工具类服务
编辑部专用服务
作者专用服务
多胺在体外转录中对RNA合调节作用的研究
学科专业：
授予学位：
学位授予单位：
导师姓名：
学位年度：
本文读者也读过
相关检索词
万方数据知识服务平台--国家科技支撑计划资助项目（编号：2006BAH03B01）(C)北京万方数据股份有限公司
万方数据电子出版社关注今日：29 | 主题：276089
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】血液rna提取浓度低，怎样使其浓度高从而用于反转录
页码直达：
这个帖子发布于5年零314天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请高手出手相救啊提取血液RNA的浓度很低，用于下面的20ul反转录体系（最大的rna量不能超过1ug），我是900ng的rna来反转录，提取rna浓度太低，加入的rna体积会超过20ul体系，怎么办。我也尝试过将2管获得的血液组织合并成一管，离心去上清，取下面的（应该含有很多血细胞），然后加1ml trizol提取rna，可是还是很低。如果血液不离心的话那么我们用的一般的ep管里就盛不下1ml trizol和血液了，那如果血液很多，trizol很少（小于1ul）的话可能也提不好吧。可不可以找一个大一点的ep管，然后将几管的血液合并在这个管子里（血液1.5ml），然后再加适量trizol（0.2ml）来提取rna。还有，血液提取rna，用液氮研磨血液冷冻固态 是不是比直接在血液溶液中加trizol效果好啊
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园中级站友
血液能取多少量？建议先用淋巴细胞分离液分离白细胞再提取RNA。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yoyololo 血液能取多少量？建议先用淋巴细胞分离液分离白细胞再提取RNA。请问怎么用淋巴细胞分离液分离白细胞，弱弱的问题，我不懂啊，请您赐教啊，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园中级站友
chendarid 请问怎么用淋巴细胞分离液分离白细胞，弱弱的问题，我不懂啊，请您赐教啊，谢谢商品化的，大鼠、小鼠、人的淋巴细胞分离液都有，天津瀚洋生物制品公司有卖，你上网查查电话。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yoyololo 商品化的，大鼠、小鼠、人的淋巴细胞分离液都有，天津瀚洋生物制品公司有卖，你上网查查电话。好的 谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你可能不知道提取血液有专门的血液样品的trizol LS invitrogen公司出的专门提取液体样品的TRIZOL LS吗？有人用过北京艾德莱的这个产品可以简单快捷稳定的提取你需要的RNA,而且浓度高。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢，非常不错
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chendarid 请高手出手相救啊提取血液RNA的浓度很低，用于下面的20ul反转录体系（最大的rna量不能超过1ug），我是900ng的rna来反转录，提取rna浓度太低，加入的rna体积会超过20ul体系，怎么办。我也尝试过将2管获得的血液组织合并成一管，离心去上清，取下面的（应该含有很多血细胞），然后加1ml trizol提取rna，可是还是很低。如果血液不离心的话那么我们用的一般的ep管里就盛不下1ml trizol和血液了，那如果血液很多，trizol很少（小于1ul）的话可能也提不好吧。可不可以找一个大一点的ep管，然后将几管的血液合并在这个管子里（血液1.5ml），然后再加适量trizol（0.2ml）来提取rna。还有，血液提取rna，用液氮研磨血液冷冻固态 是不是比直接在血液溶液中加trizol效果好啊 谢谢用trizol法提取血液RNA不少，2ml血最多能提取到10000ng左右
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
clariceerica 用trizol法提取血液RNA不少，2ml血最多能提取到10000ng左右谢谢 请问trizol多少钱 可以使用多少次
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chendarid 谢谢 请问trizol多少钱 可以使用多少次你用的不就是trizol吗？不过血液中丰度较低，你可以试下试剂盒
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
