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Caspase家族与细胞凋亡的关系_赵瑞杰_图文
导读：Caspase家族与细胞凋亡的关系，要：凋亡是导致细胞死亡的调节性生理过程，Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是细胞凋亡过程，导致细胞凋亡，现以Caspase家族与细胞凋亡的关系为主,对Caspase基因家族生物学特性、，关键词：细胞凋亡，细胞凋亡（apotosis）是一个细胞自我破坏的程序性生化过程，是多细胞生物体内的一个重要生命现象，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他
2010年第46卷第17期
ReviewPapers?综
Caspase家族与细胞凋亡的关系
赵瑞杰1，，李引乾，王
会1，王广彬1，娜日苏1，金大鹏1，关伟军1*，马月辉1*
（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京2.西北农林科技大学动物医学学院，陕西杨凌
要：凋亡是导致细胞死亡的调节性生理过程。Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是细胞凋亡过程
的中心环节，其激活主要包括线粒体依赖途径和死亡受体介导的信号转导途径，激活后的下游Caspase，通过切割特异性底物，导致细胞凋亡。现以Caspase家族与细胞凋亡的关系为主,对Caspase基因家族生物学特性、调控细胞凋亡的分子机制进行综述。caspase；关键词：细胞凋亡；分子机制中图分类号：R329.2
文献标识码：A
-0073-06文章编号：（2010）
细胞凋亡（apotosis）是一个细胞自我破坏的程序性生化过程，通常需要30~60min。是多细胞生物体内的一个重要生命现象，即出现在个体发育过程中，也出现在正常生理状态或疾病中，在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。凋亡通常通过蛋白酶Caspases介导蛋白裂解起作用，因Caspase家族蛋白酶具有均为半胱氨酸蛋白酶类和特异酶切天冬氨酸位点两大特细胞凋亡形态点，故又称为Caspase蛋白酶家族[1]，学上的变化主要有DNA破碎、染色质凝聚、细胞皱
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；收稿日期：修回日期：
2008BADB2B01）资助项目：国家科技支撑项目（2006BADBB08、；转;863”课题基因生物新品种培育科技术专项（-003）“）（、
作者简介：赵瑞杰（1980-），男，景县人，硕士
线粒体肿胀和凋亡小体的形成，而其结束以凋亡缩、
小体被吞噬为标志。一般来说触发凋亡信号转导途径可以分为外部死亡受体途径、线粒体途径和内质Caspase家族蛋白酶充当了网途径。在这些途径中，
重要的角色。细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作死亡受体和用诱导产生凋亡信号，传递至Caspase，线粒体对外来有害刺激或死亡信号进行加工处，决以蛋定是否启动凋亡通路。其以Caspase活化开始，白底物裂解，细胞解体为结束，从而使细胞凋亡得以完成。1
什么是Caspase
半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统,在细胞凋亡机制网络中居中心地位[2]。Caspase是一种具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一组在细胞凋亡过程中起着关键①和ICE有同源性；②作用的酶，且具有以下特点：
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综述?Review
2010年第46卷第17期
以半胱氨酸作为裂解底物的亲核基团；③对催化底物的天冬氨酸有特异性，即催化时底物的天冬氨酸④有高度保守的QACXG羧基端肽键断裂；（X为R、Q或G）五肽序列；⑤通常以无活性的酶原形式存⑥活化的在，须通过水解其氨基端一段序列而激活；Caspase可水解底物,并通过级联放大诱发凋亡；⑦通常具有抑制剂,防止Caspase酶原被偶然激活而对正常细胞造成损伤。因它们均具有半胱氨酸和天门Alnemfi将其命名为Caspase，其基冬氨酸裂解位点，
C代表半胱氨酸蛋白酶机制，as-因用Caspase表示，
pase表示其能特异切割底物中在天冬氨酸（asp）后的肽键能力。22.1
Caspase的生物学特性Caspase特性及分类
目前认为细胞凋亡是细
Caspase-9、Caspase-10等，能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的Caspase。第2类为凋亡效应Caspase-6、子，位于级联反应下游，包括Caspase-3、
Caspase-7，能被上游的始动子激活，激活后的Caspase作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变，导Caspase-4、Cas-致细胞凋亡。第3类包括Caspase-1、
