求助 如何提取大肠杆菌dna聚合酶中的基因组DNA

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-03 20:03 标签： 大肠杆菌的基因组
提取的大肠杆菌质粒里面含有基因组DNA（按照碱法大提质粒）该怎么办?如果没有补救的办法,重新提取应该注如果没办法补救,重新提质粒应该注意些什么?
仔爱鬼5469
可以考虑切胶回收,如果你的质粒在10k以下,污染的基因组DNA量不多,而且基因组DNA弥散不严重的话,在1%的agarose胶里质粒和基因组DNA还是分得比较开的.注意的地方是在加完溶液2裂解细胞的时候要放置在冰上而且时间不能太长,加溶液2以及下一步加溶液3中和时,混合要充分但要轻柔,一般小心颠倒5-10次即可.
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如果很珍贵的质粒，建议跑琼脂糖凝胶，然后，切胶回收。如果一般的话，重新提取，注意碱裂解法提取的溶液2、3加入时间，尤其是2液时间要短，不要超过5分钟，3分钟就可以了，虽然量可能不那么多，但是，质粒质量有保证。并且，要轻柔操作，否则，弄断基因组DNA，还得重提。...
扫描下载二维码大肠杆菌基因组DNA提取和质粒DNA提取的异同点?
提取的步骤基本上都属DNA的提取步骤,包括细胞裂解,DNA释放,纯化,最后沉淀溶解.质粒提取过程中,有一个DNA变性、复性的过程,这个与基因组提取完全不同,这是利用质粒是以超螺旋结构存在于大肠杆菌中的特殊状态,分离纯化质粒时总是会利用这个特点来分离基因组DNA与质粒DNA.
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大肠杆菌基因组提取
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材料和 1.& && & Tris碱（Calbiochem - Behring公司）2.& && & 蛋白酶K（Sigma公司）3.& && & 苯酚\氯仿（1:1）（EM Science）4.& && & 无水乙醇（Pharmco- AAPER）5.& && & RNAase（Invitrogen公司） 设备 1.& && & 台式离心机（Eppendorf） 步骤： 1.& && & 取1.5 ml在LB培养基中培养过夜的大肠杆菌菌液加入1.5 ml离心管中，高速离心1 min收集菌体；2.& && & 弃上清；注：在不影响菌体沉淀的情况下尽可能除去上清3.& && & 将菌体沉淀重悬于600 μl裂解液中，涡旋振荡混匀；4.& && & 37℃温育1 h；5.& && & 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒使之完全混匀；注：不要剧烈振荡离心管，会引起DNA断裂注意：苯酚是一种强酸，可引起严重的烧伤；氯仿是一种致癌物，操作时应穿实验服，戴上手套和护目镜并保持管盖盖好。为安全起见，最好在通风橱里操作。6.& && & 最高转速离心5 min（除非另有说明，所有离心在室温进行）。离心后，在水层（蛋白质层）和苯酚/氯仿层之间有一白色分隔层；7.& && & 用1 ml的移液器小心转移上清至新的离心管中（为避免吸到界面杂质，可将1 ml枪头剪短约2 mm）；8.& && & 重复步骤4-6直至无白色蛋白层；9.& && & 加入等体积的氯仿以除去苯酚，颠倒混匀；10.& &最高速离心5 min11.& &移上清至新的离心管中；12.& &加入2.5或3.0倍体积的无水乙醇（-20℃预冷）轻轻混匀（可见DNA絮状沉淀）。-20℃冰浴30 min左右；13.& &4℃高速离心15 min；14.& &弃去上清，加入1 ml 70%乙醇（室温贮存）洗涤DNA沉淀；15.& &最高速离心2 min，小心弃去上清，室温下风干DNA沉淀（可微微斜靠在吸水纸上），为快速风干可置于37 ℃培养箱中；16.& &用TE缓冲液溶解DNA。注意：DNA样品中含有大量的RNA。因此，为了接下来的反应，如消化质粒DNA，可加入1-5μl（1 mg/ml）RNAase进行消化反应以除去RNA，或者直接将RNAase加入到裂解缓冲液中，终浓度为1 mg/ml。 配方 1.& && & LB培养基1%的胰蛋白胨，0.5%的酵母膏，200 nm NaCl。2.& && & TE缓冲液10 mM Tris-Cl (pH 8.0)1 mM EDTA (pH 8.0)3.& && & 裂解缓冲液（10 ml）10 ml裂解缓冲液=9.34 ml TE缓冲液+600 μl 10% SDS+60 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）
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