gaoyongxin 你用的不就是trizol吗？不过血液中丰度较低，你可以试下试剂盒我用的是宝生物的rna PULS ，提取血液RNA的浓度比较低，不知道有没有什么好的试剂盒，性价比比较高的可以专门对付血液RNA，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chendarid 谢谢 请问trizol多少钱 可以使用多少次100ml 1500块左右 每2ml血用1mltrizol
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
clariceerica 100ml 1500块左右 每2ml血用1mltrizol谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
chendarid 谢谢我这边用的是100ml 800 不过不是原装100ml的 是分装的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
gaoyongxin 我这边用的是100ml 800 不过不是原装100ml的 是分装的是专门提取血液的rna试剂盒吗 效果怎么样 谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
您提的是血液的什么成分啊，全血，血清还是白细胞啊？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
陈沫518 您提的是血液的什么成分啊，全血，血清还是白细胞啊？全血
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
血清，trizol ls regent ,50-60ug/ml,1.8-2.0，我试过好多次，都是这样的浓度，不影响后续实验的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
提取RNA 不都要先裂红，再加trizol吗
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园【求助】蛋白纯化后浓度太低怎么办？ - 经验共享 - 分析测试百科网 - 分析测试百科网
月度关注热点
【求助】蛋白纯化后浓度太低怎么办？
查看完整版本请点击这里：
请教：我的His融合蛋白是可溶蛋白，分子量较小，只有11KD左右，亲和层析纯化后浓度过低，用SDS-PAGE电泳检测都看不出条带，用BCA分析法检测浓度只有几十微克/毫升,已试过加尿素，500mM咪唑，800mM咪唑洗脱，都无效。本人刚学做蛋白纯化不久，遇上这个问题一直解决不了，郁闷呐！求各位高手出出主意！查看完整版本请点击这里：
ritou1985 ( 11:53:45)
用PEG20000浓缩，透析袋选择分子量小于你目的蛋白分子量的（8000或者更小）
方法是将你要浓缩的蛋白加入到透析袋中，然后将透析袋直接放入有少量PEG20000的器皿中（要直接接触），整个过程在4度冰箱中进行，浓缩时间看你的透析袋的大小，一般几个小时即可，切忌浓缩时间过长以至蛋白干燥
wmp1234 ( 11:54:17)
谢谢各位，由于实验条件有限，（没有透析袋等）如果用亲和层析的方法，能够再通过优化条件来纯化吗？
biabiade ( 11:54:34)
如果只是想看到条带的话，用银染吧。
如果想吧蛋白浓度提高一点的话，纯化时减少凝胶的体积，增加洗脱液中的咪唑浓度。
yes4 ( 11:54:50)
个人觉得还是表达条件和纯化条件没摸好！
还是从这两个方面着手，否则都是空谈，再浓缩怎么弄都不行啊，SDS-PAGE都看不出条带来，一点意义没有啊
chuntian1983 ( 11:55:08)
如蛋白之安基所言，优化表达和纯化是王道。
估计你的表达量量不是很高，能不能通过换载体提高表达量呢，事实上，10K多一点的蛋白的确不是很好表达。我折腾一个9K的多肽很久了，就是量太低，现在基本放弃。
表达没有问题了再考虑纯化。
如果你仅是要一点点蛋白做个小实验，到也可以通过亲和富集来实现。貌似你的蛋白洗不下来，我是猜得，呵呵。
是不是结合力太强呢？你加尿素是这个目的的吧？500mM的咪唑一般都是可以的了。也可以尝试加NaCl看看，是不是有离子作用。
是不是还有一种可能，你的蛋白质疏水性比较强啊，这样的话就不是很好办了，可以先用相关软件预测一下。
bling ( 11:55:25)
想问一下，可以通过什么软件分析蛋白质的疏水性可抗原决定簇？
jiushikeshui371 ( 11:57:26)
如蛋白之安基所言，优化表达和纯化是王道。
估计你的表达量量不是很高，能不能通过换载体提高表达量呢，事实上，10K多一点的蛋白的确不是很好表达。我折腾一个9K的多肽很久了，就是量太低，现在基本放弃。
如果真是表达量低话，换载体能提高表达量嘛？能否举个例子说说，谢谢。换载体的话又是通过什么方式提高了表达呢？
zbboom ( 11:57:51)
增加诱导菌液体积，然后用更少的洗脱液浸泡柱子，然后离心得到高浓度的洗脱蛋白。