pase-5、Caspase-13、Caspase-14，主要参与细胞因子介导炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。而Caspase-3在其中起关键作用[8]。
Caspase-1ICE）（白介素-1β转换酶，是该家族中第一个被鉴定的成员，但它在细胞凋亡中并无十分明显的作用，主要参与IL-1β的成熟和转运。Cas-pase-8是启动者Caspases的重要代表，可通过与连接分子FADD的结合而活化，将凋亡信号传递到下游Caspase-14是该家族中的最新的效应Caspases分子。
成员，主要表达于胚胎细胞中，成年期缺乏表达，由于分子结构中没有NH2-末端域，因此又被称为MICE。并不是所有Caspase都参与细胞凋亡反应，如Caspase-1、4、5、l2等的作用主要是参与炎症反应，Caspass-3是迄今为止研究比较透彻的一个，它是主要的效应者分子。其中Caspase-3被认为是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应,使凋亡不可避免，因而Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”。正常情况下，胞质中的Caspase-3以无活性的酶原形存在,细胞凋亡信号的出现可导致Caspase-3在多种Caspase-3蛋白水解酶的作用下,发生裂解而活化[9~11]。家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中居中心地位。迄今大量研究认为，Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，Caspase-3活化后大致通过3种机制使细胞解体[12]：①酶解灭活凋亡抑制物，如核酸内切酶抑制剂（I-Bcl-2，mdm2，IkB等。②酶解细胞外基CAD/DFF45），局部粘连蛋白（FAK）、肌质及骨架蛋白，如角质蛋白、P21依赖性激酶动蛋白、（PAK2）和层连蛋白等。③裂解DNA修复相关分子、如聚ADP核糖多聚酶DNA依赖性蛋白激酶、）、复制因子C（REC）的（PARP
大亚单位REC140等。这些底物被酶解失活后细胞的功能和形态发生变化，表现为细胞固缩，与邻近细胞分离，同时染色质聚集，核碎裂。最后细胞分裂为完整而分散的膜结合小体，即凋亡小体。凋亡的执行过程是系列Caspase级联切割的过程。不同蛋白酶分别
胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列级联激活的Caspase家族在诱导细胞凋亡主动性细胞死亡过程。
的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。Caspase家族在氨基酸序列、结构及酶的特性上均相似。通常情况下以无活性的酶原形式存在于细跑中，酶原分子由3部分组成，一个N端前域及一大一小两个亚基，酶原分子激活后，大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性酶。由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡过程一旦触发，即呈级联放大效应。
根据Caspases对其底物酶切后产生作用的后果不同，将其分为四大类。第一类是被酶切后活化的底物，如Caspase本身切割可引起自身活化，
PKC-δ，P21激活的激酶2，磷脂酶A2，类固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）等[4]；第二类为酶切后失活的底物，如DNA蛋白激酶催化亚单位、视网膜母细胞瘤抑制蛋白等;第三类为酶切后改变其结构的蛋第四类为白，如A型和B型细胞核Lamin及GaS2[5]；酶切后对凋亡作用尚不清楚的底物
（Poly-ADP-ribosePolymemse）。通过对不同底物产生的作用，在多方面共同促进凋亡的形成。
Caspase家族成员大多数是凋亡的启动子或效应子,在细胞凋亡过程中发挥要作用
。目前有14种
Caspase被发现，根据Caspase在级联反应上、下游的位置及功能的不同，可分为三大类，第1类为凋亡始Caspase-8、动子，位于级联反应上游，包括Caspase-2、
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切割并激活Caspase-3酶原。活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡。2.2
Caspase的结构特点
Caspase家族有相似的氨
结构和底物特异性，通常以无活性的蛋白基酸序列、
