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关于红细胞裂解液，那些你不知道的秘密
红细胞裂解液是一种比较温和的红细胞去除方法。几部损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代细胞培养、细胞日平和、核酸与蛋白的分离和提取等。红细胞裂解的原理红细胞表面上有红细胞专属的表面抗原，当裂解液中含可以攻击特定红细胞表面细胞抗原的酶的时候，就只会造成红细胞的变形，生物通道扩大、膨胀、裂解，而不会攻击其他细胞。另外红细胞有自己的电负性、渗透脆性、悬浮稳定性、这都是区别于其他种类细胞的区别点。红细胞裂解液就是利用这些特性裂解红细胞的。红细胞裂解液的使用说明1. 1倍体积的新鲜全血，加入3倍体积的红细胞裂解液。如1ml新鲜全血加入3ml红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒混匀。
2. 冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。
3. 收集细胞：4℃，450×g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。
4. 向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬白细胞。如起始血液为1ml，则加入2ml的红细胞裂解液。
5. 4℃，450×g离心10分钟沉淀白细胞，小心并彻底吸去上清液。
6. 重悬细胞，用于后续实验；如提取RNA，最好于此步开始使用DEPC水配制的溶液进行操作。红细胞裂解液的配置方法：取100 μl抗凝全血，加2 ml应用液3，混匀15～20 s；加4 ml应用液1#，混匀15～20 s；300×g离心2 min，弃上清；收集沉淀，加PBS缓冲液，制成白细胞悬液，备用。（这种红细胞裂解法满足了白细胞流式细胞仪检测分选要求，价格低廉，是一种简便快捷、经济实用的白细胞纯化分选方法。）红细胞裂解液的注意事项1、本裂解液为无菌产品，分离细胞用于细胞培养时请注意无菌操作。2、为了您的安全与健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。3、0x 储存液储存于2-8°C不能超过半年(六个月);4、使用时根据需要稀释,每次用都应用去离子水新鲜配制工作液,当日用不完的可废弃。北京索莱宝科技有限公司为红细胞裂解液生产厂家，货号为R1010，常卖规格为100ml 、500ml。索莱宝生产的红细胞裂解液是利用细胞内外存在盐离子浓度差而导致细胞膜胀破的原理来裂解无核红细胞的。产品经过无菌处理，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。
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、组织样品采集1. 首先准备好用于包装样品的铝箔或冷冻保存管，并且用油性记号笔在铝箔或冻存管外表多处写明样品编号。2. 准确切除所需组织。3. 离体新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。4. 在RNase-free 的0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。5. 用准备好的铝箔或冷冻保存管装载包裹组织，迅速投入液氮冷却。6. 把样品袋（纱布袋等）放入液氮中冷冻一下，而后将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织，样品较多时应分装至多个小袋，不要在一只样品袋中放过多的样品以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出），袋口留一根编号绳，绳上粘2 张标签纸（标签上注明：客户名、样品名称、编号、日期，粘2 张标签纸是为了防止标签脱落造成样品混乱），迅速转入液氮罐。7. 填写样品登记单，写明样品名称、组织类型、编号、取样日期、样品处理过程等情况。注意事项1. 对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。2. 不要用 Eppendorf 管保存组织样品，因为 Eppendorf 管从液氮中取出时极易发生爆裂而造成样品损失。3. 步骤 2～5应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品RNA降解 。4. 在临床手术过程中采集的病理或正常样品，如果没有条件立即从手术室中取出进行后续处理，请在切除后立即转移到液氮中保存。二、细胞及血液样品采集贴壁细胞1. 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；2. 按每10 cm2 培养面积加1 mL TRIzol 试剂的比例加入TRIzol 试剂；3. 用1 mL枪头反复吹打, 使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面进行充分消化；4. 转移到RNase-free 的试管中用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液应该为清亮而且不粘稠的状态；5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。悬浮细胞6. 悬浮细胞培养或处理结束后，去除培养液；7. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；8. 按照每5×106 个细胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；9. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。血液1. 在已加入抗凝剂的新鲜全血中加入等体积PBS（1×），充分混匀；2. 缓慢转入另一已加入淋巴细胞分离液的离心管中，并使上述混合液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），3000 g 离心30 min；3. 用移液枪小心分离出白细胞层；用PBS（1×）清洗白细胞，离心回收白细胞，弃去上清；4. 加入白细胞20倍体积的TRIzol 试剂，用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；5. 放入干冰或-80℃冰箱中保存。三、总RNA 样品制备操作流程1. 用于RNA 提取的试剂及其他物品必须为RNase-free 的，并且尽量在洁净、不通风的环境中进行实验。2.应当选用自己熟悉的或公认可以得到良好实验结果的提取方法（如使用EasyExtract、TRIzol或RNeasy ）进行RNA 的提取。3. 可以根据实际需要选择RNA 的保存方法：需要长期保存的RNA 样品保存于75％乙醇中；无需长期保存的RNA 样品保存于RNase-free 的双蒸水或Elution buffer 中，样品浓度不应低于3μg/μl (需要扩增的样品浓度不应低于0.2μg/μl)。4. RNA质量，即A260/A280比值应在2左右，总RNA电泳检查需要有清晰的18s和28s rRNA条带，同时28s/18s的比例应在2：1以上，70°C 水浴保温1 小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。四、其他的样品处理方法RNAlater1．简介&&& RNAlater 是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA 于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater 中保存，而不会引起RNA 的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。RNAlater 应保存在室温下，保质期6 个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。RNAlater 可广泛应用于多种脊椎动物样品。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater 对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。RNAlater 可与大多数RNA 提取方法相协调。特别是TRI Reagent., RNAwiz, TōTALLY RNA,RNAqueous, and Poly(A)Pure。2. 如何使用RNAlater&&& RNAlater 只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater 之前不能冷冻组织。简单切碎组织样品，任何一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNAlater 中保存。动物组织&&& RNAlater 不会溶解或破坏组织样品的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater 溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater 中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater 中。植物组织& 许多植物组织可以简单浸泡在5 倍体积的RNAlater 中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater 进入组织。组织培养细胞&&沉淀细胞，用PBS 洗一次，再用少量的PBS 悬浮细胞，然后加5~10 倍体积的RNAlater 保存。白细胞&&如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNAlater 中。不要将全血、血浆或血清中的RNA 保存在RNAlater 中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater 混合后易形成不溶的沉淀。细菌&&& RNAlater 是抑菌的，虽然细菌在RNAlater 中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater 中4℃条件下1 个月仍很完整，产生不降解的RNA。3. RNAlater 中样品的保存保存于-80℃& 建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater 溶液中取出样品保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于RNAlater 溶液中并未出现溶解。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。保存于-20℃& 建议用于批量保存。将样品在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样品在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA 提取。样品可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA 的质和量都不会受到影响。