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请问：为什么SSR聚丙烯酰铵电泳会出现三四条扩增带？不是应该出现一条带才对吗？
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
出现多条带是正常的,所以才有筛选多态性引物的必要性,如果你要当标记使用，当然最好是单条带,但如果是构建指纹图谱的话,就需要多条带的SSR引物了 !
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
我的意思是一个引物出现三四条带哦
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
我也是那个意思!一个引物对应一个样品出现3\4条带是正常的，如果你需要单条带,就去找另一个引物吧!这个引物不适合你!现在有几千对SSR引物,总有你需要的,
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
另外还有一个可能,如果只出现一条特别清晰的,还有几条不模糊的也是可以的,只要改善一下退火温度就可以了，当然需要一番摸索的!
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
如果做的多了，就知道在聚丙烯酰铵胶上会出现很多的类型,多的少的，清楚的\暗淡的,什么情况都可能遇到!
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
我做的是水稻航天诱变育种SSR分析.居我所知SSR位点都是单克隆的,也就是说每个位点两端的保守序列(引物)都与其他位点的保守序列(引物)不同.所以即使一个等位基因发生变异,用一个引物对进行PCR扩增出来的带也最多是两个.以上是我的理解,不知道对不对?
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
我忽然想到一个问题:微卫星序列(SSR)单克隆位点可以这样理解: 每条染色体上有很多个微卫星位点,位点两端的保守序列是可以相同的,当保守序列相同的时候小片段重复序列是不相同的.假如是这样的话就可能出现多条带了 em10:
luohuacheng
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
你怎么跟我做的差不多,也是航天诱变育种的材料,也是做SSR 的. 如果同意,可以交个朋友. 我得EMAIL:
Re:为什么SSR电泳出现三四条扩增带？
请问谁能给我提供SSR的引物，我的EMAIL.cn em12:& 【求助】SSR
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【求助】SSR
大家帮帮忙,最近试验遇到些问题。我做的是棉花纤维分子标记（SSR），现在有3个亲本有600多对引物，要筛引物可是带出的很少，要不就是一个亲本不出带，检查了DNA没问题呀，郁闷当中，快急死我了。
10微升体系：
buffer& && && && & 1
dntp& && && && &&&0.25
taqE(500u)& & 0.2
引物& && && && && &1
DNA& && && && && & 1
ddH2O& && && && &6.55
扩增程序：
95度& && & 4分钟
94 度& && &40秒
51 度& && &45秒
72度& && & 1分钟& &&&35个循环
72度& && &&&8分钟
4&&度& && && & 保存
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不出带是正常的&&最好发个图片来看看
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原帖由 junhun 于
16:01 发表
不出带是正常的&&最好发个图片来看看 图片稍后附上
我想问下1、是上游引物与下游引物的退火温度不同，怎么选择？是取其平均值还是选择其中较低的退火温度？2、我有3个亲本一块PCR板上可以点32对引物，但是这些引物退火温度不一样该怎么取一个合适的温度来PCR?
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折中选一个退火温度吧&&我的引物有200多对，也是合成的&&我选的是58°c，都还不错
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你可以看看跟你做一样棉花ssr& & pcr的程序& & 感觉你的延伸时间还是挺长的啊& &&&当然我不是做棉花的& &&&做大豆&&小麦的& &变性& &退火& &延伸& & 都用30s&&就行
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向大家请教一个问题：我在跑PCR的时候，如果样少的话能够跑出来（比如只有5管），而样多的话就跑不出来（比如有40管），我是先配好体系再分装的，这个是不是照成这种现象的原因？求指点
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DNA浓度是多少？
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不出带是正常的&&最好发个图片来看看
