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大肠杆菌感受态细胞转化能力影响因素的研究
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大肠杆菌感受态细胞转化能力影响因素的研究
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1-大肠杆菌表达体系介绍
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不同培养基对大肠杆菌感受态转化率的影响
【来源/作者】湖南农业大学——刘华强 【更新日期】 13:50:27
大肠杆菌感受态转化方法
目前比较流行的大肠杆菌感受态的制备是用CaCl2处理受体菌种，使之成为感受态细胞，即具备接受外源DNA的能力。Ca2+作用主要是破坏细胞膜上脂质阵列【2】，并与膜上的多聚羟基丁酸化合物，多聚无极磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入【3】，420C做短暂热处理【4】，此时处于热休克状态的大肠杆菌能使感受态细胞吸收外源DNA。此方法操作简单，不需要特殊的仪器，重复性好，其吸收外源DNA的能力远远大于未经处理的细胞，有时甚至能增加约1000倍【5】，每μgDNA可得到5×105~2×107个转化体【6】，能满足常规的基因克隆需要，但耗时较长，对于经常从事分子生物学研究的需要导入质粒的工作人员来说是非常耗时间的。还有一个方法就是电穿孔法，通过优化各种参数（如电场强度电脉冲长度，DNA浓度等），电压更高或电脉冲时间更长时，转化效率将会有所提高【7】。电穿孔法转化率较高，每μgDNA可得到109~1010个转化体，但要求一套特殊的专门的转化设备，价格昂贵【8】，还有一点就是电转化法的细胞生存率降低，转化效率的提高将会因此而被抵消。当电场强度和脉冲长度以一定方式组合而导致50%~70%的细胞死亡时，转化水平达到最高。
大肠杆菌感受态培养基
SOC培养基里边因含有葡萄糖胰蛋白胨等成分因而含营养很丰富，可用于电转化后的感受态细胞的复苏。配好后分装，放在-20℃的低温冰箱中保存，因是分装，可以避免因取液而发生的污染，可以保存很长时间。胁本哲氏培养基因大部分成分提取与马铃薯体内，含有的成分更为多样，更为自然地营养物质，可以为大肠杆菌的培养提供更为多样的营养物质和调节因子。此外本实验看重的就是马铃薯体内一些物质对大肠杆菌感受态转化率的影响。LB培养基较上两种培养基营养成分要简单，它是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础，本实验用此含有氨苄青霉素的固体培养基来筛选导入成功的大肠杆菌。
本实验总结了几种转化方法，选择了采用两种培养法来培养大肠杆菌来观察得到的感受态细胞对外源DNA的吸收接纳情况。SOC培养基和谢本哲氏培养基（马铃薯培养基）。SOC培养基为一般的菌株培养基成分比较固定，而胁本哲氏培养基大部分物质提取营养丰富的马铃薯体内，里边含有一些有机的生命元素。本实验的设计思路就是马铃薯体内的这些有机的生命元素对大肠杆菌的转化率的影响，并结合电转化法的高效率，看看是否是经过这两种培养基培养过的大肠杆菌在电转化法的转化下是否有所不同。经过两种培养基培养过的大肠杆菌后再用电转化法进行转化，并利用PUC18检验质粒的特性，即PUC18检验质粒自身带有抗氨苄青霉素基因，外源片段不具有，因此只有具有PUC18的大肠杆菌才能在具有氨苄青霉素的培养基上存活，从而计算出大肠杆菌的转换率。实验证明胁本哲氏培养基较SOC培养基法对大肠杆菌的转化率有明显的提高。
1. 材料与方法
大肠杆菌DH10B菌株，中薯三号马铃薯，puc18检验质粒,
培养皿，蒸锅，电磁炉，灭菌锅，烧瓶，摇床，离心瓶，离心机，电激仪
胰蛋白胨，酵母提取物,葡萄糖，琼脂，蒸馏水，蔗糖，甘油
NaCl KCl MgCl2·6H2O MgSO4·7H2O，氨苄青霉素
本实验的设计思路是，用SOC培养基和胁本哲氏培养基进行大肠杆菌的感受态制备和PUC18（含有抗氨苄青霉素基因）检验质粒的导入，然后在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上进行筛选，并查看其菌落的数量，进行比较。
1.4.1 SOC培养基的配置(100ml)
（1）取1ml2M Mg2+母液，过滤灭菌，1ml2M 葡萄糖过滤灭菌，
（2）将胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl以及KCl加到97ml的蒸馏水中，搅拌使之溶解。
（3）高压灭菌并冷却到常温。
（4）加入2M Mg2+母液和2M 葡萄糖至终浓度20mM
（5）用蒸馏水定容至100ml。
（6）完全培养基用0.2μm 的滤膜过滤灭菌
（7）调节最终pH 值为7.0
（8）20.33g MgCl2&#O 24.65g MgSO4&#O加蒸馏水至100ml，过滤灭菌
1.4.2 胁本哲氏培养基配制
马铃薯300g，硝酸钙0.5g，磷酸氢二钠2.0g，蛋白胨5.0g，蔗糖15g，琼脂17-17.5g，水1000ml，PH6.8~7.0。
（1） 称量 称取硝酸钙0.5g， 磷酸氢二钠2.0g，蛋白胨5.0g，蔗糖15g，加入500ml的蒸馏水中溶解
（2） 称取去皮马铃薯300g，将马铃薯切成小块，放入锅中，加蒸馏水500 ml，煮沸10 min。用纱布滤去马铃薯残渣，取上清液加入到培养液中混匀，测pH值为6.8，并定容1000ml.
（3） 分装灭菌 将上述培养基以0.1MPa,121℃,高压蒸汽灭菌20min.
1.4.3 LB培养基的配制
（1）配制：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂12g加入到500ml蒸馏水中充分溶解混匀
（2）用蒸馏水定容至1000ml，摇匀后分装，包扎，高温灭菌锅中灭菌。
（3）抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄青霉素，以免温度过高导致氨苄青霉素失效，并充分摇匀。
（4）倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（5）保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，备用。
1.4.4 大肠杆菌感受态的制备
（1）取大肠杆菌菌株于新鲜无抗生素的SOC培养基和胁本哲氏培养基固体培养基上划菌，37℃，培养过夜。
（2）取单菌落分别接种到1mL 上述液体培养基里，37℃摇床200rpm培养6h。
（3）取上述菌液加入到分别装有400mL 上述培养基的1L大烧瓶内，37℃摇床250rpm，约3h后，测OD600值。
（4）OD600至0.4时，停止摇荡并放于冰水中迅速摇动至完全冷却，分装于2个500 mL离心瓶中，2200g，4℃，离心11min。
（5）去上清液，加2/3体积10％灭菌甘油，摇荡至沉淀完全悬浮，2200g，4℃，离心11min。
（6）重复步骤5。
（7）倒去上清，加入10％灭菌甘油1mL，悬起菌体，以100mL/管的分装入1.5mL的离心管中，放置－80℃保存备用。
1.4.5大肠杆菌电转化法步骤：
（1）用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电激杯，并于超净台吹干，将连接产物和0.1cm的电激杯一起预冷，准备800ul预冷。
（2）从-80℃冰箱中取出感受态大肠杆菌，至于冰上溶解解冻；
（3）取1ul连接产物加入到100ul感受态中，混匀后转入电激杯中，轻轻敲击电激杯使混合物均匀进入点电激杯底部；
（4）打开电转仪，将电激杯放入；
（5）按下pulse键，听到蜂鸣声后，向电激杯中迅速加入800ul的SOC液体培养基（做完SOC培养基后，换胁本哲氏培养基再做一遍），重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中；
（6）37℃，180rpm复苏一小时
（7）5000rpm，五分钟，弃上清液剩100ul，
1.4.6 大肠杆菌的转化率的测定
取10ul经过两种培养基培养过的大肠杆菌感受态，进行电击法转化，转化条件为：电压1800V，电阻200Ω；每个培养基配制的感受态细胞进行4次重复，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上涂板，放于37℃培养箱中过夜培养，次日查看转化结果。检验每10ul菌液含有的转化子数量，进行比较。
