基于16S rRNA和宏基因组高通量测序的微生物多样性研究--《清华大学》2015年硕士论文
基于16S rRNA和宏基因组高通量测序的微生物多样性研究
【摘要】：早期微生物研究依赖于人工分离培养,而大部分微生物无法在实验室条件生存,这阻碍了人们对微生物的了解。高通量DNA测序技术的发展,使研究者能够同时对多种微生物基因组进行测序,促进了不依赖培养的宏基因组学发展。宏基因组学研究主要分为两类:一类是只对物种标识基因如16S r RNA基因进行测序;另一类是环境中所有微生物的整个基因组进行测序。由于宏基因组学测序数据量大、数据复杂度高,在数据处理和分析方面尚未形成统一规范。为了解决这个问题,本文开展了以下三方面研究工作。第一,建立了用于处理16S r RNA基因高通量测序数据的软件流程,覆盖从原始测序数据到最终OTU丰度及分类信息表的所有步骤。其中采用有参考序列聚类和denovo聚类两种策略结合的方式,基于启发式聚类算法,提高了序列数据的利用效率。同时,通过对待聚类序列进行采样的策略,克服了传统方法无法适用于大规模测序数据的缺点。该流程为基于16S r RNA基因测序的研究提供了一套数据处理和分析的规范。第二,建立了基于短序列直接比对的宏基因组高通量测序数据流程,用于该类研究的物种多样性分析。相比传统的“短序列拼接、基因预测和基因序列比对”流程,本文直接将预处理后的短序列比对到物种标记基因数据库中以获得分类信息,以标识基因被比对上的序列数作为物种丰度。该策略在损失少量物种分类精度和覆盖面的情况下,极大地提高了数据处理的效率。第三,本文将上述流程应用到太湖水体和人类舌苔微生物群落的实际研究中。基于16S r RNA流程,本文在远高于同类研究的测序深度和样本量条件下,对不同月份太湖中不同位置的水体微生物群落结构做了全面描述,并对蓝藻水华与微生物之间的关系进行了研究。实验结果表明,群落结构组成在不同地点的差异要小于不同时间造成的差异,而且随时间的变化呈现显著的季节性和年周期性规律;同时,水华爆发对微生物之间的生态关系有较大影响。基于宏基因组流程,本文对胃炎和健康人舌苔微生物的群落结构组成进行了研究,找出了在胃炎病人和健康人中丰度显著差异的物种;同时基于典型对应分析,揭示了舌苔群落与性别、年龄以及身体质量指数之间的关系,一定程度上在分子生物学层面为中医舌诊提供了科学依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：清华大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：Q93;TP311.13【目录】：
摘要3-4Abstract4-9第1章 引言9-20 1.1 宏基因组学研究概述9-12
1.1.1 DNA测序技术简介9-11
1.1.2 宏基因组学发展历史及关键问题11-12 1.2 宏基因组学数据和微生物多样性12-16
1.2.1 16S r RNA基因和宏基因组测序12-13
1.2.2 多样性定义及度量13-14
1.2.3 国内外研究现状14-16 1.3 论文主要内容及贡献16-20
1.3.1 论文工作内容16-18
1.3.2 论文主要贡献18-20第2章 测序数据处理流程及微生物多样性分析方法20-35 2.1 本章引论20-21 2.2 16S r RNA基因测序数据处理流程21-27
2.2.1 数据预处理21-23
2.2.2 可操作分类单元划分23-26
2.2.3 物种分类及丰度信息注释26-27 2.3 宏基因组测序数据处理流程27-29
2.3.1 数据预处理27-28
2.3.2 物种分类及丰度信息注释28-29 2.4 物种多样性描述性分析29-32
2.4.1 Alpha和Beta多样性指数29-31
2.4.2 稀疏曲线分析31
2.4.3 主坐标轴分析31-32 2.5 物种群落研究相关性分析32-35
2.5.1 微生物与其他变量相关性32-34
2.5.2 微生物之间相关性34-35第3章 基于 16S r RNA基因测序的太湖水体微生物研究35-53 3.1 本章引论35-37 3.2 测序数据预处理37-39
3.2.1 双端序列连接37
3.2.2 混合样本分类37-38
3.2.3 序列质量控制38-39 3.3 OTU相关处理和分析39-40
3.3.1 OTU划分39-40
3.3.2 物种丰度及分类信息40 3.4 测序实验可靠性验证40-42 3.5 物种多样性分析42-47
3.5.1 Alpha多样性42-45
3.5.2 Beta多样性45-47 3.6 季节主导微生物47-50 3.7 共出现网络分析50-52 3.8 本章小结52-53第4章 基于宏基因组测序的人体舌苔微生物研究53-64 4.1 本章引论53 4.2 测序数据处理53-55
4.2.1 数据预处理53-54
4.2.2 物种分类信息获取54-55 4.3 舌苔微生物群落结构分析55-59
4.3.1 样本微生物基本组成55-56
4.3.2 Metatongue物种与HOMD比较56
4.3.3 Metatongue样本与HMP样本比较56-59 4.4 物种多样性分析59-60 4.5 微生物与宿主表型相关分析60-63
4.5.1 假设检验方法60-61
4.5.2 典型对应分析（ CCA）61-63 4.6 本章小结63-64第5章 结论与展望64-66 5.1 论文总结64-65 5.2 研究展望65-66参考文献66-73致谢73-75附录A 相关数据表格75-77个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果77
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京公网安备75号高等教育自学考试毕业论文封面 市地： 济南 2010 年 8 月 1日 浅析我国电子商务诚信问题和对策 摘 要 诚信体系作为一切商务活动的基本准则，在电子商务活动中担负着重要使命。但由于电子商务活动载体的特殊性、交易对象的盲目性和交易信息的虚拟性，导…摘 要 内容摘要：诚信问题成为影响我国电子商务发展的瓶颈。电子商务诚信缺失的原因主要是我国诚信基础薄弱、社会信用体制尚未完全建立、部分企业网上交易的条件不够完备、部分经营者唯利是图的心态等。为此 ,应切实推进电子商务活动的立法;充分发挥政府的主导作用…第29卷第6期2008年12月西安交通大学学报(医学版) JournalofXiπanJiaotongUniversity(MedicalSciences)Vol.29No.6Dec.2008 ◇专家述评◇ 宏基因组学及其技术的研究进展 楚雍烈,杨　…
第２９卷第６期２００８年１西安交通大学学报（医学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＸｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＶ０１．２９ＮＯ．６Ｄｅｃ．２００８２月Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）◇专家述评◇宏基因组学及其技术的研究进展楚雍烈，杨娥（西安交通大学医学院免疫与病原生物系，陕西西安７１００６１）摘要：宏基因组学是研究生态群体基因功能和其相互作用的新科学领域，以特定生态环境中微小生物遗传物质的总和作为研究对象，基本研究策略是通过克隆、异源表达，筛选出有用的新基因及其产物。宏基因组学为生命学科和药学研究提供了一个强有力的新技术，并在包括医学在内的许多领域取得了新成就。本述评对宏基因组学的概念、技术和应用作了简要介绍。关键词：宏基因组学；宏基因组文库构建｝文库筛选中图分类号：Ｑ７８５文献标识码：Ａ文章编号：１６７１—８２５９（２００８）０６一０６０１一０８ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓａｎｄｉｔｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｈｕＹｏｎｇｌｉｅ，ＹａｎｇＥ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ，ＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌｏｆＸｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｘｉ’ａｎ７１００６１，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓｉｓａｎｅｗｆｉｅｌｄｏｆｏｎｓｃｉｅｎｃｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｓｔｕｄｙｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｅｃｏｔｙｐｅｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｂａｓｅｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓｄｉｒｅｃｔｌｙ．ＩｔｓｂａｓｉｃｓｔｒａｔｅｇｙａｎｄａｎａｌｙｚｉｎｇｌｉｂｒａｒｙｗｉｔｈｓｉｍｉｌａｒｓｔｒａｔｅｇｙｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅＤＮＡｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｉｒｎａｔｕｒａｌｉｎｃｌｕｄｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｏｔａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙＤＮＡ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙ，ｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｉｔｐｒｏｖｉｄｅｓａｐｏｗｅｒｆｕｌｔｏｏｌｔｏｈｅｌｐｕｓｔｏｅｘｐｌｏｉｔｆｏｒｎｏｖｅｌｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓｈａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｒａｐｉｄｌｙａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｍａｎｙｎｏｖｅｌａｃｃｏｍｐｌｉｓｈｍｅｎｔｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｎｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｐｔ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓｈａｖｅｂｅｅｎｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ；ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ；ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ｌｉｂｒａｒｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇ随着人类科学认识论和思维方式的深化，在分子生物学和分子遗传学技术方法的支撑下，顺应２１世纪生命科学的发展，在基因组学的基础上诞生了一门但是越来越多的研究表明，人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制，还与其他生物基因组相关；对疾病的易感性、药物反应等许多现象，也无法全部用人体基因差异来解释。已证明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关，例如人?类胃溃疡发病机制和病因与寄生在胃里的微生物的致病作用有关。因此，必须考虑与人类长期共生的微生物群体对人类的影响。此外，自然界现存的物种数量以万亿计，包括人类、大量的高等动物、植物和微生物。世界上的万物是彼此依赖、相互作用、相互制约和相互促进，形成共生、共存和协调平衡发展的欣欣向荣局面。要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组学及其相互关系的研究。这种研究超越了传统意义上单一物种的基因组学分析，研究对象复杂、范围更广而方法要更新，它要求在基因学、基因组学的基础上有新的学科来承担这一新的任务。因此，２１世纪人类提出了生态基因组学崭新的交叉学科——宏基因组学（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）［１］。宏基因组学的问世引起世界科学界的极大关注，发展很快，它代表了生命学科今后的研究方向。本文就宏基因组学的产生、概念、研究的基本策略和方法进行综述。ｌ宏基因组学的产生、发展和概念１．１宏基因组学的产生背景人类基因组计划（ｈｕ—ｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＧＰ）的完成促使了基因组功能性研究计划的开展，并推动从结构基因组学研究时代进入功能性基因组研究为主的后基因组时代，人体基因的功能研究成为生命科学领域的研究热点。收稿日期：２００８—０９—１６修回日期：２００８—１１—１０作者简介：楚雍烈（１９４４一）?男（汉族），教授，博士生导师．研究方向：肿瘤病毒分子遗传学与免疫生物学．Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｂｉｏｌｏｇｙ＠ｍａｉｌ．ｘｉｔｕ．ｅｄｕ．ｃｒｌ万方数据　６０２西安交通大学学报（医学版）第２９卷（ｅｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）的概念［３］。它要求对特定环境下多种生物的基因组进行研究，这将有助于揭示生命现象的本质，发现新的基因和确定人类疾病的病因。１．２宏基因组学的发展与概念宏基因组学的发展经历了环境基因组学、微生物基因组学、宏基因组学到人类宏基因组学的阶段。１．２．１环境基因组学的提出与发展１９９１年Ｐａｃｅ首次提出环境基因组学（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ）的概念，并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中ＤＮＡ的噬菌体文库，环境基因组学（亦称微生物环境基因组学）的研究受到广泛关注降引。１９９８年美国国立环境卫生科学研究所启动了环境基因组计划（ｅｎ－ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ，ＥＧＰ），开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究，引起各国科学家的极大关注，标志着生命科学界将在更深层次上对环境与基因相互作用对人类健康的影响进行系统全面的研究［３。４］。环境基因组学第一次提出特定生态条件下，全部生物基因组总体概念，这是基因组学的重要进展。１．２．２微生物基因组学与宏基因组学概念的提出环境是一个相互作用的复杂体系，又是一个不断变化的动态过程，该体系的生命与非生命的两个方面是不断互为因果，相辅相承的。为了方便研究，人类把精力集中到特定环境的微生物群体上来。Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ等［１３于１９９８年提出生命研究对象应是生物环境中全部微小生物的基因组（ｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｆｏｕｎｄｉｎｎａｔｕｒｅ），首次提出针对特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究的这领域。２００７年３月，美国国家科学院以“环境基因组学新科学——揭示微生物世界的奥秘”为题发表咨询报告，指出宏基因组学为探索微生物世界的奥秘提供新的方法，这是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，将是对微生物世界认识的革命性突破。报告呼吁建立全球宏基因组学研究计划，建议大批量启动中小型宏基因组学研究项目，对自然环境微生物群落（如海水或土壤）、寄生微生物群落（如人体肠胃或口腔）、人为控制环境微生物群落（如污水处理厂或水产养殖厂）等展开研究；启动少量大型综合性项目，对宏基因组学研究方法、技术路线、理论框架和更为复杂的动态微生物系统进行研究‘ｓ１。１．３宏基因组学的概念宏基因组（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）和宏基因组学（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）的概念尚待统一，其中万　方数据的“宏”所对应的英文是前缀“ｍｅｔａ－”，它源于希腊语，作为构词成分意思是超越（ｏｖｅｒｒａｃｈ）、在上（ａｂｏｖｅ）、在外（ｂｅｙｏｎｄ）、在后（ｂｅｈｉｎｄ）等，它具有更高层次组织结构和动态变化的含义，在ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ中有更高级、更复杂的意思。国内一般翻译为“宏”或“元”，形象表明其涵盖范围的广泛性。本文采用较为普遍的宏基因组／宏基因组学译法（注：国外有人还称为Ｅｃｏｇｅｎｏｍｅ／Ｅｃｏｇｅｎｏｍｉｅｓ，译为生态基因组／生态基因组学）。１．３．１广义宏基因组学的概念广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。它是以生态环境中全部ＤＮＡ作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律的一门科学。宏基因组学使得人们摆脱了物种界限，揭示了更高层次上的生命运动规律。１．３．