保存于4℃& 目前尚无证据证明样品存于4℃ 1 个月内会出现RNA 降解。如果没有冰箱：& 将样品放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater 中的样品冰浴数小时。4. RNAlater 中样品的RNA 提取组织& 用消毒镊子将组织从存贮溶液RNAlater 中取出，浸泡在RNA 提取溶液中。一旦将组织放入RNA提取溶液中，匀浆一定要迅速进行。细胞&从存贮在RNAlater 中的细胞中提取RNA 有两种操作方法可供选择：去除RNAlater 或者从细胞与RNAlater 的混合物中直接提取RNA。5. 从RNAlater 中取出样品去除RNAlater& 因为RNAlater 的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高，因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNAlater 中的细胞。离心沉淀细胞，去除RNAlater。（HeLa 细胞大约需要3000×g，但其他细胞可能不能容忍这个速度，或者他们需要更大的离心力。）从RNAlater 中的细胞直接提取RNA& 作为选择，我们可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent 和RNAwiz）从没有去除RNAlater 的细胞中纯化RNA。这可通过向细胞混合物中加入10 倍体积的一步提取溶液完成，其他照常。RNAsecure：1.简介在分子生物学试剂中用的RNAsecure 代替DEPC，有很多优点：1) 可以加入到不能用DEPC 处理的溶液中（如：Tris 或MOPS 缓冲液）；2) 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；3) 可以加入到加酶之前的酶促反应中。有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA 多聚酶T7，T3 和SP6 的体外转录（37℃），MMLV 和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。2. 使用方法1) 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure 试剂到1×，充分混匀。2) 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可备用于接下来的RNA 提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。3) 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA 酶的污染，在使用前可以将RNAsecure 溶液在60℃水浴中重新温浴10~20 分钟。3. 注意事项&&&&RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure 处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。五、样品制备常用仪器和试剂及耗材1. 常用试剂及耗材DEPC TRIzol Reagent氯仿：异戊醇一次性注射器及针头Qiagen RNeasy Mini kitQiagen RNAlaterAmbion RNAsecure ReagentTip（RNase-free）微量离心管（RNase-free）2.样品制备过程中使用物品的RNase-free处理RNase-free 水：0.1%DEPC 处理（用磁力搅拌器搅拌过夜），高压灭菌。氯仿无水乙醇(新包装开封后注明RNA专用)75%乙醇：用RNase-free 的水配制。离心管和冷冻保存管以及Tip头浸泡在0.1%DEPC 水中过夜，干燥后高压灭菌。其他玻璃或金属器具用铝箔纸包裹后180℃干烤过夜。任何接触样品的操作需佩戴一次性手套,避免直接接触样品。
追问：补充：1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？ 2)RNAgents(R)总RNA提取系统的工作原理怎样？ 3)RNAgents(R)总RNA提取系统的一般得率是多少？ 4)RNAgents(R)总RNA提取系统的各组分的功能是什么？ 5)RNAgents(R)总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？ 6)对初始材料的用量有什么限制？ 7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？ -------------------------------------------------------------------------------- 1)Promega有哪些系统用于提取总RNA及poly(A)+RNA？ Promega用于提取总RNA及poly(A)+RNA的系统包括： ：用RNAgents(R)总RNA提取系统从组织及培养的细胞中提取总RNA。 ：用SV总RNA提取系统从组织，血液及培养的细胞中提取总RNA。 ：用PolyATtract(R)mRNA提取系统从总RNA中提取poly(A)+RNA。 ：用PolyTtract(R)ystem1000从组织及培养的细胞中提取poly(A)+RNA。 ：用PolyTtract(R)Series 9600TMmRNA从少量样品中快速提取mRNA（cDNA第一条链的纯化）。 2)RNAgents(R)提取总RNA提取系统的工作原理怎样？ RNAgents(R)总RNA提取系统用溶剂法为基础，从多种材料中快速，有效地提取总RNA。 