1.4.7 数据分析
转化效率( cfu/ μg) = ( 每皿转化子平均数×菌悬液稀释倍数) / 质粒微克数 【9】
由于本实验的主要目的在于比较两种培养基的转化效率的高低，所以我们可以根据每皿的菌落数来表示其转化的高低。
2. 结果与分析
2.1 转化子数量用SOC培养基和胁本哲氏培养基（马铃薯培养基）培养过的大肠杆菌感受态细胞用PUC18检验质粒进行转化后，检验每皿转化子平均数（10ul转化菌液）分别为：
如图2-1所示：
下图2-2为大肠杆菌实验实物照片：
注：上边四幅图片为经过胁本哲氏培养基和SOC培养基培养过的大肠杆菌感受态经过电激法导入PUC18质粒在LB筛选培养基上表现的菌落数。左边为经过胁本哲培养基制备的感受态，右边为经过SOC培养基制备的感受态。
2.2统计结果：
由于上述实验横向比较的处理条件一致，所以数据相差不大，但纵向的处理条件不一样，即培养基不同，数据差异明显，经Z-TEST统计检验表明两种培养基所获得的转化效率达到极显著水平（p=0.0000038）。对于上述两种培养液所做的四个重复处理可以看出，无论是单个重复处理还是四个重复处理的平均数，胁本哲氏培养基的转化子数量都是多于SOC培养基的转化子数量的。从上边的图表中我们也是显而易见，胁本哲氏培养基相对于SOC培养基的转化子数量分别高出：75.33%，68.52%，86.21%，67.74%，平均数高出74.18%。由此数据我们可以得出，胁本哲氏培养基极显著大于SOC培养基制备的大肠杆菌感受态细胞的转化率。
3. 结论与讨论
总结分析本实验，我们可以得出：经过胁本哲氏培养基培养过的大肠杆菌的转化率明显比经过SOC培养基培养过的大肠杆菌的转化率要高。相对于SOC培养基成分的简单性，胁本哲氏培养基的成分则更加复杂。我们猜测，这肯定是马铃薯提取液中的某种或几种成分影响了大肠杆菌的生化特点，使大肠杆菌的转化率得以提高，很遗憾我们目前只能证明这一点。
马铃薯提取液属于自然液体的一种，成分很复杂，里边不光有适用于细胞生长的碳源氮源，更有很多调节细胞生长的各种微量元素，激素等，可能还有很多目前我们无法测到的成分，所以对于这么庞杂的成分要知道是何种物质起了影响是想很复杂的工作。本实验不需要知道是何种成分起作用，只要知道是何种培养基效率更好就可以了。因为在大肠杆菌感受态的制备中我们是以培养基为基础的。所以对于是马铃薯提取液中的哪一种或几种成分影响了大肠杆菌我们目前尚不得知，但可以肯定的是此种成分在最适的浓度下能提高大肠杆菌的转化率。
目前培养细菌的主要培养基是LB培养基，但因为LB培养基的营养结构更加简单，对于其制作出来的大肠杆菌感受态细胞的转化率会更低，所以在此我们没有做LB培养基的大肠杆菌感受态细胞。就这两种培养基所做的大肠杆菌感受态细胞的转化率能完全满足目前为止的一些实验室要求，不用去购买昂贵的感受态细胞核花费大量的时间精力去用氯化钙发来制作感受态，此方法操作简单，时间短，效率高，安全，是我们在以后实验的分子生物学实验大肠杆菌感受态制备的比较理想的选择。
感受态细胞的制备和转化时分子生物学实验频繁使用的一项常规操作，可用于基因克隆以及文库的构建等常规操作。通常文库构建需要相当高的转化率的感受态细胞。特别是同质粒DNA长度较少以及连接产物中存在较高含量的杂质时，还是对感受态细胞转化率有比较高的要求，应用感受态不佳的细胞通常导致没有转化菌斑的生长，从而耽误实验进程【10】，影响实验的效率。大肠杆菌是我们在分子生物学中的重要的菌种。我们的很多分子实验都离不开大肠杆菌的参与。而质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞是分子克隆的关键步骤【11】，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器，而利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞，操作方便，应用广泛，但是氯化钙法的转化率常常不能满足实验的要求【12】。目前，实验室用的感受态细胞多为公司直接提供的，其价格昂贵，不适合普通基因克隆操作中的频繁使用【13】。因此，如何优化大肠杆菌的感受态细胞的制备方法则显得尤为重要。介于大肠杆菌在分子生物学试验中的广泛用途，对大肠杆菌的生物学特点的研究显得尤为重要。在大肠杆菌感受态的研究中显得尤为重要。高转化率的感受态大肠杆菌能大大提高分子生物实验的效率，达到事半功倍的效果。