２狭义宏基因组学概念狭义宏基因组学则以生态环境中全部细菌和真菌基因组ＤＮＡ作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和还不能培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律。如１９９８年Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ等提出土壤宏基因组学的定义是：土壤微生物群体的全部基因组，并对其进行克隆和功能分析‘１?８１。由于狭义宏基因组学概念的对象具体、范围局限和研究目标明确，一般文献上所提的宏基因组学，除非特别指明，一般均指的是狭义宏基因组学。１．３．３人类宏基因组学人体内部或体表有数以万亿的微生物个体存活，包括细菌、古细菌、真菌、寄生虫和病毒等。这些微生物占人体总重量的１％一２％，成人体内细胞约有９０％为微生物细胞，其余约１０％为人体细胞，因此从某种意义上说一个完整、健康的成年人是诸多物种组成的复合体。人体内共生的菌群包括肠道、口腔、呼吸道、生殖道等处菌群。其中许多微生物对人体健康维持有重要作用，帮助消化食物，制造维生素。大多微生物具有许多独特的生物功能，如有些微生物具有独特功能的一些酶，对各种复杂有机化合物有降解作用，有些微生物可以在一些极端环境下生存等等。同时，还有一些微生物则可能导致人体疾病。然而，目前对健康和疾病状态下这些细菌、真菌和其他微生物的作用还知之甚少。国际学术界把多种微生物聚居在一起形成的系统叫做“微生物群落”，也称菌群。把人体内所有微生物菌群基因一宏基因组（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）概念，指出应用宏基因组学研究微生物复杂群落基因组的方法将成为快速发展的６期楚雍烈，杨娥．宏基因组学及其技术的研究进展６０３组的总和称为“人体宏基因组”（ｈｕｍａｎｍｅｔａｇｅ—ｎｏｍｅ）。人类宏基因组学（ｈｕｍａｎｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）则是研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。２００４年，美国国立卫生研究院专门设立“利用宏基因组学研究口腔微生物”的研究项目，２００６年春季召开会议，正式成立人类宏基因组计划国际联盟，启动人类宏基因组计划，作为协调这一宏大科学计划的国际组织［３’８］。人类宏基因组计划又称“人类第二基因组计划”，它相当１０个人类基因组计划工作量，其规模和广度将远远超过人类基因组计划。人类宏基因组计划目标是：把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。该计划可能发现超过１００万个新基因。完成后，将有助于更好地破解人类疾病。２００７年１２月１９日美国国立卫生研究院正式宣布启动一项新的基因工程——人体微生物群系计划（ｈｕｍａｎｍａｃｒｏｂｉｏｔｉｃｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＭＰ）。人类微生物组学（ｈｕｍａｎｍｉｃｒｏｂｉｏｍｉｃｓ）是对人体内或者表面存在的所有微生物的总体进行研究。显然这和宏基因组学的概念、策略和研究方法一致，人类宏基因组学正式与人类医学研究联系在一起。处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究范围中所有基因组展开研究的学科。“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物ＤＮＡ，将大片段的ＤＮＡ克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值万　方数据的克隆。包括两个方面睁２０］：①宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括样品总ＤＮＡ的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆口。］。②宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｃｒｅｅｎ－ｉｎｇ）和序列筛选（ｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）两种方法。２．２宏基因组学的研究步骤基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组ＤＮＡ，克隆ＤＮＡ到合适的载体，导人宿主菌体，筛选目的克隆等４个步骤。特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）的混合基因组序列。这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。２．２．１分离特定环境生物ＤＮＡ方法上不同于传统的先培养微生物再提取ＤＮＡ的做法，而是首先直接收集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放ＤＮＡ，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。２．２．２纯化的大分子量ＤＮＡ进行克隆在对ＤＮＡ酶切或者超声打断处理，并与合适的载体ＤＮＡ进行连接，构建重组体。２．２．３将带有宏基因组ＤＮＡ的栽体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的ＤＮＡ在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。所有带有宏基因组ＤＮＡ载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。２．２．４对宏基因组文库的ＤＮＡ进行分析基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。另一类为序列基因型分析，即对文库中所有或部分的ＤＮＡ进行测序分析，以应用于生态学研究。例如分析文库中１６ＳｒＲＮＡ序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析ＤＮＡ序列所编码的信息。该计划完成后，将对阐明人类许多疾病的发生机理、研究新药物、控制药物毒性等产生巨大作用。科学家认为，人类基因组和人类宏基因组这两本“天书”绘制２宏基因组学研究的策略和基本过程２．１宏基因组学的研究策略宏基因组学的研究还西安交通大学学报（医学版）第２９卷３宏基因组学的技术方法宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对常用方法和技术予以简要介绍。３．１样品总ＤＮＡ的提取及基因或基因组ＤＮＡ的富集提取的样品ＤＮＡ必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总ＤＮＡ是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的ＤＮＡ，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇［４｛］。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持ＤＮＡ片段的完整和纯度。已有许多商品化宏基因组ＤＮＡ提取试剂盒可用，同时很多实验室仍致力于宏基因组ＤＮＡ提取方法的改进睁引。常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法（细胞提取法）。直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法（如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等）和化学法、酶法等。不同直接裂解法的提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、ＤＮＡ提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的ＤＮＡ片段较小（１—５０ｋｂ），难以完全去除酚类物质。细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提ＤＮＡ，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收ＤＮＡ。此法可获得大片段ＤＮＡ（２０—５００ｋｂ）且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物ＤＮＡ也不容易抽提出来。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集睁１１］，一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术［１引。抑制性消减杂交技术［１３］是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也万　方数据利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。