PCR pcr产物纯化可否直接进行连接转化

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那位高手帮忙指点下,我要构建一个产酶的基因工程菌,目的片段通过也能扩增出来,在引物设计时也都引入了酶切位点。我的方法是先与T载体连接,转入DH5a, 筛选出阳性子提取质粒酶切,再与表达载体Pet30连接,转入BL21进行表达,筛选出阳性表达子。我的问题是能否将PCR产物直接酶切与表达载体连接转入BL21,省去与T载体连接。谢谢!
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我觉得可以,只是很难,我最近一直在做这个,后面双酶切就是不行,现在就想先连进T载体,可是不知道怎么回事,转化后提取质粒再双酶切就是切不出来,郁闷!
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2010大海000
& & 一般可以,但前提是你的克隆引物前要有保护碱基,这样才比较好切。
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你用的是啥菌株,啥酶啊。
像TOP10那样的菌甲基化比较严重
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&&嗯,我的是DH5α啊,EcoRI和SalI双酶切
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连T最重要的目的是要保存基因,如果直接转pET20没问题,但如果中间有困难,返回头来还需要重新PCR,回收纯化。因此连T的步骤可以省,但非常有必要。
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pcr以后TAQ酶会在末端添加一个A,做T连接更容易连接上
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当酶切的位点在dna片段的末端时,酶切的效率很低,这时可以先给它连个t载体,或者设计引物时,在酶切位点外侧加几个碱基(所谓的保护碱基,3~5个?)这样酶切效率就不会降低了。
我没做过,上面的内容是以前在某个地方看到的,忘记具体内容了。也许可以去找takara的限制酶说明书看看。
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TA克隆中连接产物为什么不能直接PCR想知道16SrRNA基因全序列,为什么不能把用通用引物扩增出的产物连到T载体后直接进行PCR,而要转化到大肠中,筛选出转化子之后再扩增呢?
shfkieyrn01077
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连接产物产量少 大肠杆菌转化后提高产量 还可以保存连接后这一步的实验结果 如果要重复 直接提质粒就行 不用再次酶切 连接
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pcr产物不纯化直接酶切连接可以吗?PCR反应的buffer会不会对酶产生影响哦~
蛇蝎美人°FL1
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这个是可以的,只是效率不高
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可以,我这样做过
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我觉得不可以,PCR产物不是单一克隆比较杂,一般都是先与t连接测序正确后挑单克隆再与表达载体相连
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一般来说是可以直接酶切连的,但是要看你的DNA片段两端的酶切位点,例如XbaI&&SalI 等酶切位点直接酶切连效果很差,需要先连T载体。
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学习了!可是我做双酶切一直没切开质粒DNA,是不是酶切位点有问题!
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不可以,PCR后碱基可能会变异,连T载体是为了测序,正确后,才可连接
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标准的说不可以,连T载体后要酶切测序,保证序列正确才可以转入表达载体。
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jinzhuping 发表于
连T最重要的目的是要保存基因,如果直接转pET20没问题,但如果中间有困难,返回头来还需要重新PCR,回收纯化 ...
您好,我最近做原核表达,表达载体为PET28a,双酶切完了连接,然后转化,涂板,长出很多菌,但是PCR均没有阳性,做了几次都是这样,不知道是原因,您能帮忙分析一下嘛?
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理论上可以。你用的是高保真的酶做PCR吗,没有考虑过测序保证P出的片段错配的问题?
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经过PCR扩增后,可能会存在非特异性扩增,直接连表达载体不一定获得所需要的表达载体,连接T载体方便进行测序,还有保存基因
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