在本实验中我们目前只能证明胁本哲氏培养基较SOC培养基对大肠杆菌的转化率有极明显的提高。也能肯定的是马铃薯中的某些生命的有机的活性物质对大肠杆菌的生化特点有了一些改变从而使得经过胁本哲氏培养基培养过的大肠杆菌的转化率有了明显提高。但目前还无法确认是马铃薯提取液中的那种成分起了作用，还是多种物质共同的作用的结果。或者是有一种更好的不耐高温高压的成分在高温高压的灭菌的过程中被破坏，这是一种目前还未知的。另外，到底这种成分或几种成分是怎么影响大肠杆菌的生化特点的，是通过改变大肠杆菌细胞膜使得其通透性增大还是影响其细胞膜上的某些蛋白质的活性从而使得质粒的进入更加流畅。或者和还有就是是否是某些极易通过细胞膜的物质和质粒之间以氢键结合然后随着这种物质的进入而把质粒带入大肠杆菌体内。
有文献表明大肠杆菌的感受态转化也不完全依赖于人工诱导【14】。而1996年Baur等发现在从自然环境中采集的天然水中，大肠杆菌可以建立感受态，由此可以认为，大肠杆菌可能具有通过其内在调节机制建立自然感受态的能力【15】。这一点Tsen等也发现了，他发现大肠杆菌的某些菌株可以自然地在细胞质中与细胞外质粒低频率结合【16】。
因此，我们可以推测，马铃薯提取液也属于自然界中的一种成分，其中也可能有某种成分，与大肠杆菌体内的内在调节机制向促进，使其自然建立的感受态能力大大增强。
还有一个更为大胆的猜想就是，大肠杆菌是最先在人体内被发现的，还有就是大肠杆菌属于细菌的一种，细菌主要是浸染动物细胞，可能细菌与动物细胞之间有某种信息的交流或其他的信息的建立。所以我们就会猜想是不是用动物血清或肠液来培养并制作大肠杆菌效率会更高，毕竟马铃薯培养基再丰富也是植物体内提取的，作为侵染动物细胞的细菌来说，动物的血清活肠液可能更合适，但是相应的成本也会更高。
当然这些目前只是我的猜测，还待以后的更加深入的研究才能更彻底的揭示大肠杆菌转化率的奥秘，我想将会是在大肠杆菌以及其他细胞的感受态转化上有突破性的进展。
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[9] 杨坤，巩振辉，李大伟，大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立，北方园艺，2010（14）：127-130.
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[15]谢志雄，欧剑虹，赵儒铭，沈萍Ce3+对大肠杆菌感受态建立和转化的影响。稀土 第24卷，第四期 2003年8月
[16]涂知明，陈明浩，何光源，常俊丽三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化，华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉，430074.华中科技大学学报（自然科学版）第34卷第四期，2006年 4月。
【关键词】大肠杆菌感受态；SOC培养基；胁本哲氏培养基；转化率；奥科官网&
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pC(g)若按原比例同倍数增加A和B的量 当m+n=p时,A的转化率不变 当m+n>p时,A的转化率增大 当m+n<p时,A的转化率减小Why?
丁丁桰梸椕
因素：温度、时间、反应物与生成物浓度、压强.当M+N=P时,反应处于平衡状态,就是说反应由左→右和左←右的反应速率是一样的,A的生成和反应掉的量不变.所以呢,A的转化率不变.以此类推,当M+N>P时,平衡像右移动,A的反应掉的量比生成的多,也就是转化成其他东西的量多,转化率就高了,关于为什么M+N>P时,反应平衡向右移动,你可以参考下你的课本,用平衡常数来解释,
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