标书中 实时定量荧光定量pcr仪pcr实验可能出现的问题及解决方案怎么写

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-11-21 04:19 标签： 荧光定量pcr
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实时荧光定量PCR实验结果分析
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实时荧光定量PCR的原理及实验
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&&定​量​P​C​R​的​原​理​及​实​验
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你可能喜欢荧光定量PCR(探针法)实验出现问题,通常需要进行哪些数据核查,从而判断可能的原因?
1,检查引物探针的特异性等2.检查所用模板质量数据核查的话主要看你所测得的数据是否跟你的理想状态差距很大,或数据是否符合常理.再就是看数据得看下相关系数和扩增效率.
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扫描下载二维码请问做实时荧光定量PCR实验时,为什么做标准曲线?
强颜欢笑丶炋v
1 做标曲才可以算出这对引物的扩增效率（其斜率）,方便用pfaffl方法来进行相对定量（得到的结果相对精确一点）,否则只能默认扩增效率为2,用2^-ddCt(Livak)法来计算2 做标曲才可以绝对定量.
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绝对定量和相对定量都可以做标准曲线，目的在于用已知浓度样品的量做成的标准曲线来定未知浓度样品的量。
标准曲线是已知量的做了标准曲线可以实现绝对定量
扫描下载二维码实时荧光定量PCR实验注意事项 - 实验交流 - 生物秀
标题: 实时荧光定量PCR实验注意事项
摘要: [实时荧光定量PCR实验注意事项]一、防止RNA酶污染的措施
所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
塑料器皿可用0 1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0 1…… [关键词:高压灭菌 试剂 酶抑制剂 荧光定量 实验室 质粒 失活]……
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22&m滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
三、关于DEPC
因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容。在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
1. DEPC处理
（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200&l、20&l Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解。
3. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。
最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1轕C水，在灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的。
四、如何消除污染
机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1）试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2）加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。
另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)重组克隆表达。
五、RNA定量
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较，不同标本之间就更不准了。
六、RNA的贮藏
最主要的是温度，－20不够，最好－80，液氮最保险。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。
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