PCR反应体系、特点、条件及其优化
标准的PCR反应体系： PCR反应体系由反应缓冲液（10&PCR
Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。
　　　10&扩增缓冲液 　
　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L
　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　根据要扩增的DNA序列设计
　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　
　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　Mg<span STYLE="CoLor: #+　　　　　　
1.5mmol/L　Mg与dNTP、DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才被DNA聚合酶识别
　　　加双或三蒸水至 　100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
<span STYLE="CoLor: #、引物：
引物是PCR特异性反应的关键，PCR
产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：&#9312;引物长度：
15-30bp，常用为20bp左右。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5&#8451;
在引物长度大于20bp时：62.3&#&#8451;(%G-C)-500/length-5&#8451;
&#9313;引物扩增跨度：引物扩增跨度是指两个引物之间需要扩增的DNA片段的长度,以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
&#9314;引物碱基：引物的3'含有G或C碱基可以提高引物的特异性。所谓的GC夹有助于保证引物3'的正确结合因为GC残基较高的氢键，这就提高了引物的特异性。末端含有T碱基的引物容易降低特异性。存在GC保证引物有足够同目的片段的结合力，同时又保证3’端的特异性，不会有太多的非特异产物。G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
一对引物的GC含量和Tm值应该协调，若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
&#9315;避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其&#9651;G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR
反应不能正常进行。
&#9316;引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
&#9317;引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子很有好处。
&#9318;引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
　引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。&
&<span STYLE="CoLor: #、酶及其浓度：目前有两种Taq
DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
<span STYLE="CoLor: #、dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M
NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，
-20&#8451;冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(
等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
4、模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS
还能与蛋白质
结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，
要防止RNase降解RNA。<span STYLE="CoLor: #、Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq
DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的优化
　　1．反应缓冲液：一般随Taq
DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM
Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM
MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。
　　2． dNTP
：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
　　3． Taq
DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。
　　4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
　　&#9332;
引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55&#8451;［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。
　　&#9333;
引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。
　　&#9334;
人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。
　　&#9335;
引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。
　　&#9336;&
引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20&#8451;。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
　　5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq
DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。
PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。PCR反应条件的选择
　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
　　温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95&#8451;变性，再迅速冷却至40
～60&#8451;，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75&#8451;，在Taq DNA
聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94&#8451;变性，65&#8451;左右退火与延伸(此温度Taq
DNA酶仍有较高的催化活性)。
　　&#9312;变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93&#8451;～94&#8451;lmin足以使模板DNA变性，若低于93&#8451;则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
　　&#9313;退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40&#8451;～60&#8451;，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA
比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55&#8451;为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10&#8451;)
　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
　　&#9314;延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　70～80&#核苷酸/S/酶分子
　　70&#8451; 60核苷酸/S/酶分子
　　55&#8451; 24核苷酸/S/酶分子
　　高于90&#8451;时， DNA合成几乎不能进行。
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75&#8451;之间，常用温度为72&#8451;，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
　　循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点1、特异性强。
PCR反应的特异性决定因素为：
　　　&#9312;引物与模板DNA特异正确的结合；
　　　&#9313;碱基配对原则；
　　　&#9314;Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
　　　&#9315;靶基因的特异性与保守性。
　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq
DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
2、灵敏度高。 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
3、简便、快速。 PCR反应用耐高温的Taq
DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4
小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
4、对标本的纯度要求低。 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA
粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
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实验二 PCR扩增及其产物的纯化
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