简单而言，有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩。用RNAgents(R)总RNA提取系统所得RNA纯度好，用途广，适用于PolyATtract(R)mRNA提取系统。如RNA中必须完全去除染色体DNA，需用1-2个单位的无RNA酶污染的DNA酶处理。然后用65oC加热10分钟，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。 3)RNAgents(R)总RNA提取系统的一般得率是多少？ 得率受多个因素的影响，包括组织来源及培养的细胞数。如提取的RNA量多，可通过光吸收测定（A260读数）来定量RNA， 1OD=40ugRNA。 RNAgents(R)总RNA提取系统的一般得率 组织 总RNA得率 Hela细胞 1.6mgRNA/10的8次方个细胞 鼠内脏 2.3mgRNA/g组织 鼠脾 8.3mgRNA/g组织 鼠肺 1.9mgRNA/g组织 鼠肾 3.1mgRNA/g组织 鼠肝 8.1mgRNA/g组织 4)RNAgents(R)总RNA提取系统的各组分的功能是什么？ (1) 变性剂: 柠檬酸钠溶液中含亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸 。可变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA。这些试剂还可有效抑制核酸酶。 (2) 苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。 (3) 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA所需。 (4) 异丙醇：沉淀浓缩RNA。 5)RNAgents(R)总RNA提取系统中平衡的苯酚：氯仿：异戊醇的配比是多少？ 苯酚：氯仿：异戊醇的配比是125：24：1，用42mM柠檬酸钠溶液平衡(pH4.3-4.7)。这一配比可有效去除染色体DNA。残留染色体DNA会干扰RT-PCR。 6)对初始材料的用量有什么限制？ 最初的设计方案是用作提取比较大量的RNA，RNAgents(R)总RNA提取系统可从5mg 组织，或5倍10的5次方的细胞中提取RNA。少量RNA提取的步骤可见RNAgents(R)总RNA提取系统技术手册TB087。初始材料用量的上限是每次用1g组织。只能找到这么多了，希望对你有所帮助，望采纳、
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在提取血红蛋白的样品处理阶段，洗涤红细胞十分重要，其目的是A.让红细胞破裂，释放血红蛋白B.洗去血浆蛋白C.防止血液凝固D.保证红细胞的正常形态
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在提取血红蛋白的样品处理阶段，洗涤红细胞十分重要，其目的是A.让红细胞破裂，释放血红蛋白B.洗去血浆蛋白C.防止血液凝固D.保证红细胞的正常形态
试题答案：
试题解析 ：
提取血红蛋白时，洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续的分离纯化。
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标题: 关于组织蛋白提取时红细胞裂解液的使用方法，困惑中
摘要: [关于组织蛋白提取时红细胞裂解液的使用方法，困惑中] 我们上次提取组织蛋白的时候，没有应用红细胞裂解液，导致WB内参表达的结果：正常组织的内参量远远低于癌组织的内参量，无论怎么增加正常组织的上样量，均无法将内参调齐。 今天我们按照园子里战友的方法，应用了红细胞裂解液，结果蛋白定量结果，蛋白浓度非常之低。 现将两次的步骤总结如下，请各位同学帮忙分析改进一下，谢谢。毕业在即，焦头乱额…………
关键词:[裂解液 红细胞 蛋白提取 内参 参量 冰浴 蛋白浓度]……
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未用RBC裂解液应用RBC裂解液下次提蛋白需改进的地方组织称重50mg75mg 2mlEP管 PBS洗净组织表面的血
冰上剪碎不能剪得太碎？RBC裂解液 500ul，冰上裂解30min以上减少至200-300ul 12000rpm4度离心5min，弃上清 蛋白裂解混合物200ul300ul
超声裂解忘记超声裂解（败笔）超声裂解？冰上裂解冰浴过夜冰上裂解1h以上（未过夜）冰浴过夜？12000rpm4度离心10min，吸取上清 酶标仪蛋白定量OD值1.5-2.5之间0.2-0.6之间，蛋白浓度极低
上样量15ul/20ug只能勉强配成15ul/12ug WB内参表达结果正常组织远远低于癌组织尚未做WB，结果待补充
谁来帮忙分析一下，谢谢啦。急呢，今天又提了一组，按照第四列改进了一下，不知道结果如何。
组织中提取蛋白不一定要用红细胞裂解液，你是什么组织？
组织中提取蛋白不一定要用红细胞裂解液，你是什么组织？是胃癌术后的标本，不是术后马上就取的材。是病理科取材后，我们才取的，拿回来放到-80冻存的。之所以要用红细胞裂解液，是因为提蛋白定量后，跑出的内参，正常组织比癌组织的内参蛋白表达量远远低于癌组织。而提出的蛋白液，正常组织非常红，癌组织却不，考虑是血红素的原因。
胃癌术后的标本，取癌组织及癌旁的正常组织。不是术后马上就取的材。是病理科取材后，我们才取的，拿回来放到-80冻存的。
你裂红的时间是不是偏长了？组织的话，先制成单个细胞悬液后，按1:3-5体积的量，加入红细胞裂解液，裂解不要超过15Min.
你裂红的时间是不是偏长了？组织的话，先制成单个细胞悬液后，按1:3-5体积的量，加入红细胞裂解液，裂解不要超过15Min.非常感谢
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