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【分享帖】免疫共沉淀的具体注意事项
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【分享帖】免疫共沉淀的具体注意事项
最近我们实验室想做这个试验，以前也没有做过，如果有战友做过这个试验，希望介绍点经验和教训，谢谢乐。
应战友要求，在网上找乐一下基础资料，方便大家查看，虽然下面也列出了试验方法，但在实际实验室可能并不一样，希望战友们较少些自己的亲身体会，让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了
免疫共沉淀　　免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
　　其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
　　实验流程为：
　　（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min后取上清；
　　（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
　　（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
　　（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；
　　（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
　　（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
　　注意的问题：
　　（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
　　（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用
　　（3）使用对照抗体：
　　单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
　　兔多克隆抗体：正常兔IgG
　　在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：
　　(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
　　(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；
　　(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
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ChIP是个很郁闷的实验，时间花费N长，如果做的不好非常打击人，我也谈不上什么成功经验呢
1）显然抗体来源要可靠，很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。
2）超声处理要充分，处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看，如果片段都很大，结果受到的影响很大，特别是如果ChIP组蛋白
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谢谢楼上，现在好多大牛文章上面都用IP ，做的也很漂亮，摸索好了条件，应该是不难做的，有个疑问 ，为什么在WB上能用的 在IP上就不能用乐啊？
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谢谢楼上，现在好多大牛文章上面都用IP ，做的也很漂亮，摸索好了条件，应该是不难做的，有个疑问 ，为什么在WB上能用的 在IP上就不能用乐啊？
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对不起，我直接想到ChIP上去了,所以才出现了上面的那些说法。
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你的意思应该是 chip 用的抗体是特殊的吧？即便和WB试验一样，抗同样的抗原。
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楼主是否把免疫共沉淀的定义和实验目的说下，这样方便讨论，呵呵
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ChIP是个很郁闷的实验，时间花费N长，如果做的不好非常打击人，我也谈不上什么成功经验呢
1）显然抗体来源要可靠，很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。
2）超声处理要充分，处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看，如果片段都很大，结果受到的影响很大，特别是如果ChIP组蛋白
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ChIP是ChIp（染色质免疫沉淀），不是楼主说的Co-IP（免疫共沉淀），二者是风马牛不相及的两个试验和概念，原理和目的都不一样，楼上很多人将二者搞混了.
染色质免疫沉淀的作用是鉴定蛋白与DNA的结合，相当于EMSA（凝胶滞留试验）的体内试验。
基本原理是用抗体将目标蛋白及其它可能结合的DNA沉淀下来，然后用引物扩增DNA的序列。因此这个目标蛋白通常具备转录调节功能，能够结合DNA，目前也有做结合RNA的Chip。
免疫共沉淀的作用是鉴定蛋白与蛋白的相互作用。用抗体将蛋白(A）及其可能结合的目标蛋白（B）沉淀下来。因此这个A蛋白可以是任何蛋白。“共”指反过来用B的抗体也能将A/B复合物沉下来。如果是单向的，通常叫免疫沉淀。
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楼主的帖子“免疫共沉淀的具体注意事项”不适合放在核酸版块，更适合放在蛋白质版块。
相反，“染色质免疫沉淀CHIP”适合在该版块。
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我做的不是很多，但是有几点提出来和大家讨论下。
我想这个试验最关键的就是细胞的处理和抗体来源。
如二楼所说，的确很多WB的抗体是不一定可以用到ChIP上的，这个应该是和抗体的制作过程有关系的。至于多抗还是单抗，我认为各有优缺点。比如说单抗是特异性的针对某种表位的，这样可以选择几种单抗混合使用效果会好些，而且背景也低很多。多抗虽然比较复杂，最主要的是非特异性反应比较多，导致试验结果不好判断，但是经过合理的纯化，应该会将这个缺点变小。做ChIP的抗体应该是能够针对空间表位的，虽然某些针对线性表位的抗体也能够运用其中，但是那只是小部分，所以我认为抗体的来源很关键，无论是购买还是自己制作，都需要对其的特性比较了解。