nn255 ( 11:58:23)
想问一下，可以通过什么软件分析蛋白质的疏水性可抗原决定簇？
================================
DNA Star 软件 还比较好用，试试吧
查看完整回复请点击这里：体外转录试剂盒说明书-五星文库
免费文档下载
体外转录试剂盒说明书
导读：使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上，1.解冻冷冻的试剂，所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，（对于T7和T3试剂盒，此试剂盒专为体外转录合成高产量的RNA的纯化所设计，包括可能抑制体外翻译的未合成的加帽模拟物，使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上转录反应步骤和孵育1.解冻冷冻的试剂把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。vortex10×reactionbuff
使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上
转录反应步骤和孵育
1.解冻冷冻的试剂
把RNA聚合酶混合物放置在冰上，它在甘油中保存，没有被保存在-20。
vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解，一旦解冻，反应过程中把 2×NTP/CAP放在冰上，10×reaction buffer保存在室温，
所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心，以防丢失或污染到离心管边缘的物质。
2.室温下转录反应
如果反应在冰上进行，10×reaction buffer中的亚精胺可以与模板中的DNA共沉淀， 离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。
以下是一个20ul的反应体系，可按需要放大或缩小。
当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系
(用0.1-0.2ug PCR产物模板 或0-1ug线性质粒模板）
对于更长或更短的转录，参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。
当合成转录的长度大于5或6KB时，限制GTP生成率，会导致产量降低、过早终止转录。为了避免这种情况，可能需要补充额外的GTP支持反应。下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。
（对于T7和T3试剂盒，提供的GTP为30mM。对于SP6，为20mM.）
应该添加多少额外的GTP?
对于5-8KB的长度，我们建议最初测试加入1ul的GTP，对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。添加GTP将减少转录合成加帽的比例，但将引起产量升高。加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。
RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡
在网织红细胞溶解物中，我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。（表1）
网织红细胞球蛋白的RNA的翻译依赖于CAP。随着GTP的CAP模拟物增加，RNA的产量减少。相反，合成的RNA的翻译效率随着模拟物的比率增加而增加，这反映了5’端加帽的转录的增加。注意GTP的CAP模拟物为4:1时提供了一个很好的RNA产量和加帽效率的平衡。没有加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。这些未加帽的转录很可能迅速的被卵母细胞降解。
除了加入不同比率的m7G(5')ppp(5')G，T7-mMESSAGE mMACHINE 反应在标准条件下进行。使用1ug的T7球蛋白模板DNA 37度孵育1h。球蛋白RNA (6 μg/mL)在25ul的Retic Lysate IVT?进行翻译，加入12.5 μCi of [35S]蛋氨酸(1200 Ci/mmol)，30°C反应 60 min 。测量TCA-可沉淀 cpm 的量。
3.彻底混匀
轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物，短暂低速离心，收集管底的反应混合物。
4. 37度孵育1hr
一般来说，孵育1h后可获得80％合成。对于最大化合成，建议孵育2h。由于SP6反应稍微慢于T3和 T7反应，它们尤其可能受益于第2h的孵育。
对于合成《300base的转录和转录效率低下的模板，建议第二个小时的孵育。