３．２宏基因组文库的建立宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株。传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于１０ｋｂ。克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。目前大肠杆菌是最为常用的宿主［１４｜，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。３．３宏基因组文库的筛选由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为四类：①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。３．３．１基于序列的筛选方法通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或ＰＣＲ引物，通过杂交或ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因［１５‘１６］。另一种方法是对含有１６ＳｒＲＮＡ等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序［１７。。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。直接序列分析法（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｄｒｉｖｅｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息［１８－２０］。也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。虽然ＤＮＡ序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。６期楚雍烈，杨娥．宏基因组学及其技术的研究进展６０５用微阵列技术（基因芯片）进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列［２１。２引。３．３．２基于功能的筛选方法功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上（如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反应底物）的表型特征进行筛选［２引。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目的克隆。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行［２４‘。功能性筛选法的优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。不足之处是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组ＤＮＡ表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。３．３．３底物诱导基因表达筛选（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ＳＩＧＥＸ）ＳＩＧＥＸ是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因［２５。。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。首先构建一个含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达载体，这个载体可将宏基因组ＤＮＡ克隆到ＧＦＰ基因上游，使该基因的表达受到宏基因组ＤＮＡ片段中的启动子调控。当外加目标底物时，可以影响ＧＦＰ的表达，进而通过活细胞荧光分离技术（ｆｌｕｏ—ｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ，ＦＡＣＳ），在添加特定底物的条件下对表达库进行筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性的克隆。ＳＩＧＥＸ在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测手段，大大增加了筛选万　方数据的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障，而且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性；且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能。而ＳＩＧＥＸ法的不足之处是目标基因的结构性和适应性很敏感，同时，无法用于分析不能进入细胞质的底物，而且ＦＡＣＳ对进样设备的要求也比较高；代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻；同时有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。但是考虑到宏基因组文库中含有大量的基因，其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。所以只要对这些不足之处进行优化，选择合适的条件，ＳＩＧＥＸ法仍然是一种宏基因组文库筛选的有效方法，尤其适合于在工业上使用［２６｜。３．３．４基于稳定性同位素技术筛选方法具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素（ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇ，ＳＩＰ）。环境中的许多物质都可以用ＳＩＰ来标记，鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物［２７１。３．３．５荧光原位杂交技术荧光原位杂交（ｆｌＨｏｒｅｓ—ｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶ＤＮＡ分子或ＲＮＡ分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞。ＦＩＳＨ技术已经用于不同生态系统的研究中，应用稳定同位素技术可以对环境中某些活性微生物的核酸进行富集，进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未培养微生物的功能基因［２８ｌ。３．３．６其他筛选策略常规的ＰＣＲ、分子杂交、抗原抗体反应等技术也可以用于筛选，也有公司开发出了专门筛选某些酶、蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应用前景。此外，在构建文库之前对样品有目的进行富集，然后提取样品ＤＮＡ构建文库，这也可以提高目的克隆的数量。当前宏基因组学技术中最大缺陷是文库的表达问题，模式微生物并不能把所有的宏基因组ＤＮＡ表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率很低，从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提出虽然带来观念上极大的突破，但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论上可能带来的巨大成果。但有理由相信，随着分子生物学技术的发展，宏基因组学研究必然成６０６西安交通大学学报（医学版）第２９卷为今后若干年自然科学研究的一个重要领域。４宏基因组学的应用宏基因组学代表了一个研究自然环境样本中生物多样性的强大工具。从宏基因组文库中获得的信息可以大大地丰富有关工农业、医学以及环境生态等诸多领域的认识，并带来很多应用可能。宏基因组学研究在短短几年内，已渗透到包括农业、土壤、林业、海洋、人体医学、药物等各个领域，并在替代能源、环境修复、生物技术、生物防御、哲学及伦理学等各方面，显示了重要的价值［２¨１。。４．１宏基因组学在基础微生物学研究中的应用４．１．１发现新基因由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，其中存在大量不可培养的微生物，无法通过培养法进行研究，而宏基因组学的策略则突破了这一束缚。通过构建宏基因组文库，而且从中鉴定出的大多数基因将都是新的基因［３２。３４｜。即使是对一个相对较小的宏基因组文库进行筛选，所获得的序列与已公布的数据库中的序列的相似性也很低。如利用宏基因组文库，已发现的新基因主要有：生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因等。４．１．２开发新的微生物活性物质在地球各种环境中，多达９９％的微生物因为不能培养而无法了解。