ChIP还有一个问题是细胞的处理，虽然很多公司都提供了现成的试剂可供选择，但是那只是通用性的试剂，真正适合自己细胞的还需要做预试验摸索下。其次是细胞内相互作用的蛋白，可能会由于处理导致不发生作用等等因素导致相应值变低，所以我觉得处理时间，温度等等外部条件还是很重要的。
以上是个人观点，仅供参考！Q：贴壁细胞如何裂解 A：取10cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤两次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞（如RIPA）；具体的裂解方法，可参考说明书中不同裂解液的详细使用方法。Q：组织样品如何裂解 A：对于组织样品，参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解；具体的裂解方法，可参考说明书中不同裂解液的详细使用方法。 Q：悬浮细胞如何裂解 A：取悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解；具体的裂解方法，可参考说明书中不同裂解液的详细使用方法。Q：结合能力是多少 A：1ml结合25mg蛋白（1ml protein A+G可以结合25mg human IgG）。 Q：不同量的细胞，裂解方法一样吗 A：不同量的细胞，应选用适当裂解液的用量进行裂解。（如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。） Q：裂解的是动物细胞，不是组织，是否用中等强度的RIPA A：推荐使用SDS裂解液，TNE裂解液，含有NP-40 ，EDTA，Tris等，方便好用，比RIPA温和一些。 Q：细胞裂解液RIPA是否分强、中、弱？如果与全能核酸酶一起使用，同时加入吗 A：RIPA分强中弱，可以和全能核酸酶（货号RPE002）一起使用，但Chip实验一般用裂解能力更强的SDS裂解液，（10^6细胞推荐用100ul-200ul裂解液）。Q：蛋白样品很粘稠，超声后略有好转，但杂带很多，背景高 A：建议在细胞处理时加入全能核酸酶Benzonase Nuclease（货号RPE002），降低背景，保障实验的可重复性。Q：如何去除非特异性结合 A：可以通过以下两个步骤来实现：1. 取0.2-1mL蛋白样品，蛋白量约为0.2-1mg，加入约1ug和免疫沉淀时使用的IgG 种属相同的普通IgG和20uL充分重悬的Protein A+G Sepharose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。 2. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。 蛋白通过和 normal IgG、Protein A+G Sepharose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。 Q：种属相同的IgG是什么 A：所谓种属相同的IgG是指，假如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。 Q：一抗加多少 A：加入0.5-2ug 用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 Q：Protein A+G悬液是否为：TBS溶液？我们的悬液是否可直接用于实验？还是要先洗Beads A：不是TBS，是20%乙醇，实验前要先用PBS洗。 Q：我们的Protein AG重悬在20%乙醇中，使用前怎么处理 A：用多少取多少再处理，例如用一次，20ul用PBS冲洗后，如果做的是IP实验，那可以直接做后续的实验，不需要再用PBS重悬。
Q：Protein A+G Sepharose每次加入多少 A：加入10-20uL充分重悬的Protein A+G Sepharose，4℃缓慢摇动1-3个小时。 &☆注意：10-20uL Protein A+G Sepharose，即20-40uL50%充分重悬的Protein A+G Sepharose。 Q：一般1ug的抗体，用多少Sepharose A：1ug抗体，建议用10-20ul的Sepharose（也就是20-40ul 50%重悬的溶液），我们的Sepharose是保存在酒精中的，使用前要先用PBS洗的。 Q：吸除上清时离心条件 A：2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心。 Q：吸除上清时吸到一点Protein A+G Sepharose，有没有影响 A：宁可残留少量上清，也不能吸掉Protein A+G Sepharose。Q：用什么洗涤沉淀 A：用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次。 Q：洗涤沉淀用裂解液用量推荐多少 A：裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。 Q：洗涤时离心条件 A：洗涤时离心条件和吸除上清离心条件一样，即：2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心。 Q：离心洗涤后是否要去除上清 A：完成最后一次洗涤后，去除上清。Q：如何分离出样品 A：加入20-50uL 1xSDS-PAGE电泳上样缓冲液，震荡重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 Q：样品离心至管底后如何处理 A：沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳。 Q：暂时不用的样品如何保存 A：暂时不用的样品可以-20℃保存。Q：免疫沉淀适用什么样品 A：普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但推荐用新鲜的蛋白样品为佳。Q：免疫共沉淀适用什么样品 A：免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。Q：免疫共沉淀实验方法 A：与免疫沉淀方法相同。Q：免疫共沉淀实验过程中，细胞裂解时是否可以加入Benzonase A：推荐在细胞裂解时加入全能核酸酶Benzonase Nuclease（货号RPE002），降低背景，保障实验的可重复性。Q：能否冷冻保存Protein A+G Sepharose A：请勿冷冻保存产品。Q：未混合均匀 A：Protein A+G Sepharose Beads使用前要充分颠倒若干次，使Sepharose混合均匀。Q：能否常温实验 A：所有步骤中，蛋白样品 在4℃或冰上操作。 Q：可重复做多少次/是否可回收 A：可重复6-10次，避免纯化不同抗体而产生交叉反应。 && & 同样Pull-down实验，每次用量10-50uL，不推荐回收。如果用量大，每次0.5mL以上，可以pH2.5洗脱结合的抗体后，胶回收（用50mM NaOH洗涤，PBS冲洗后，保存在4度20%乙醇里）。 Q：所有蛋白样品需要在4°C或冰上操作的原因 A：避免蛋白变性。 Q：在使用Protein A+G Sepharose Beads时，怎么达到去除非特异性吸附的最佳效果 A：