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& &&&想咨询个事请，我做的是棉花分子标记有3个亲本，过年之前一共筛选出了60多对SSR引物，可是过完年回来后有一个亲本突然不出带了，其他两个亲本都有带，这是怎么回事呀？现在我快愁死了？DNA也是重新提的。
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原帖由 bs4665 于
16:05 发表
不出带是正常的&&最好发个图片来看看
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& &&&想咨询个事请，我做的是棉花分子标记有3个亲本 ... 是所有的引物都不出带还是只有某一对引物不出带？
要是只有某一对引物不出带 建议你重P一次&&或许是忘记加什么了
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你没有说明你P出来的片段大约在哪个范围内呀？
一般来说。不同的片段大小延伸温度是不一样的。预变性的温度实际上做SSR的话2min就够了。
因为SSR一般P出来的片段都在1K以下。
退火温度大家一般都会选择55度左右，太低的话，我试过很难P出条带。
要不然你试试这样的体系
我也正在做SSR，原理都是一样的
10×Buffer&&1.5uL
2.5×Dntp& &1.5uL
DNA& && && &&&1uL
Primer& && && &1uL(上下引物1uL，如果是混合样，就1.5uL这个关系不大啦）
Taq酶& && && &0.2
其他的你用水，共15uL体系咯
你再把延伸温度改成40秒试试，这个是我惯用的体系，条带很清楚
但是我做的不是棉花，也不知道能不能帮到你&nbsp&&&>大豆矮秆突变基因的SSR标记
大豆矮秆突变基因的SSR标记
编号:30-20671 | rar 格式 | 235.30K |
Ta 们刚刚下载了...基于SSR标记的江苏沿江地区糯玉米种质资源遗传多样性研究
来源：《江苏农业学报》.-).-723-729&&作者：刘丽君等&&日期:&&点击数：
摘要： 为研究江苏沿江地区糯玉米种质的遗传多样性以及江苏省糯玉米的遗传改良和杂种优势利用提供参考，利用93对SSR标记研究55份糯玉米自交系和3O份糯玉米单交种的遗传多样性，并利用UPGMA方法对所有自交系材料进行系统聚类。结果表明在自交系中筛选出88对多态性较好的引物，共扩增出350个差异片断，每对引物检测出2―9个差异片段，平均为3．98个；SSR标记的多态性信息量值在0．137与0．832之间，平均为0．520。在单交种中筛选出87对多态性好的引物，扩增出311个差异片断，每对引物可检测出2―9个差异片断，平均3．57个，SSR标记的多态性信息量值在0．064与0．839之间，平均为0．475。利用UPGMA聚类分析方法将所有供试自交系分为4类，划分结果基本符合品系的来源情况，江苏沿江地区糯玉米种质资源主要由通系5群、衡白522群以及突变体材料组成，多样性较为丰富，可为糯玉米遗传改良提供一定的遗传基础。
关键词： 糯玉米；自交系；单交种；遗传多样性；SSR标记
糯玉米在中国有着悠久的种植历史，研究糯玉米种质的遗传多样性，对促进糯玉米的遗传改良和杂种优势利用具有重要意义。当前糯玉米种质材料多来源于农家品种和杂交种，多数自交系无系谱可查，致使亲缘关系不清楚，无法利用系谱追踪法研究其遗传多样性。
近年来，分子标记技术在玉米种质的遗传多样性研究中受到越来越多的重视。RFLP标记首先被用于玉米自交系的遗传多样性研究，随后RAPD和AFLP标记技术也相继被应用 。目前，SSR标记因具有多态性高、可靠性好、共显性和操作简单等优点被广泛应用于玉米遗传多样性研究。
江苏沿江地区农业科学研究所是国内较早开展糯型特用玉米育种的单位，具有丰富的糯玉米种质资源。本研究利用SSR标记技术对该所55份糯玉米自交系和30份糯玉米单交种进行遗传多样性分析，旨在为沿江地区糯玉米遗传改良提供一定的参考，促进分子标记辅助育种技术在生产实践中的应用。
1 材料与方法
1．1 试验材料
表l（略）列出了江苏沿江地区农业科学研究所提供的55份糯玉米自交系以及30份糯玉米单交种，所选材料主要是当地生产上应用的糯玉米杂交种及其亲本，以及该所最新育成的糯质玉米自交系。
1．2试验方法
1．2．1 DNA提取& 每份供试材料取15粒种子，置于培养箱中光培养。幼苗长至4片叶时，每份材料混合剪取叶片3．5 g，采用SDS方法提取基因组总DNA，利用紫外分光光度计检钡0 DNA浓度和质量，将DNA样品浓度稀释至20 ng／&g，一20℃下保存备用。
1．2．2 PCR扩增与产物检测 在玉米基因组上选取93对多态性较好的SSR标记(标记信息来自于MaizeGDB数据库)，PCR扩增反应在Gene―Amp ABI 9700 PCR仪上进行，扩增体系为10&l，包括10×PCR buffer(含1．5 mmol／L MgC12)、25&mol／L的dNTP、0．5 U Taq DNA聚合酶、1．5mmol／L的正反向引物、20 ng DNA模板。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 S，52―60℃(视引物而定)结合30 S，72 ℃延伸50S，35个循环；72℃延伸10 min，降至4 ℃。PCR扩增完成后，在96孔板中加入等体积的Loading& buffer(含9&l甲酰胺，0．5 mol／L的EDTA，2．5g溴酚蓝，2．5 &g二甲苯晴蓝)，3 000 r／min离心1 min，然后在PCR仪上95℃ 变性5 min，取出置于预冷的冰水混合物上。变性后的PCR产物用6％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PBR322作为DNA分子量标记，使用DYY．12C型电泳仪以恒定电压1 000 V电泳40 min，电泳结束后用0．1％ 的硝酸银染色，强碱法显带。