有数据表明，其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物。如何研究并开发利用这些不可培养微生物，成为重要而又急迫的任务。近年来，由于极高的重复发现率，利用纯培养技术从环境微生物中筛选到新活性物质的几率显著下降。宏基因组学则为新微生物活性物质的开发提供了新思路。目前通过采用土壤、海水、海洋浮游生物、海绵、甲虫、人唾液等环境样品，成功构建了宏基因组文库，筛选到多种新的活性物质如各种酶类及一些次生代谢产物等，将宏基因组文库筛选和基因改组等基因工程技术结合起来，在开发新的微生物活性物质方面具有巨大潜力［３５．３７］。４．１．３研究微生物群落结构及其功能宏基因组学为认识由可培养和不可培养微生物所构成的复杂生境及其功能提供了可能，且必将在研究生物多样性中发挥重要作用。运用宏基因组技术对海洋病毒已有较深入的研究，为探寻复杂微生物群落中的感应信号分子及其基因调节机制，探知微生物物种在群落中的功能打下基础Ｅ３８－４０］。４．２宏基因组学在农业微生物研究中的应用近年万　方数据来发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过培养方法来研究微生物的多样性及功能，为土壤微生物研究开辟了新的道路。土壤中多数微生物不可培养，这限制了微生物资源的开发利用。宏基因组学方法在开发和利用不可培养微生物资源方面有巨大潜力，可以将其运用到土壤微生物学研究中，也可以用于改造土壤、提供有机肥料和改进粮食品种等领域。随着微生物宏基因组研究的不断深入，宏基因组技术也在土壤、海水微生物等研究领域中成功应用Ｅ１，６－ｇ］，预示着在不久的将来，宏基因组技术必将会在更广泛的关键领域取得重大突破。４．３宏基因组学在医学研究领域中的可能应用人体和动物体内存在适合微生物生长的生境，例如肠道、皮肤表面、口腔等，同样可以利用宏基因组学方法来研究这些微生物群体，特别是其在某些疾病过程中发生的变化。２００４年，美国国立卫生研究院专门设立“利用宏基因组学研究口腔微生物”的研究项目，证明国际学术界对宏基因组学方法的重视，也说明宏基因组学方法应用于某些医学研究领域的可行性。到目前为止，宏基因组学在医学领域还处于起步阶段，但研究结果令人振奋。如Ｂｒｅｉｔｂａｒｔ等［４ｑ利用宏基因组方法分析了人粪便中不可培养的病毒群体，发现该群体中包含１２００个病毒基因型，对其序列分析表明大多数是之前没有报道的。Ｗａｌｔｅｒ等［４２］对小鼠大肠微生物群构建了宏基因组文库，并对表达Ｂ一葡聚糖酶活性的克隆进行了筛选，发现２个克隆是来自不可培养微生物的。Ｄｉａｚ—Ｔｏｒｒｅｓ等［２３］利用宏基因组学方法，对口腔细菌群体中耐药基因进行了分析，结果证明用宏基因组学方法进行耐药情况调查和研究是可行的。Ｇｉｌｌ等［４３］建立了人肠道微生物群的宏基因组，并对其代谢特征进行了分析。研究发现，肠道菌群结构的改变与失衡除会导致肠道疾病外，还与是癌症的发生有着密切关系。Ｍａｎｉｃｈａｎｈ等［４４］利用宏基因组方法对比研究了正常人和节段性回肠炎患者肠道微生物多样性，发现患者肠道微生物多样性大大降低，尤其是硬壁菌门的细菌种类大大减少。人类基因组和肠道微生物基因组学研究业已显示了有力证据，人类基因组编码２２３种与细菌蛋白高度同源的蛋白，深入研究将揭示宿主与肠道微生物在进化过程中如何有机地结合在一起，形成现存互惠共生的复合体。宏基因组学在医学研究领域中的应用具有很大潜力，以下方面的研究有望获得突破：新感染性疾病‘很多慢性全身性的代谢性疾病，如糖尿病、肥胖，甚至６期楚雍烈，杨娥．宏基因组学及其技术的研究进展６０７的发现（例如临床存在很多不明原因的发热患者，其中可能有不可培养微生物感染的可能）；正常人及某些疾病患者的肠道生境中微生物群体多样性分析及与疾病的可能关系；不可培养微生物耐药情况及其机制分析，以及在耐药传播机制中的作用；特殊微生物群体致病机制研究（例如生物膜的研究）；从微生物生活环境中发现有医学应用价值的生物活性新物质等等。人类宏基因组研究起步较晚。应充分利用我国的特有优势参与国际竞争，加快人类宏基因组研究步伐，是一个十分迫切的问题。宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受，有关宏基因组学研究的文章逐年增多。宏基因组学研究将大大扩展我们对生命的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用。宏基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇，已经成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿。我国应尽快开展有关宏基因组学的研究，通过联合攻关，拓展研究领域，发展相关研究策略和技术，开展广泛的国际合作，使我国在宏基因组学研究领域中有所作为。参考文献：［１］ＨａｎｄｅｌｓｍａｎＪ，ＲｏｎｄｏｎＭＲ，ＢｒａｄｙＳＦ，ｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏ—ｌｏｇｉｃａｌａｃｃｅｓｓｔｏｔｈｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｕｎｋｎｏｗｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓ：ａｎｅｗｆｒｏｎｔｉｅｒｆｏｒｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍＢｉｏｌ，１９９８，５（１０）：２４５－２４９．［－２］ＳｃｈｍｉｄｔＴＭ，ＤｅＬｏｎｇＥＦ，ＰａｃｅＮＲ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｍａｒｉｎｅｐｉｃｏ—ｐｌａｎｋｔｏｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙｂｙ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１，１７３（１４）：４３７１－４３７８．［３］ＨｕｇｅｎｂｏｌｔｚＰ?ＰａｃｅＮＲ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｎａｔｕｒａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ａｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，１４（６）：１９０?１９７．［４］ＴｓａｉＹＬ，ＯｌｓｏｎＢＨ．ＲａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌＤＮＡｆｒｏｍｈｕｍｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｉｎｓｅｄｉｍｅｎｔｓｆｏｒｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ。１９９２，５８（７）：２２９２－２２９５．［５］Ｂｃｊａ０，ＳｕｚｕｋｉＭＴ，ＫｏｏｎｉｎＥＶ，ｅｔａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙ—ｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｌｉｂｒａｒｉｅｓｆｒｏｍａｍａｒｉｎｅｍｉ—ｅｒｏｂｉａｌａｓｓｅｍｂｌａｇｅ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，２（５）：５１６—５２９．［６］ＭｉｌｌｅｒＤＮ，ＢｒｙａｎｔＪＥ，ＭａｄｓｅｎＥＬ，ｅｔａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｏｐｔｉ—ｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒｓｏｉｌａｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５（１１）：４７１５．４７２４．［７］ＢｆｉｒｇｍａｎｎＨ，ＰｅｓａｒｏＭ．ＷｉｄｍｅｒＦ．ｅｔａ１．Ａｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｏｐｔｉ－ｍｉｚｉｎｇｑｕａｌｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌＥＪ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００１?４５（１）：７－２０．［８］ＹａｎｇＺＨ，ＸｉａｏＹ，ＺｅｎｇＧＭ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍｅｔｈｏｄｓ万　方数据ｆｏｒｔｏｔａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｃｏｍ—ｐｏｓｔＥＪ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，７４（４）：９１８．