在蛋白质的分离鉴定技术中凝胶过滤和SDS-PAGE电泳均是利用凝胶,按照分子大小分离蛋白质分子为什么凝胶过滤时蛋白质分子越小洗脱速度越慢,而在SDS-PAGE电泳中,蛋白质分子越小,迁移速度越快
冷死wjAU92AD22
您要这道其中的原理就理解了.凝胶过滤时小分子进入凝胶的孔隙,大分子则直接洗脱,所以大分子先出来.电泳是利用蛋白质带电荷受到电场力和凝胶阻滞的作用,大分子当然跑得慢了.这两种胶是完全不同的,虽然中文翻译都叫胶
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凝胶过滤( Gel Filt ration ) 也称排阻层析( Exclusion Chromatography)、分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography ) 和凝胶层析( Gel Chromatography) 。凝胶一般是由葡聚糖的胶体溶液凝结而成的固体物质, 其内部具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应, 当凝胶装柱后, 柱床容积称为“ 总容积” ( Vt ) , 它由Vo、Vi 、Vg 三部分组成, Vt = Vo + Vg ,式中Vo 为“外水容积”, 或“ 孔隙容积”, 即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相容积; Vi 为“ 内水容积” 即凝胶颗粒内部所含水相的容积, 相当于一般层析法中的固相容积, 它可以从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得; Vg 为凝胶本身的容积,Vt - Vo = Vi - Vg。“ 洗脱容积” ( Ve ) 是指自加入样品开始到组分最大浓度( 峰) 出现时所流出的容积, 它与Vo 及Vi 关系为: Ve = Vo - Kd Vi , 式中Kd 为样品在两相中的分配系数, 即分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数, 它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关, 而与柱形状无关, 对特定物质来说是一常数。对一层析柱凝胶床来说, 只要通过实验得知某一物质的洗脱容积Vo , 就可求出其Kd 值, 上式可以改写为Kd = ( Ve - Vo ) / Vi , 式中Vo 可用不被凝胶滞留的大分子物质溶液求得, 如蓝色葡聚糖-2000 ( MW =2000000 U) , 血红蛋白, 印度黑墨水等; Vi 可用g·Wr 求得( g为干凝胶重, Wr 为凝胶的吸水量, 以ml/ g 表示) 。
目前使用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶。这些凝胶具有以下特点:化学性质稳定, 不与待分离物质发生反应, 没有或只有极少量的离子交换剂基团, 且有足够的机械强度。本实验用的是葡聚糖与还氧化氯丙烷通过交联反应制成的有孔颗粒状凝胶。交联程度越大孔径越小, 它不溶于有机溶剂, 能在水和电解质溶液中迅速溶涨。
不同型号的葡聚糖凝胶用英文G 表示, 如G-25、G-50、G-75、G-100 等, 后面的数字为凝胶吸水量乘以10。在实际工作中, 超细颗粒主要用于分辨率十分高的柱层析中, 细颗粒用于制备, 中等和粗颗粒用于低操作压下高流速的制备柱层析。根据凝胶层析的原理, 同一类型化合物的洗脱特征与组分的分子量有关, 流过凝胶柱时, 按分子大小顺序流出, 分子量大者走在前头。通常以Ka v ( Kd ) 对分子量的对数作图可得一曲线,称“ 选择曲线”, 曲线的斜率是凝胶性质的一个重要特征, 在一定范围内, 曲线愈陡分级愈好。在测定分子量时, 使用曲线的直线部分为宜。
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缓缓搅拌Sephadex 悬浮液, 然后慢慢倒入预先置好的层析柱中, 使凝胶床达到2 . 5 cm×30 cm, 上端出口管用螺旋夹控制。千万不能产生气泡。当凝胶已完全沉降后, 控制凝胶床上面的液面在5 cm 左右。
接着将待分离物质加到层析柱的上端(柱床上端的液面降至使凝胶刚好露出为止) , 用移液管吸取待分离的样品, 并使移液管尖端的位置大约在胶床上方的1 cm 处, 持好移液管, 勿变动位置, 然后缓慢而连续地将样品释放到凝胶床上层。移开移液管, 用10 ml 的试管放在部分收集器上收集从柱下端流出的溶液, 此时控制流速在每4 秒钟1 滴( 相当于60 ml/ h )。
当样品液刚好完全流入凝胶床时, 向柱上端很小心地添加缓冲液至合适高度, 以保证流速的稳定。注意, 切勿搅动柱上端的凝胶, 也不能使凝胶床上端无充裕的缓冲液甚至干涸。
先收集28 ml 流出液, 再开始按每管4 ml 收集, 连续收集并对每管编号, 当所有的有色物质均从层析柱中洗脱下来后,关闭螺旋夹停止洗脱。然后在对应的波长下读各管的光吸收值。葡聚糖( 650 nm 蓝色) ; 肌红蛋白( 500 nm 琥珀色) ; DNP-天冬氨酸( 440 nm 黄色)。
洗脱完最后一个谱带( 黄色) 后, 将1 ml 未知样品溶液加到层析柱内, 先收集28 ml , 然后按前述方法开始每4 ml 一管连续收集。如果蛋白质无色, 就在280 nm 波长条件下读光吸收值。
【结果计算】
Kd 值的计算: 利用每管的光吸收值对管的编号数作图( 注意前7 管里以28 ml 一次收集的, 第一个4 ml 管的编号应为8 ) ,应在每个峰位置标出测量波长, 画一个坐标图, 用观察法或算术平均法确定每个峰的确切位置。算术平均法的计算式: 峰中点=峰内每管编号乘以峰内连续各管的光吸收值之和, 再除以峰内连续各管的光吸收值。
对1 ml 未知样品也按上述法做。计算出肌红蛋白的Kd 和未知样品的Kd 值。
肌红蛋白和未知样品分子量的估算: 利用下表数据, 用已知蛋白质的Kd 值(纵坐标) 对lgMW 作图, 再算出肌红蛋白和未知蛋白的分子量。
在图中适当位置标明肌红蛋白和未知样品的Kd 和MW。