1．3 数据分析
SSR扩增带型以0、1统计，建立数据库。在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为一1。每个SSR位点的多态性信息量(Polymorphisminformation content，PIC)按公式PIC=1一Σƒi2 计算，其中ƒi为第i位点的基因频率。以简单配对参数(Simple matching coefficient，SM)计算遗传相似系数GS=m／(m+n)，其中m为基因型间共有带数目，n为差异带数目。使用Power．Marker v3．25软件按UPGMA(Unweighted pairgroup method arithmetic averages)方法进行聚类分析，获得聚类分析图。
2．1 55份糯玉米自交系的遗传变异分析
利用已选取的93对SSR标记，对55份糯玉米自交系进行多态性分析，选出扩增带型稳定、多态性丰富、重复性较好的88对引物，扩增结果见表2。这些引物在自交系中共扩增出350个差异片断，每对引物可检测到2―9个差异片断，平均为3．98个；每对SSR 引物的多态信息量(PIC)在0．137与0．832之间，平均为0．520。其中引物umcl845的PIC值最大，达到0．832，引物umcl357 PIC值最小，为0．137。l―10染色体上分布的多态引物位点数分别为10、8、10、10、9、7、8、9、9、8，这些染色体上分别检测出37、39、39、42、34、20、40、36、32、31个差异片断，PIC值分别为4．940、4．631、5．170、5．705、4．21 1、3．195、5．174、4．785、3．890、4．083。第4和第7染色差异片断较多，PIC值也较大；第6染色体差异片断最少，PIC值也最小。
2．2 30份糯玉米单交种的遗传变异分析
使用相同的93对SSR引物对30份糯玉米单交种进行多态性分析，经筛选得到了87对多态性较好的引物，扩增结果见表2。这些引物在糯玉米单交种中共扩增出311个差异片断，每对引物可检测出2―9个差异片断，平均为3．57个，比自交系材料(3．98)略低；每对SSR引物的PIC值在0．064与0．839之间，平均为0．475，低于自交系材料(0．520)。引物umcl845的PIC值最大，为0．839；引物umc2361最小，为0．064。1―10染色体上分布的多态引物位点数分别为10、8、10、10、9、7、8、8、8、9，这些染色体上分别检测出3O、36、37、40、29、20、33、27、27、32个差异片断， c值分别为4．170、4．346、4．883、5．205、3．905、3．343、4．330、3．558、3．390、4．246。第4染色体上的差异片断数最多，PIC值也最大；第6染色体的差异片断数最少，PIC值也最小，为3．343。
2．3 供试自交系材料的聚类分析
依据所选SSR标记在55份糯玉米自交系上扩增出的350个差异条带，计算所有材料之间的遗传距离，再进行UPGMA聚类分析，结果将所有自交系分为4类(图1)。将聚类结果与材料的原有类群信息结合分析后发现，I类包含5份自交系，为混合类群，系谱类群没有太大共性。Ⅱ类有13份自交系，包括了LBW2、LBW3、T5、T5V、新红T5T5等自交系，几乎全来自通系5类群。Ⅲ类有24份自交系，包括9份衡白522群自交系，其余材料大部分是经二环系选育的具有衡白522背景的自交系材料。Ⅳ类包含13份自交系，大部分为突变体材料。
分析地方种质资源的遗传多样性，有利于拓宽玉米种质遗传基础，调整育种目标，制定更加合理的育种策略。在糯玉米遗传资源多样性的其他研究中，田孟良等以贵州和云南的9个糯玉米地方品种和5个普通玉米地方品种为材料，用79对SSR引物共检测出330个等位变异，平均每个位点上的等位基因变异数为4．18。杨勇等利用SSR标记研究了30份中国主要糯玉米自交系的遗传变异，用2l对扩增带型稳定的引物，从供试材料中检测出101个等位基因变异，每对引物检测等位基因2―10个，平均4．81个，平均多态性信息量为0．60。与其他地区糯玉米遗传资源多样性数据相比较发现，江苏沿江地区的糯玉米种质资源的遗传多样性略微偏低，今后可适当引进新的种质资源。本研究通过UPG．MA聚类分析方法将供试自交系分为了4种类群，将聚类结果与材料的具体来源或系谱类群比较发现，该地区糯玉米自交系种质资源主要来自于衡白522群、通系5群以及突变体材料三大类，且由衡白522群、通系5群两大类自交系组配成的苏玉糯系列单交种的遗传背景中，通系5群占有较大比例。同时聚类分析结果还发现，部分普通突变体材料与衡白522群、通系5群的差异较大，因此可尝试选取相应自交系与衡白522群或通系5群的优良自交系进行组配，来培育优良品种。
基金项目：国家重点基础研究发展计划项目()；国家自然科学基金项目()；江苏省高校自然科学研究重大项目(09KJA210002)；江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(09)637]；江苏省高新技术研究计划项目(BG2oo53O9)
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