可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的SDS洗涤抗体-Sepharose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。 Q：IP的实验步骤中，最后都没有将两个蛋白质分开的步骤，难道是在前面的步骤中相结合的两个蛋白质自己已经分开了吗 A：上样时要加Loading buffer，煮沸。这时所有蛋白都变性，自然就分开了。也有人先将蛋白洗下来再电泳。 Q：经常看到蛋白质免疫共沉淀后行Westernblot,我想问什么时候需要作免疫共沉淀？为什么不直接进行Westernblot 呢 A：通常，免疫共沉淀，是检测可溶性蛋白的步骤之一，而不是最终的方法。因为沉淀的蛋白，还需要进行进一步的检测。而后续的步骤大凡使用免疫印迹的方法去完成。如果做质谱分析，一般还要进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后回收。由于采用了免疫学的方法沉淀目的蛋白，使之蛋白的检测带有强烈的目的性。免疫共沉淀纯化蛋白的质量，与抗体化珠子（Beads）的质量和洗涤缓冲液的质量及其洗涤的方法。 Q：当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。这该如何避免 A：针对上述情况，通常有二种解决办法：
&&& 1． 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。
&&& 2． 使用交联剂将抗体和Protein A+G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-Sepharose beads复合物，最后离心去除抗体-Sepharose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。Q：能否做染色质（染色体）免疫共沉淀实验 A：能。 Q：是否BSA预封闭处理 A：Pull-down实验，一般不推荐BSA封闭。一般在实验中发现非特异吸附现象很严重是，才考虑加入BSA。
Q：是否针对任何实验，Protein A+G均可替代Protein A或Protein G？ A：是的。
Q：A+G与A或G相比优势是？ A：Protein a+g比Protein a或Protein g适合于免疫沉淀更多种类的抗体。
Q：条带淡可能原因？解决方法 A：1）最简单方法，增加实验样品的量和浓度。每毫升ProteinAG可以吸附20mg以上抗体，一般Pulldown实验，proteinAG都是过量的。 &&&& 2）延长proteinAG和样品的混合震荡时间（例如4度过夜），保证proteinAG和样品的充分接触。
Q：Sepharose对人或鼠lgG的亲和力如何 A：人的亲和力是1ml结合20mg以上 IgG，鼠大概3mg左右。
Q：一次性收集的细胞，大约0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF） A：&IP实验时候，推荐消化下来细胞后，直接用RIPA裂解液裂解。根据目的蛋白质的表达位置（细胞质、细胞核还是细胞器）可以选择抽提细胞亚组分。选择合适的强度的裂解液。蛋白酶抑制剂推荐用cocktail。
Q：是否需要将总蛋白用非免疫血清和Sepharose反应，去除非特异性结合蛋白，再来加抗体，接着加Sepharose A：&推荐用用非免疫血清preclear样品，降低非特异性产生的假阳性。
Q：如果需要先处理非特异性结合蛋白，那么非免疫血清，就是阴性对照的抗体（正常鼠IgG）吗 A：是的。
Q：未检测到目得蛋白或蛋白很少 A：1、提高样品量；2、降低buffer的离子强度。 Q：目的蛋白高背景 A：蛋白质背景高1、首先确认电泳体系、染色体系、WB体系没有错误；2、提高buffer的离子轻度；3、实验中增加preclear去掉非特异性吸附问题。
Q：能否用高浓度的变性剂 A：不推荐使用高浓度的变性剂尤其是强变性剂，容易使蛋白质变性造成实验失败。
Q：如何使用对照抗体 A：对照抗体选择同种未免疫的动物提取的血清中纯化的抗体，各种亚型都有商品化产品。
Q：能否几种抗体共同使用 A：几种抗体同时使用，可以但是不推荐。
Q：单克隆抗体的作用 A：单克隆抗体的优点是特异性高。 Q:抗体的特异性有多重要 A:特异性高的抗体能够有效的补货目的蛋白质同时降低背景。 Q:蛋白间的相互作用发生在哪里 A:蛋白质的相互作用位点需要其他实验来证明。欢迎大家将您的问题通过微信给我们留言，我们会在48小时内给予回复！七海生物(Support-7Sea)　
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【求助】免疫共沉淀裂解细胞时，细胞内本来没有结合的两种蛋白会结合到一起么？
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如题，如果蛋白A是在膜上，蛋白B在胞质，两种蛋白本身可以结合但由于定位不同，在细胞没有其他刺激时是不会结合到一起的。然加入温和的裂解液，比如免疫共沉淀的时候，会不会因为细胞裂解了，两种蛋白得以靠近而结合在一起呢？问题可能有点小白，脑子转不动想不明白了。
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不会的，免疫沉淀是检测生物状态下自然结合的两种蛋白，不知您可否将你的ip步骤发给我一份，，谢啦
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suzzywql不会的，免疫沉淀是检测生物状态下自然结合的两种蛋白，不知您可否将你的ip步骤发给我一份，，谢啦就是照着文献做的
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（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。
1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次；
Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.
