求助：瞬时转染和稳定转染步骤

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-01-04 02:14 标签： 细胞稳定转染
shRNA表达载体是瞬时转染还是稳定转染(转染,瞬时转染,表达载体,动物模型) - DNA技术 - 生物秀
标题: shRNA表达载体是瞬时转染还是稳定转染(转染,瞬时转染,表达载体,动物模型)
摘要: [shRNA表达载体是瞬时转染还是稳定转染(转染,瞬时转染,表达载体,动物模型)] 请问shRNA表达载体是瞬时转染还是稳定转染呢，我之前做的是siRNA的瞬时转染，之后想做稳定转染，建立动物模型(Animal Models)，构建了这个载体，是带有绿色荧光的，但是我不确定这个质粒的转染是瞬转还是稳转，请大家帮忙指点一下，谢谢 关键词:[转染 瞬时转染 表达载体 动物模型 不确定 质粒 载体]……
请问shRNA表达载体是瞬时转染还是稳定转染呢，我之前做的是siRNA的瞬时转染，之后想做稳定转染，建立动物模型(Animal Models)，构建了这个载体，是带有绿色荧光的，但是我不确定这个质粒的转染是瞬转还是稳转，请大家帮忙指点一下，谢谢
回复质粒转染的的效果一般不会超过2周，但是可以加药制备未定表达的细胞株回复但是我构建的这个载体是有卡那霉素抗性的，产品的形态是质粒DNA溶液，不知道这个算是什么呢回复卡那霉素是原核细胞抗性素，不能够用来筛选真核细胞稳转细胞株，建议用慢病毒感染来筛选稳转细胞株，或者把质粒线性化后转染真核细胞，用真核细胞(antibiotic)（如G418、puromycin、Hygromycin等）来筛选稳转细胞株。回复是稳的回复转染后筛选就能得到稳定的，不筛选就是瞬时的。
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如何选择稳定转染的筛选抗生素？收藏
稳定转染和瞬时转染，细胞转染的步骤基本相同，只是在转染后的细胞处理会不一样。由于瞬时转染只能维持几天，故在转染12～72后就可以在蛋白或基因水平进行相应的检测了。稳转细胞系通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。通常构建的载体上有两个抗性基因，如，氨苄青霉素和新霉素。那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来筛细胞呢？很多真核表达质粒上都有两个抗性基因，但一般其中只有一个抗性可以用来筛细胞。其中氨苄青霉素对细胞是没有筛选作用的，这是用于构建克隆时筛选细菌的。所以这种情况下只能用G418。细胞转染后用G418来加压筛选，其原因是在载体上具有新霉素的抗性基因，当载体被转染入细胞后，由于细胞拥有了抗新霉素的特性，因此在用新霉素加压时，阳性细胞就不会被G418杀死。相反，未被转染入载体的阴性细胞由于没有对新霉素的抗性，那么当使用G418加压时，当然就会被杀死。如图，这个载体就是两个抗性，Amp和neo，但两个抗性的本质区别在哪？Amp是在bla启动子驱动下表达，bla是原核表达启动子。在大肠杆菌可以表达，因此，转化后的质粒用Amp可以筛选到，而不用G418筛选。而neo是在SV40启动子驱动下表达。SV40是真核表达启动子，转入真核细胞表达。所以只有转入载体的细胞才能用G418筛选出来。当然，不是什么抗生素都可以用于细胞筛选的，得看抗生素作用机理。氯苄青霉素抑制革兰氏阳性细菌细胞壁的形成，对真核生物起不到杀伤作用，因此不能用于细胞筛选。新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，作用机制为作用于细菌核糖体的30S亚基，抑制细菌蛋白质正常合成，使细菌细胞膜通透性增强，导致细胞内钾离子、腺嘌呤、核苷酸等重要物质外漏，引起菌体死亡，从而达到杀灭细菌的作用，对真核生物也起不到杀伤作用，因此不能用于细胞筛选！G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。原因是neo是编码3‘磷酸转移酶的基因，它在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生分解新霉素和G418的作用。所以这是做稳转是为什么用G418筛选了。G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。还可以用其他的抗生素吗？用于阳性细胞筛选的还可能有潮霉素（标有Hyg),等等。根据载体中所含有的抗性基因进行选择。比如：1 pBlast 质粒 具有氨苄青霉素和Blast抗性，筛细菌时用氨苄青霉素，筛细胞时用Blast；2 pZeocin质粒 具有卡那霉素和Zeocin抗性，筛细菌时用卡那霉素，筛细胞时用Zeocin。英格恩博客
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【求助】瞬时转染提RNA会有质粒的污染嘛
做了个瞬转的RT-PCR结果发现从提取的RNA做模板也可以扩出条带是不是就说明这个里面有质粒的污染还有就是这个基因是原核的检测时设计引物不能夸内含子应该如何设计?谢谢!遇到同样的问题，应该是RNA里有质粒污染，请高手指教该如何去除RNA能批出目的条带就是说明RNA有质粒污染吗？RNA和cDNA的差别仅仅在于U---T.RNA电泳显示的确是混有质粒，各位高手请指教如何才能避免
您的位置： &&如何让一个细胞过度表达某种基因,来观察此基因的作用,瞬时转染和稳定转染都用什么方法转染时每个细胞只近入一个质粒还是很多质粒,过度表达的标准是什么呢
苏不萌受CBO
转染的话一般是以克数来规范转染的质粒数量,所以会有很多质粒.一般转染的质粒除了带有需要过表达的基因以外,还需要带有标记基因.标记基因可以被特定的抗体检测,从而判断是否有效表达.如果你要过表达的是某种蛋白,也可以直接通过该蛋白的抗体检测,对照是没有转染的同种细胞,这样表达效果就可以通过WESTERN BLOT看见了.过表达倒没什么标准,每种蛋白表达量也不一致,选择适合自己的浓度就好.顺转的话,我们实验室采用lipo2000,具体步骤百度文库有,英文的protocol在lipo2000的说明书上也能看到.稳转的话一般需要在质粒上构建某个抗性基因,如嘌呤霉素抗性.这样用抗性培养基多次筛选就可以筛选出稳转的细胞株,但是比较难.
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