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基因敲除小鼠的PCR鉴定
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3秒自动关闭窗口来源：《实验动物科学》2012年第01期 作者：乔录新;徐萌;柴梦音;乔欣;陈德喜;
p53基因敲除小鼠的饲养繁殖及鉴定
p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因之一,有研究显示,人类大约一半的肿瘤发生与p53基因异常有关,因此p53基因的相关功能成为当前肿瘤分子生物学研究的热点[1,2]。p53蛋白介导的细胞凋亡通路是人类肿瘤发生过程中最常改变的通路。该通路中p53蛋白发挥细胞周期调控和DNA修复功能,在肿瘤调控机制中发挥着重要的作用[3,4]。目前对于此方面的体外研究大多在各种p53基因缺失细胞中进行,虽然具有很好的效果,但是在模拟体内环境方面仍有不足,因此,我们于2007年从美国匹斯堡大学引进p53基因敲除小鼠杂合子,在首都医科大学实验动物部SPF级动物实验室饲养繁殖,经基因鉴定成功培育p53基因敲除小鼠,为深入研究肿瘤疾病提供了动物模型。1材料和方法1.1实验动物美国匹斯堡大学医学院Charles Lopez教授惠赠10对p53基因敲除杂合子小鼠(p53+/-)。该小鼠遗传背景为BALB/c小鼠,近交系。1.2小鼠的饲养和繁殖按照SPF级动物饲养标准进行饲养,屏障环境内温度控制在20～25℃,湿度控制在40%～70%,小鼠饲料、垫料和饮水均经过高温高压灭菌处理,......(本文共计3页)
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实验动物科学
主办：北京实验动物研究中心;北京实验动物学学会;北京市实验动物管理办公室
出版：实验动物科学杂志编辑部
出版周期：双月
出版地：北京市基因敲除小鼠技术简介_基因敲除吧_百度贴吧
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基因敲除小鼠技术简介
目前．比较广泛应用的基因敲除动物主要是基因敲除小鼠．因为基阒敲除技术基于完善的系统和胚胎重建技术。人类几乎所有的疾病都与基因有关，基因敲除动物模型的建立，为研究人类疾病提供了一个崭新方法。尤其是遗传性疾病。通过基因敲除动物，能够通过表型变化，生理指标检测等直接分析被敲除基因的功能。
仁源生物基因敲除技术国际领先,专业提供基因敲除小/大鼠,细胞系等定制化服务
基因敲除又称(gene targeting)，是通过外源DNA与染色体DNA之间的，精细地定点修饰和改造基因DN**段的技术。它是于20世纪80年代后半期在技术和同源重组技术基础上发展起来的．具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点．目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。2007年授予了来自美国的Mario R．Capecchi、Oliver Smithies和来自英国的Martin J．Evans。他们因利用技术使小鼠体内的特定基因失去活性，培育出研究价值极高的“基因敲除小鼠”而获此殊荣。评审委员会在新闻公报中说到：“今年的奖项所涉及的发现引领人们掌握了一个无比强大的研究武器”。在生物、医学等各方面的研究中．模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型．从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。其中最具代表性的应用就是在人类疾病动物模型方面的应用，人类的很多疾病，都是由基因决定的．构建相应的基冈敲除动物模型，对人类疾病的研究来说不失为一个好方法。
迄今为止,基因敲除技术已经帮助人们构建了数百个人类疾病的小鼠模型，包括、神经退化性疾病、、癌症等小鼠模型。通过对这些模型的研究．可以找到相关疾病的潜在治疗靶点。预计在不久的将来，有可能完成小鼠所有基因的敲除实验．来研究不同基因在生命活动中所扮演的具体角色。
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【求助】基因敲除小鼠如何鉴定分型
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这个帖子发布于4年零297天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我用的是IL-10基因敲除小鼠，查文献提供的鉴定引物是IL-10MU-R: CCA CAC GCG TCA CCT TAA TA IL-10WT-R: GTT ATT GTC TTC CCG GCT GT IL-10Common: CTT GCA CTA CCA AAG CCA CA如何利用PCR进行分型呢？+/+，-/-，+/-？请求详细介绍，谢谢
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-/- = 312 bp+/- = 137 bp and 312 bp+/+ = 137 bp 1.5%的琼脂糖凝胶电泳
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Reaction ComponentVolume (?l)Final ConcentrationTotal Volume (?l)ddH2O3.36- 3.3610 X AB PCR BufferII1.201.00 X1.2025 mM MgCl20.962.00 mM0.962.5 mM dNTP0.960.20 mM0.9620 uM oIMR95730.601.00 uM0.6020 uM oIMR95740.601.00 uM0.6020 uM oIMR73760.601.00 uM0.605 mM DNA Loading Dye1.660.69 mM1.665 U/ul Taq DNA Polymerase0.060.03 U/ul0.06DNA2.00- 2.00Step #Temp °CTimeNote1943 min- 29430 sec- 3641 min- 4721 minrepeat steps 2-4 for 35 cycles5722 min- 610- hold反应体系反应条件
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谢谢，这个PCR是在一个体系中把3个引物都加进去吧？另外我还有个很弱的问题，因为这是敲除小鼠，到底+/+是代表IL-10敲除了还是-/-代表IL-10敲除了？
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-/-是敲掉的。
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请问您IL-10基因敲除小鼠能引种吗？有没有生殖能力啊？
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正好有相同的问题，非常感谢