９２５．［９］ＫｎｉｅｔｓｃｈＡ，ＷａｓｃｈｋｏｗｉｔｚＴ，ＢｏｗｉｅｎＳ．ｅｔａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｉｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｃｕｌ－ｔｕｒｅｓ：ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｇｅｎｅｂａｎｋｆｏｒｇｅｎｅｓｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇａｌｃｏｈｏｌｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎ’Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，６９（３）：１４０８．１４１６．［１０］ＥｎｔｃｈｅｖａＰ，ＬｉｅｂｌＷ，ＪｏｈａｎｎＡ，ｃｔａ１．Ｄｉｒｅｃｔｃｌｏｎｉｎｇｆｒｏｍｅｌｌ—ｒｉｃｈｍｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｓ，ａｒｅｌｉａｂｌｅｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅｏｐｅｒｏｎｓａｎｄｇｅｎｅｓｆｒｏｍｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｎｓｏｒｔｉａ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００］。６７（１）：８９．９９．［１１］ＨｅａｌｙＦＧ，ＲａｙＲＭ，ＡｌｄｒｉｃｈＨＣ，ｅｔａ１．ＤｉｒｅｃｔｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｃｅＵｕｌａｓｅｓｆｒｏｍｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｎｓｏｒｔｉａｉｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ，ａｎａｅｒｏｂｉｃｄｉｇｅｓｔｅｒｍａｉｎｔａｉｎｅｄｏｎｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏ—ｓｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，１９９５，４３（４）ｌ６６７－６７４．［１２］ＲａｄａｊｅｗｓｋｉＳ．ＭｃＤｏｎａｌｄＩＲ，ＭｕｒｒｅｌｌＪＣ，ｅｔａ１．Ｓｔａｂｌｅ－ｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏｂｉｎｇｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ：ａｗｉｎｄｏｗｔｏｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒＯｌｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，１４（３）：２９６—３０２．［１３］Ｓａｇｅｒｓｔｒ６ｍＣＧ，ＳｕｎＢＩ，ＳｉｖｅＨＬ．Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｃｌｏｎｉｎｇ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄｆｕｔｕｒｅ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，１９９７，６６（５）１７５１－７８３．［１４］ＨｅｎｎｅＡ。ＤａｎｉｅｌＲ，ＳｃｈｍｉｔｚＲＡ，ｅｔａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｖｉ?ｒｏｎｍｅｎｔａｌＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇｅｎｅｓｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕ—ｔｙｒａｔｅ［Ｊ］．ＡｐｐｉＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ。１９９９，６５（９）＝３９０１—３９０７．［１５］ＦｕｔａｍａｔａＨ，ＨａｒａｙａｍａＳ，ＷａｔａｎａｂｅＫ．Ｇｒｏｕｐ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｎｉ－ｔｏｔｉｎｇｏｆｐｈｅｎｏｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｏｒａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｐｈｅｎｏｌ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｒｉｃｈｌｏｒｅｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｈｉｏｌ。２００１，６７（１０）：４６７１—４６７７．［１６］ＭｅｓａｒｃｈＭＢ，Ｎａｋａｔｓｕ，ＣＨ，ＮｉｅｓＬ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃａｔｅｃｈｏｌ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｂｙｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ［Ｊ］．ＡｐｐＩＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，６６（２）１６７８—８８３．［１７］ＷｅｘｌｅｒＭ，ＢｏｎｄＰＬ，ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＤＪ，ｅｔａ１．Ａｗｉｄｅｈｏｓｔ．ｒａｎｇｅｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙｆｒｏｍａｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｌａｎｔｙｉｅｌｄｓａｎｏｖｅｌａｌｃｏｈｏｌ／ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，７（１２）：１９１７?１９２６．［１８］ＶｃｎｔｅｒＪＣ，ＲｅｍｉｎｇｔｏｎＫ，ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＪＦ，ｅｔａ１．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｇｅｎｏｍｅｓｈｏｔｇｕｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅＳａｒｇａｓｓｏＳｅａ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０４（５６６７）：６６—７４．［１９］ＳｃｈｍｅｉｓｓｅｒＣ，ＳｔｏｃｋｉｇｔＣ，ＲａａｓｃｈＣ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓｕｒｖｅｙｏｆｂｉｏｆｉｌｍｓｉｎｄｒｉｎｋｉｎｇ—ｗａｔｅｒｎｅｔｗｏｒｋｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉ－ｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，６９（１２）：７２９８?７３０９．［２０］ＴｙｓｏｎＧＷ，ＣｈａｐｍａｎＪ，ＨｕｇｅｎｈｏｉｔｚＰ，ｅｔａ／．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｈｒｏｕｇｈｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｅｎｏｍｅｓｆｒｏｍｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ。２００４，４２８（６９７８）＝３７—４３．［２１］ＳｃｂａｔＪＬ，ＣｏｌｗｅｌｌＦＳ－ＣｒａｗｆｏｒｄＲＬ．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｐｒｏｆｉｌｉｎｇ，ｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｇｅｎｏｍｉｃｆｉｂｒａｒｙ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ。２００３，６９（８）１４９２７－４９３４．［２２］ＵｒｉｓｍａｎＡ，ＦｉｓｃｈｅｒＫＦ，ＣｈｉｕＣＹ，ｅｔａ１．