如果反应是示踪标记：孵育后（TURBO DNase 处理前或处理后），通过TCA共沉淀可等分的放射性标记示踪反应来评价产量(see step 5., “Quantitation by trace radiolabeling” on page 14)
5.可选步骤
加入1ul TURBO DNase，37℃孵育15min。
DNase处理可清除模板DNA，对一些应用来说并不必要，因为相对于RNA来说，模板DNA的浓度非常低。
a.加入1ul TURBO DNase,混匀
b.37℃孵育15min
转录反应后所需要的净化程度取决于RNA的用途。以下是四种不同的方法，根据你的用途选择一种或多种。
1.MEGAclear? Kit
此试剂盒专为体外转录合成高产量的RNA的纯化所设计。快速、简单的去除RNA中的核苷酸、短的寡核苷酸、蛋白。回收的RNA可用于任何需要高纯度RNA的实验。
2.氯化锂沉淀
氯化锂沉淀法是一种简单有效的可除去未合成的核苷酸和大部分蛋白质。但它并不沉淀转移的RNA，也不沉淀小于300核苷酸的RNA。同时，为了保证沉淀效率，RNA的浓度至少应在 0.1 μg/μL。 mMESSAGE mMACHINE?反应获得的RNA产量相对较低，下面第一步加LiCL沉淀液之前不用水稀释转录产物
A.加入30ul Nuclease-free水、30ul LiCL沉淀液，终止反应，沉淀RNA。
B.彻底混匀，-20℃冷却30min。
C.4℃ 最大速度离心15min to pellet RNA
D. 小心移去上清，用1ml 70％乙醇清洗pellet一次，重新离心
E.尽可能吸取上清液并弃去，将沉淀物晾干，用无核酸酶的水将沉淀完全溶解，确定cRNA 的最终浓度，在-80
℃超低温冰箱中长期保存留用。
3旋转柱层析法
离心柱可去除未合成的核苷酸，包括可能抑制体外翻译的未合成的加帽模拟物。 Prepared spin columns such as NucAway? Spin Columns can be used by
following the manufacturer’s instructions. Alternatively, instructions for
preparing spin columns are given in section “ Spin column preparation and use”
on page 22
4.苯酚：氯仿提取和异丙醇沉淀
这是最严格的纯化转录的方法。可以去除所有的酶、大部分的核苷酸。由于RNA被沉淀，这种方法也可以用于交换缓冲液。
a. 加115 μL 无核酸 水 和15 μL Ammonium Acetate Stop Solution, 彻底混匀。
b. 加入等体积的氯仿，静置3min，回收水相，转移到新管。
C.加入一体积（与水相体积相同）的异丙醇，混合均匀。
D 20℃下冷却混合物至少15min,4℃下最大转速离心15min，得到RNA沉淀。小心去除上清，按照需要用合适的水或buffer溶解DNA。
e. Store frozen at C20°
包含总结汇报、办公文档、党团工作、资格考试、旅游景点、IT计算机、word文档以及体外转录试剂盒说明书等内容。
相关内容搜索解决时间: 15:25
(共有<span
style="color:#FF位秀友关注过此问题)
我做荧光定量PCR没有测RNA得浓度就反转录成cDNA，定量结果与预计的相差很远，能有办法补救不？我后来测了cDNA的浓度（用核酸蛋白测定仪ssDNA测得），但是也是没有什么比例可言，原本想通过cDNA的浓度的比例来矫正下定量结果。
提问者： [] [] []
回答者： [] [] []
一级 一星助者
&可以做内参来矫正，先做半定量吧，先把内参矫正了再说&&你的cDNA纯化过没有？没有纯化测OD是命运意义的
欢迎对最佳答案进行评论或补充，发表您的不同见解！
呵呵，谢谢您的回答，我做的是绝对定量，没有内参，用标准品绘制了标准曲线，而且cDNA没有纯化，我还想问下组织样品在-80冰箱放了一年半了还能抽出RNA吗？非常感谢
作者：yinqi234 时间： &共0人支持此评论
找到"我做荧光定量PCR没有测RNA得浓度就反转录成cDNA，定量结果不是预计的，能有办法补救不？"相关问题约605篇，用时0.078126秒
生物秀旗下专业的学术问答社区，为生命科学和医药领域的专业人员提供互帮互助的交流平台。秉承“人人为我，我为人人”的互助理念，让给予成为一种生活方式！
联系我们[Contact Us]：E-mail：
电话：021-
关于我们 [About Us]
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT(Biology Technology)的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和相关企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
生物秀旗下 [Website]