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tuobi 师兄，您这个做的是qPCR吗？我也在养基因敲除小鼠，就想问问基因过表达小鼠也是用qPCR方法检测吗？涕零啊！！！
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ls,如果是Ko鼠，就是脚趾或尾巴等，抽基因组，然后普通pcr,电泳即可。不用qpcr过表达的，我们手上有个mir181a的转基因鼠，可以用TaqMan PCR
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TurboKnockout基因敲除小鼠
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TurboKnockout基因敲除小鼠
TurboKnockout&基因敲除是TetraOneTM技术的升级版，建立在传统基因打靶技术之上，不仅具有传统ES打靶技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点，更是使得传统ES打靶技术减少两代繁育时间，制作周期缩短至仅需6个月。在核酸酶技术（TALEN/Cas9）尚未成熟之前，TurboKnockout&技术将是研究者最佳的选择。
传统ES打靶基因敲除：
传统ES打靶基因敲除因嵌合体阳性率较低，并且需要与工具鼠交配才能获得删除Neo的杂合子，因此构建周期长达10-12个月。如何跨越&嵌合体&阶段并自删除Neo以减少两代繁育时间，才是真正快速的关键。
升级前的TetraOneTM：
实现跨越&嵌合体&阶段
基于ES打靶的TetraOneTM技术，是采用了独特的建系和基因改造技术建立了具有高效遗传优势的TetraOneTM ES细胞系，通过特定胚胎发育阶段的显微注射，使TetraOneTM ES细胞100%代替内源ES细胞，从而实现跨越&嵌合体&阶段，把ES打靶构建周期短至6-8个月。
升级后的TurboKnockout&：
实现跨越&嵌合体&阶段且自删除Neo，减少两代繁育时间
升级后的TetraOneTM即TurboKnockout&，采用独特的Self-deleting Neo Cassette所获得的嵌合体与任何品系小鼠交配，都可100%自删除Neo。也就是说，TurboKnockout&不仅仅实现跨越&嵌合体&阶段，还能真正自删除Neo从而快速获得去Neo的杂合子小鼠。
TurboKnockout&技术对比：
TurboKnockout&
TetraOneTM
传统ES打靶
跨越&嵌合体&阶段
实现自删除Neo
TurboKnockout&技术优势：
1、基因修饰准确、效果稳定；
2、没有脱靶效应，可胜任复杂的基因敲除；
3、自删除Neo可进一步缩短服务周期，简化了小鼠交配流程。
&服务周期对比
ES细胞品系：C57BL/6N
TurboKnockout&基因敲除小鼠模型
完全性基因敲除是通过基因敲除技术，把需要敲除目的基因的所有外显子或几个重要的外显子或者功能区域敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。
& 应用 用于研究某个基因（要求该基因非胚胎致死性基因）对全身生理病理的功能。
建系原则与流程
1、去除抗性基因 Neo：选择阳性TurboKnockout小鼠与野生型小鼠杂交，获得去除打靶载体中的 Neo 基因的F1 代杂合子KO（+/-）；
2、再挑选一对F1 代杂合子KO小鼠进行自交，通过 PCR 鉴定筛选得到去除Neo的纯合子KO小鼠（-/-）。
条 件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个loxP位点的TurboKnockout-floxed小 鼠，TurboKnockout-floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，目的基因表达完全正常；而当TurboKnockout-floxed小鼠与组织特异性表 达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其它组织或细胞表达正常。
1、用于具有胚胎致死性目的基因的研究；
2、用于研究基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能；
3、与控制Cre表达的其它诱导系统相结合，还可以对某一基因的表达同时实现在时间和空间两方面的调控。
建系原则与流程
1、与Cre小鼠杂交：TurboKnockout-floxed小鼠与组织特异性的Cre小鼠杂交，获得去除Neo抗性且单条染色体有缺失的阳性F1代组织特异性cKO杂合子小鼠（+/-）；
2、挑选一对F1 代小鼠进行自交， 通过 PCR 鉴定筛选得到组织特异性去除基因的F2代cKO纯合子小鼠（-/-）。
基 因敲入可以在目的基因位置引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型) ；或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟 踪目标基因的表达。也可以用报告基因取代小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。
1、用于药物筛选相关研究；
2、用于信号通路的研究；
3、用于示踪的相关研究。
建系原则与流程
1、去除抗性基因 Neo：选择阳性TurboKnockout KI小鼠与野生型小鼠杂交，获得去除打靶载体中的 Neo 基因的杂合子F1 代小鼠；
2、再挑选一对杂合子F1 代小鼠进行自交，通过 PCR 鉴定筛选得到去除Neo的F2代纯合子KI小鼠。
服务于辉瑞、阿斯利康、恒瑞医药等知名药企
人 源化小鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的小鼠模型。这种模型通常被用于人类疾病体内研究(in vivo study)的活体替代模型。由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上。比如， 有些利用小鼠等动物模型开发 的药物在人体上并没有效果。所以，利用转基因或同源重组的方法，将人类基因&放置&在小鼠模型上所制备的人源化小鼠模型，大大提高了这类小鼠模型作为模拟 某些人类疾病的有效性。
应用 1、在艾滋病、癌症、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有广泛的应用； 2、药物临床前模拟实验。
KO-First技术是通过在内含子中插入一个两边带有FRT位点的基因破坏盒来达到敲除的目的，这个破坏盒含有Splice acceptor，报告基因和Neo。除此之外，在目的基因敲除的外显子两侧各插入两个LoxP位点。因此得到的小鼠是目的基因敲除同时敲入报告基因与抗性基因的小鼠。通过灵活选择和Flp/FRT重组系统和Cre/LoxP重组系统，可达到同时获得完全性敲除和条件性敲除的实验目的。即当该小鼠与Flp小鼠交配时，可还原已敲除基因的表达，获得基因条件性敲除小鼠，在此基础上Cre小鼠交配又可获得目的基因敲除小鼠。