2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；
Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).
3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的1.5EP管中。并置于低速摇床，4℃缓慢晃动15min；
Scrap cells off to clean 1.5ml eppendorf tubes with a clean, cold scraper. Put them on a low-speed rotating shaker for 15 min at 4°C.
4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中
Centrifuge at 14,000 g 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes immediately.
5. 将Protein A/G-agarose微球用PBS 洗两遍，用PBS配制成50%的protein A/G-agarose工作液；
Wash protein A/G-agarose beads for 2 times with PBS and make a 50% protein A/G agarose working solution (in PBS)
6. 在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G agarose工作液。水平摇床4℃摇动10min（该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白）
Add in 50% protein A/G agarose with ratio of 100μl for a 1ml sample solution. Shake on horizontal shaker for 10min, 4°C (This step aims to eliminate non-specific binding proteins)
7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除protein A/G-agraose微球；
Centrifuge 14,000g at 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes and discard protein A/G-agraose beads
8. 使用BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度
Quantify total protein with BCA assay or other methods.
9. 用PBS将总蛋白稀释到1 μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果你觉得你的目的蛋白的浓度低了，你可以将总蛋白浓度提高到10 μg/μl（假设浓度够的话）
Dilute the total protein to 1μg/μl with PBS to decline the concentrations of detergents. If you feel the concentration of your target protein is low, you can dilute the total protein to 10μg/μl. (if it’s high enough)
10. 加入一定体积的一抗，至总体积约为500μl；
Add in appropriate amount of primary antibody to approximately 500μl total volume.
11. 用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜
Slowly shake antigen-antibody complex on rotating shaker at 4°C for overnight.
注意：如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活测定，则最好将11步改为室温孵育2h；
Note: if downstream experiment is enzyme activity assay for kinase or phosphatase, it’s better to change step 11 to a 2h incubation at room temperature.
12. 14000g离心5s，收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的PBS）洗涤3遍（每次加入800μl）
Centrifuge 14,000g for 5s, keep the pellet and wash with pre-chilled washing buffer (or cold PBS) for 3 times. (800μl each)
13. （用合适体积的上样缓冲液重悬）收集上清，用于进一步的下游SDS-PAGE，western-blot或者质谱分析
Collect the supernatant to proceed to SDS-PAGE, western-blot, or mass spectra analysis.
注意：该CoIP操作步骤是将抗体先结合到Protein A/G-argarose微球上，然后再与抗原混合。相对其他方法，最终的得率较低，但避免了抗体共洗脱的问题。如果你希望获得高纯度的目的蛋白，而不考虑非特异性结合的话，你可以将抗体和蛋白样品在加入Protein A/G-argarose微球之前进行混合，这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来，从而可能会对western blot检测造成干扰。
Note: This Co-IP protocol is to bind antibody to the Protein A/G-argarose beads and then mix with the antigen. It gives lesser yield than the other one and avoids the problem of co-elution of antibodies. If you want to yield high purity of target protein regardless of non-specific binding, you can mix antibody with protein sample prior to addition of Protein A/G-agarose beads, thus in the end the antibodies are also co-eluted with target protein and interference might occurs in western blot detection.
参考资料：1. ;2. ;
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看起来也不是很复杂，以后可以用一用。
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