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生物选修1之蛋白质的提取和分离
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专题5 DNA和蛋白质技术
课题3 血红蛋白的提取和分离
一、选择题
1使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中(
解析:本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解,相对分子质量较大的蛋白质留在颗粒外面,相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部;蛋白质相对分子质量大的通过凝胶间隙先被洗脱,蛋白质相对分子质量小的进入凝胶内部而后被洗脱。
2关于凝胶色谱柱的装填,除哪项外均为正确解释(
A.交联葡聚糖凝胶(Sephadx G75)“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围,75表示凝胶得水值
B.色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡,必须重装
C.用300 mL物质的量浓度为20 mmol?L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h
D.凝胶用自来水充分溶胀后,配成凝胶悬浮液
解析:本实验中使用的交联葡聚糖凝胶(Sephadex G75),其中G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围,75表示凝胶得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果,因此,一旦发现有气泡,必须重装;在洗脱过程中,应在约50 cm高的操作压下,用300 mL物质的量浓度为20 mmol?L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h,以使凝胶装填紧密;凝胶溶胀时,应使用蒸馏水将其充分溶胀,制成凝胶悬浮液。 答案:D
3下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作,不正确的是(
A.加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B.让吸管管口沿管壁环绕移动,贴壁加样至色谱柱顶端,不要破坏凝胶面
C.打开下端出口,待样品完全进入凝胶层后,直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱
D.待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,每5 mL收集一管,连续收集流出液
解析:打开下端出口,待样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口,再用同样的方法小心加入适量的20 mmol?L的磷酸缓冲液,然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。
4使用十二烷基硫酸钠―聚丙烯酰胺电泳过程中,不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A.电荷的多少
B.分子的大小
C.肽链的多少
D.分子形状的差异
解析:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素,而十二烷基硫酸钠(SDS)可消除净电荷对迁移率的影响,故在此电泳过程中,迁移率只取决于蛋白质分子的大小。
5凝胶色谱分离法分离蛋白质时,凝胶的种类较多,但其作用的共同点是(
A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径
B.吸附一部分蛋白质,从而影响蛋白质分子的移动速度
C.将酶或细胞固定在凝胶中
D.与蛋白质分子进行化学反应,从而影响其移动速度
解析:凝胶的种类较多,但每一种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量小的容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
6将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r?min的速度离心10 min后,离心管中的溶液分为四层,从上到下的顺序依次是(
A.血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层
B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层 -1-1
C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层
D.甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层
解析:混合液经离心后,按密度大小排列,在离心管中从上到下的顺序依次是,第1层为无色透明的甲苯层,第2层白色薄层固体是脂溶性物质沉淀层,第3层红色透明液体是血红蛋白溶液,第4层暗红色沉淀物主要是红细胞破碎物沉淀。
7(2011?江苏南通期末)下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述,正确的是(
A.红细胞的洗涤:加入蒸馏水,缓慢搅拌,低速短时间离心
B.血红蛋白的释放:加入生理盐水和甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌
C.分离血红蛋白:将搅拌好的混合液离心、过滤后,用分液漏斗分离
D.透析:将血红蛋白溶液装入透析袋,置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h