Ｅ－Ｐｒｅｄｉｃｔ：ａｃｏｍｐｕ－ｔａｔｉｏｎａｌｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｏｂｓｅｒｖｅｄ６０８西安交通大学学报（医学版）第２９卷ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］．ＯｅｎｏｍｅＢｉｏｌ，２００５，６（９）：Ｒ７８．［２３］Ｄｉａｚ—ＴｏｒｒｅｓＭＬ，ＭｃＮａｂＲ，ＳｐｒａｔｔＤＡｅｔａ１．Ｎｏｖｅｌｔｅｔｒａｃｙ．ｃｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｆｒｏｍｔｈｅｏｒａｌｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ａｎ?ｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ?２００３，４７（４）：１４３０?１４３２．［２４］ＭａｊｅｒｎｉｋＡ，ＧｏｔｔｓｃｈａｌｋＧ，ＤａｎｉｅｌＲ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ－ｔａｌＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｆｏｒｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｇｅｎｅｓｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇＮａ（＋）（Ｌｉ（＋））／Ｈ（＋）ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｌｃｈａｒａｃ—ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｅｄｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，２００１，１８３（２２）：６６４５?６６５３．［２５］ＵｃｈｉｙａｍａＴ，ＡｂｅＴ，ｌｋｅｍｕｒａＴ，ｅｔａ１．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｆｉｂｒａｒｉｅｓｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃａｔａｂｏｌｉｃｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，２３（Ｉ）Ｉ８８．９３．［２６］ＹｕｎＪ，ＲｙｕＳ．ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｎｏｖｅｌｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍｍｅｔａｇｅｎｏｍｅａｎｄＳＩＧＥＸ，ａｓａｗａｙｔｏｉｍｐｒｏｖｅｉｔＥＪ］．ＭｉｃｒｏｂＣｅｌｌＦａｃｔ，２００５，４（Ｉ）：８．［２７］ＬｕＹＨ，ＬｕＥｄｅｒｓＴ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＭＷ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｃｔｉｖｅｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｎｒｉｃｅｒｏｏｔｓｕｓｉｎｇｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｐｒｏ－ｂｉｎｇ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，７（３），３２６?３３６．［２８］ＬｅｖｅａｕＪＨ。ＧｅｒａｒｄｓＳ，ｄｅＢｏｅｒＷ，ｅｔａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ—ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆ（ｍｅｔａ）ｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｓｂｙｌａｒｇｅ－ｉｎｓｅｒｔｌｉｂｒａｒｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＬＩＬ－ＦＩＳＨ）［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，６（９）ｆ９９０．９９８．［２９］Ｆｒｉａｓ－ＬｏｐｅｚＪ，ＳｈｉＹ，ＴｙｓｏｎＧＷ．ｅｔａ１．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｏｃｅａｎｓｕｒｆａｃｅｗａｔｅｒｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｉＡｃａｄＳｃｉ，２００８，１１１１０５（１０）：３８０５－３８１０．［３０］ＮａｏｍｉＷａｒｄ．Ｎｅｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＥｃｏ，２００６，５５（３）：３３１－３３８．［３１］Ｍａｒｔｉｎ—ＣｕａｄｒａｄｏＡＢ，Ｌ．６ｐｅｚ—ＯａｒｃｉａＰ，ＡｌｂａＪＣ，ｅｔａ１．Ｍｅｔ－ａｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｔｈｅｄｅｅｐＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ＿’ａｗａｒｍｂａｔｈｙｐｅｌａｇｉｃｈａｂｉｔａｔ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯＮＥ，２００７，２（９）１９１４．［３２］ＫｎｉｅｔｓｃｈＡ，ＢｏｗｉｅｎＳ，ＷｈｉｔｅｄＧ，ｅｔａ１．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏｅｎｚｙｍｅＢ１２?ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅ?ｈｙｄｒａｔａｓｅ－ａｎｄｄｉｏｌｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｆｒｏｍｍｅｔ?ａｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ?２００３，６９（６）：３０４８—３０６０．［３３］ＨｏｎｇＫＳ。ＬｉｍＨＫ，ＣｈｕｕｇＥＪ，ｅｔａｉ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ?ｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｉｉｐｏｌｙｔｉｃｅｎ?万　方数据ｚｙｍｅｓＣＪ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，１７（１０）：１６５５?１６６０．［３４］ＬｅｅＣＭ，ＹｅｏＹＳ，ＬｅｅＪＨ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌ４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｏｆｒｏｍｔｈｅｓｏｉｌｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２００８，３７０（２）：３２２?３２６．［３５］ＫｎｉｅｔｓｃｈＡ，ＷａｓｃｈｋｏｗｉｔｚＴ，ＢｏｗｉｅｎＳ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓｏｆｃｏｍｐｌｅｘｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｎｓｏｒｔｉａｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｉｌｓａｓｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｎｏｖｅｌｇｅｎｅｓｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂｏｎｙｌｓｆｒｏｍｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎｐｏｌｙｏｌｓｏｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ［Ｊ］．ＪＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏＩ，２００３，５（１）：４６．５６．［３６］ＥｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔＷＨ．ＳｔｏｌｓＬ，ＲｏｓｅｎｂａｕｍＨ，ｅｔａ１．ＤＮＡｆｒｏｍｕｎ?ｃｕｌｔｕｒｅｄｏｒｇａｎｉｓｍｓａｓａｓｏｕｒｃｅｏｆ２，５－ｄｉｋｅｔｏ－Ｄｇｌｕｃｏｎｉｃａｃｉｄｒｅ?ｄｕｃｔａｓｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｉ２００１，６７（９）：４２０６—４２１４－［３７］ＣｏｔｔｒｅｌｌＭＴ．ＭｏｏｒｅＪＡ，ＫｉｒｃｈｍａｎＤＬ．Ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓｆｒｏｍｕｎｃｕｌ?ｔｕｒｅｄｍａｒｉｎｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ’１９９９，６５（６）ｌ２５５３?２５５７．［３８］ＷａｎｇＧＹ。ＧｒａｚｉａｎｉＥ，ＷａｔｅｒｓＢ，ｅｔａ１．ＮｏｖｅｌｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｆｒｏｍｓｏｉｌＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｉｎａｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｈｏｓｔ［Ｊ］．ＯｒｇＬｅｆｔ－２０００，２（１６）：２４０１－２４０４．［３９］ＳａｂｅｈｉＧ。ＭａｓｓａｎａＲ，ＢｉｅｌａｗｓｋｉＪＰ，ｅｔａ１．ＮｏｖｅｌＰｒｏｔｅｏｒｈｏ—ｄｏ圃ｎｖａｒｉａｎｔｓｆｒｏｍｔｈｅＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎａｎｄＲｅｄＳｅａｓ［Ｊ］．Ｅｎｖｉ—ｒｕｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，５（１０）１８４２?８４９．［４０］ＭａｎＤ，ＷａｎｇＷ，ＳａｂｅｈｉＧ，ｅｔａ１．Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｐｅｃｔｒａｌｔｕｎｉｎｇｉｎｍａｒｉｎｅｐｒｏｔｅｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，２００３，２２（８）：１７２５．１７３１．［４１］ＢｒｅｉｔｂａｒｔＭ。ＨｅｗｓｏｎＩ，ＦｅｌｔｓＢ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｅｓｏｆａｎｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｖｉｒａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｆｒｏｍｈｕｍａｎｆｅｃｅｓ［Ｊ］．ＪＢａｃ．ｔｅｒｉｏｌ，２００３．８５（２０）１６２２０．６２２３．［４２］ＷａｌｔｅｒＪ，ＭａｎｇｏｌｄＭ，ＴａｕｎｏｃｋＧＷ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄｂｅｔａ—ｇｌｕｃａｎａｓｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆａｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏ?ｓｏｍｅｌｉｂｒａｒｙｆｒｏｍｔｈｅｌａｒｇｅ—ｂｏｗｅｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｏｆｍｉｃｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，７１（５）：２３４７－２３５４．［４３］ＧｉｌｌＳＲ，ＰｏｐＭ，ＤｅｂｏｙＲＴ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｄｉｓｔａｌｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７８）：１３５５－１３５９．［４４］ＭａｎｉｃｈａｎｈＣ，Ｒｉｇｏｔｔｉｅｒ－ＧｏｉｓＬ，ＢｏｎｎａｕｄＥ，ｅｔａ１．Ｒｅｄｕｃｅｄｄｉ－ｖｅｒｓｉｔｙｏｆｆａｅｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｉｎＣｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅｒｅｖｅａｌｅｄｂｙａｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ｇｕｔ，２００６，５５（２）１２０５－２１１．［４５］ＫｌｉｎｇＪ．Ｃａｒｅｅｒｓｉｎｓｙｓｔｅｍｓｂｉｏｌｏｇｙ，ｗｏｒｋｉｎｇｔｈｅｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．ＳＣｉｅｎｃｃ，２００６，３１１（５７７６）ｌ１３０５．１３０８．（编辑国荣）宏基因组学及其技术的研究进展作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：楚雍烈， 杨娥， Chu Yonglie， Yang E西安交通大学医学院免疫与病原生物系,陕西西安,710061西安交通大学学报（医学版）JOURNAL OF XI'AN JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES))2次 参考文献(45条) 1.Handelsman J;Rondon MR;Brady SF Molecular biological access to the chemistry of unknown soilmicrobes:a new frontier for natural products 1998(10)2.Schmidt TM;DeLong EF;Pace NR Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloningand sequencing 1991(14)3.Hugenboltz P;Pace NR Identifying microbial diversity in the natural environment:a molecularphylogenetic approach[外文期刊] 1996(06)4.Tsai YL;Olson BH Rapid method for separation of bacterial DNA from humic substances in sedimentsfor polymerase chain reaction 1992(07)5.Beja O;Suzuki MT;Koonin EV Construction and analysis of bacterial artificial chromosome librariesfrom a marine microbial assemblage[外文期刊] 2000(05)6.Miller DN;Bryant JE;Madsen EL Evaluation and optimization of DNA extraction and purificationprocedures for soil and sediment samples[外文期刊] 1999(11)7.Bürgmann H;Pesaro M;Widmer F A 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第２９卷第６期 ２００８年１ 西安交通大学学报（医学版） ＪｏｕｒｎａｌｏｆＸｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇ Ｖ０１．２９ＮＯ．６ Ｄｅｃ．２００８ ２月Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） ◇专家述评◇ 宏基因组学及其技术的研究进展 …第２８卷第２期 环境科学学报 Ｖ０１．２８，Ｎｏ．２２００８年２月 ＡｃｔｓＳｃｉｅｎｔｉａｅＣｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅ Ｆｅｂ．，２００８ 贺纪正，张丽梅，沈菊培，等．２００８．宏基因组学（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）的研究现状和发展趋势［Ｊ］．环… 读《中国传统发酵食品中ENTEROLSIN 及 HELVETICIN J 基因多样性及抑菌活性研究》笔记 一．主题 本研究主要通过使用不依赖于培养的宏基因组方法对六种中国传统发酵食品中的 ENTEROLSIN 和 HELVETICIN J基因的多样…宏基因组学的研究状况及其发展 摘要：宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科，主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足，是研究未培养微生物、寻找新功能基因和…就爱阅读网友整理上传,为您提供最全的知识大全,期待您的分享，转载请注明出处。
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