reaction in the intercellular matrix(black　arrow)　×400　Fig．9　Negative controls show background staining in the cell　×400
2．4　Ⅰ、Ⅲ型和Ⅳ型前胶原mRNA的表达　dot-blot杂交显示，TGF-β不同程度地增加3种同位素标记的前胶原探针与RPE总RNA的阳性杂交信号，而IFN-γ不同程度地减弱杂交信号，且均以Ⅳ型前胶原最明显。联合作用组的阳性杂交信号接近对照组(图10)。
图10　TGF-β和IFN-γ处理组RPE细胞总RNA与Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型前胶原α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅳ)cDNA探针斑点杂交Fig．10　Dot-blot hybridization for total RNA of retinal pigment epithelial cells(RPE) treated with TGF-β　and IFN-γ with cDNA probes for procollagen type I α1(Ⅰ)，Ⅲα1(Ⅲ)and Ⅳ α1(Ⅳ)
3　讨论　　人Bruch膜及RPE周围有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原，表明活体RPE可以合成胶原。体外培养的人RPE也可合成Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原［3］。本实验结果与文献一致，证实RPE有合成以上3种胶原的活性。胶原在炎症、创伤愈合及纤维化中起重要作用，是PVR增生膜的主要成份，参与膜收缩，对RPE能趋化并刺激增生［4］。胶原合成受细胞因子调节。在PVR，玻璃体中可测得较高水平的TGF-β，且与病变严重程度相一致。眼内注射TGF-β也可诱发PVR［5］。PVR眼玻璃体及视网膜下液中亦可测到IFN-γ［6］。TGF-β被认为是重要的促纤维化因子(fibrogenic cytokine)。而IFN-γ是为数不多的抑制胶原沉积的细胞因子。　　在本实验中，TGF-β刺激RPE合成胶原蛋白，主要表现在Ⅳ型、及Ⅰ和Ⅲ型胶原上，且呈剂量依赖性，这说明TGF-β是RPE合成胶原的重要刺激因子。Ⅰ、Ⅲ型胶原是PVR增生膜的重要成分，其沉积与膜的成熟和张力形成有关。Martini等［7］培养RPE显示细胞外Ⅰ、Ⅲ型胶原染色阳性，Ⅳ型强阳性，25%玻璃体加5%血清可使Ⅰ型胶原着色明显增强。但本实验未见Ⅰ和Ⅲ型的细胞外分泌，这可能与细胞来源和实验条件的差异有关。玻璃体内含有促RPE表型改变的固有因子，在血清成份的作用下被激活，推测在TGF-β和玻璃体共同作用下，RPE表型改变，使胶原(Ⅰ、Ⅲ型)合成及分泌增加［8］。细胞因子对胶原合成的调控机制有二，一是直接影响基因转录加工或翻译；二是间接通过影响胶原酶活性调节胶原降解。文献报告TGF-β对胶原合成的刺激作用是通过转录水平调节的，与激活α　2(Ⅰ)胶原基因上的核因子Ⅰ位点有关［9］；TGF-β还可以增加胶原mRNA的稳定性。本实验显示TGF-β可增加Ⅰ、Ⅲ型和Ⅳ型胶原mRNA的表达，提示它是在转录水平调控RPE的胶原表达。　　本实验还证实IFN-γ通过抑制RPE摄取脯氨酸而抑制其合成胶原。在10 000　U/ml时，IFN-γ对RPE摄取脯氨酸的抑制率约为45．28%，免疫荧光染色显示它对Ⅳ型胶原的抑制作用最强。推测IFN-γ对TGF-β的功能可能有负性调节作用，阻止过度愈合。本实验还显示IFN-γ能分别降低Ⅰ、Ⅲ型和Ⅳ型胶原mRNA的表达，与文献报道一致［10］。文献及我们的研究还显示IFN-γ对RPE增生有抑制作用。IFN-γ对RPE生物活性的多重作用，使其有可能成为辅助治疗PVR的药物。IFN-γ作为一种天然的免疫调节多肽，全身及局部应用毒副作用小，PVR术前或术后局部应用IFN-γ可能抑制过度修复反应，并且避免全身毒副作用。　　总之，本实验表明，在体外TGF-β和IFN-γ可以分别促进和抑制RPE合成胶原蛋白，并在转录水平调节Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原的合成。提示在体内TGF-β和IFN-γ分泌的不均衡可能是眼内组织创伤修复及纤维化的重要因素。提供IFN-γ可能对PVR有防治作用。
本课题受国家自然科学基金资助，基金号作者单位：710032西安，第四军医大学西京医院眼科［冯学峰（现在西安医科大学第一临床医学院眼科）］
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不同细胞因子组合对人自然杀伤细胞体外高纯度扩增的实验研究
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