解析:对红细胞进行洗涤时,应加入生理盐水,防止细胞破裂;将血红蛋白从红细胞中释放时,需要加入蒸馏水,以便使红细胞破裂释放出血红蛋白;透析时,应将透析袋置于pH 7.0的磷酸缓冲液中透析12 h。
8在血红蛋白的整个提取过程中,不断用磷酸缓冲液处理的目的是(
A.防止血红蛋白被氧化
B.血红蛋白是一种两性物质,需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内,维持其结构和功能
解析:利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于分离观察(红色)和研究(活性)。
9下面说法不正确的是(
A.在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变
B.缓冲溶液通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D.透析袋能使大分子自由进出,而将小分子保留在袋内
解析:透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。 答案:D
10蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述不正确的是(
A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性,可将样品中各种不同的蛋白质分离
B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等,可通过电泳分离蛋白质
C.根据蛋白质相对分子质量的大小,可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D.根据蛋白质的分子大小、密度不同,可通过离心沉降法分离蛋白质
解析:蛋白质分子不能透过半透膜,据此可利用半透膜除去样品中相对分子质量小的杂质。 答案:A
二、非选择题
11测定蛋白质的相对分子质量是研究蛋白质的一项重要技术。常用的测定方法是凝胶色谱法。请回答下列问题。
(1)凝胶色谱法的原理是 。
(2)还有同学将大肠杆菌破碎并提取得到大肠杆菌蛋白质,一同学利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离,在电泳过程中,影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子
,分子的大小、形状等。而另一位同学则利用凝胶过滤法分离蛋白质。待蛋白质接近凝胶色谱柱底端时,用试管连续收集流出液。先收集到的蛋白质与后收集到的蛋白质的区别是 。
答案:(1)根据相对分子质量的大小分离蛋白质 (2)带电性质的差异 先收集到的蛋白质相对分子质量较大,后收集到的相对分子质量较小
12凝胶色谱技术是20世纪60年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术,由于设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很高的分离效果,目前已经被广泛应用于多个领域,请回答问题。
(1)若选用Sephadex G100,则G表示 。
(2)通过凝胶色谱法可将从红细胞中分离出的血红蛋白样品进一步
,在血红蛋白的提取和分离实验中有以下操作,试回答:
①实验时要对采集到的血液中的红细胞进行洗涤,洗涤的目的是
的作用下,红细胞会破裂释放出血红蛋白。
③将释放出的血红蛋白收集到透析袋中透析,这是样品的
,而透析的目的是 。
④实验最后经过SDS―聚丙烯酰胺凝胶电泳进行
(3)装填凝胶色谱柱时,要注意色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现气泡必须重装。这是因为
解析:本题考查血红蛋白的分离和提取。血红蛋白分离和提取实验的操作分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步。整个实验的原理是依据蛋白质的各种特性分离蛋白质。 答案:(1)凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围 (2)纯化 ①去除血浆蛋白 ②蒸馏水和甲苯 ③粗分离 去除相对分子质量较小的杂质 ④纯度鉴定
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果
13随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因测序工作的完成,人类跨入了蛋白质时代。对蛋白质的研究和应用,首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题。
(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步:
和纯度鉴定。
(2)如果要从红细胞中分离出血红蛋白,实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠檬酸钠,这样做的目的是 。
(3)血红蛋白的提取又可以细分为:红细胞的洗涤、
、分离血红蛋白溶液
。其中分离血红蛋白溶液时需要用到
(仪器)分出下层的红色透明液体。
答案:(1)样品处理 粗分离 纯化 (2)防止血液凝固 (3)血红蛋白的释放 透析 分液漏斗
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答案A用凝胶过滤柱层析分离蛋白质是根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法,与蛋白质分子的带电状况无关.在进行凝胶过滤柱层析过程中,比凝胶网眼大的分子不能进入网眼内,被排阻在凝胶颗粒之外.比凝胶网眼小的颗粒可以进入网眼内,分子越小进入网眼的机会越多,因此不同大小的分子通过凝胶层析柱时所经的路程距离不同,大分子物质经过的距离短而先被洗出,小分子物质经过的距离长,后被洗脱,从而使蛋白质得到分离.
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