。后者酶原形式存在细胞内合成和分泌（30~50Ku）NH末端区、由4个亚区组成：大亚基（P17-20）、小亚基（P10-12）及连接大小亚基的连接区。各亚区间经蛋白水解后释放出Prodomain及连接区，使大小亚基结合成一活性的异四聚体并暴露出底物识别，结合和催化所需的氨基酸残基，即形成了活性的Cas-pase。Procaspases可自我催化及催化其他Procaspases产生活性蛋白酶，其蛋白水解级联功能类似凝血因子活化的“级联效应”。Caspase的作用特点是能识别底物裂解位点NH末端最少4个氨基酸并在天门冬氨酸后裂解底物，从而使其蛋白裂解行为具有高选择性。不同的Caspase因所识别的4个氨基酸的不同而具有明显的底物特异性，从而发挥各自不同的生物学功能。2.3
Caspase的活化
Caspase酶原至少可以通过3
种方式激活：自活化（autoactivation）、转活化（transacti-vation）和非Caspase蛋白酶活化（activationbynoncas-paseproteinases）。
（1）自活化
Caspase酶原具有很低的蛋白水解
活性，这表明它在某种条件下有自活化的潜力。野生型Caspase的过表达可导致酶原的加工与激活，
表明酶原在高浓度时促进自活化。Caspase-8或-9的原域中都含有DED通过蛋白－蛋白相互作用，形成寡聚复合体，酶原相互接近，局部酶原浓度升高，促使了酶原的自活化，因此长的原域对于酶原的寡聚化和自活化是必需的。进一步的证据还有：把Caspase-2的原域与Caspase-3酶原融合起来，大大增强了酶原的自活化和Caspase-3诱导的凋亡。
（2）转活化
一旦被激活，起始Caspase能转活
化其他的Caspase酶原，包括效应Caspase和起始Caspase。例如，Caspase-8能激活几乎所有已知的Caspase酶原。Caspase-8，-9能激活酶原Caspase-3Caspase-3反过来可再和-7，但不能激活Caspase-6；9，形成正反馈。激活Caspase-8、
（3）非Caspase蛋白酶活化
Caspase酶原的另
一激活机制是直接被其他非Caspase蛋白酶所活化。例如，细胞毒性T细胞的颗粒酶B是一种天冬氨酸特异的丝氨酸蛋白酶，是酶原Caspase-3和-7-9和的高效激活剂。颗粒酶B也能激活Caspase-8、-10，但不能激活Caspase-6。另一种丝氨酸蛋白酶是组织蛋白酶G，它是通过在Gln-194之后进行酶切而激活Caspase-7，这表明天冬氨酸对于酶原的激活来说并不是绝对必需的。3
触发凋亡信号转导途径
Caspase处于细胞凋亡级联调控的下游，经典的细胞凋亡有2条途径分别为细胞外途径和细胞内途径，有人把它称为细胞表面死亡受体途径和线粒体引发途径[13]。此外还有内质网介导的凋亡通路。3.1
死亡受体介导的外源凋亡通路
在细胞外途
径中，死亡信号的转导依赖于死亡配体与受体的结合及受体的死亡结构域与信号转导分子结合，凋亡开始最具特征的路径之一是细胞死亡信号蛋白FasL、TRAIL和APo-3L）盘绕黏附到它的同（TNF-2、
源细胞表面的接受器上。目前5个死亡受体cDNA序列已清楚，它们是Fas分子（CD95/apo-1）、肿瘤坏死WSL-1、（TNFR-1）、死亡受体-3（DR3、因子受体-1
TRAMP、LARDDR4和DR5（APO-2、TRAIL-R2））、。Fas分子的配体为FasL；TNFR-1配体为TNF-α；DR3为APO-3L，而DR4H和DR5配体为TRAL、APO-2。死亡受体包含一个明显的细胞质区域，由
图1Caspase引起细胞凋亡的方式及途径
80个氨基酸残基构成的该区有重要的蛋白水解功
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能，这个区域被称为“死亡区域”。由于死亡受体分子中的死亡结构域（deathdomain,DD）有相互积聚的倾向，死亡配体与其受体结合后导致其死亡结构域相互积聚并与转节器分子的死亡结构域相互结合，使死亡受体分子活化。死亡受体与转节器分（pro-caspase）在子结合后导致细胞内Caspase酶原
局部聚集，通过转节器分子的另一端含有Caspase酶原分子相似的死亡效应器蛋白结构域相互串联结合构成大分子复合物，称为“凋亡酶体”（apopto-some）。
Caspase可以被细胞外通过膜的死亡受体作用，
ADD部因子如FasL（Fas1igand）或Fas抗体激活，与募集而来的procaspase-8的DED结合形成信号复合物，使pro-caspase-8自我水解、活化，形成活性Caspase-8，激活的Caspase-8激活下游的Cas-pase，从而引起细胞凋亡;Caspase-8除了直接激活Caspase-3外，还可直接切割胞质的Bcl-2家族成员Bid前体，tBid）形成截断的Bid（truncatedBid，，激活的tBid转位到线粒体，触发bak和bax同源寡聚作因此Bid将凋亡信号用，启动细胞色素C的释放，从死亡受体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效的放大了凋亡而bcl-2蛋白对Caspase-3有拮抗作用。线粒信号。
体通路和内质网通路也有密切的联系。许多情况下，内质网钙离子释放是线粒体释放细胞色素C的一个早期事件，即依赖内质网的线粒体内钙离子改变是重要的促进细胞色素C释放的信号。3.2
线粒体介导的内源性凋亡通路
由线粒体介
导的内源性凋亡通路是哺乳动物细胞程序性死亡的细胞周期阻主要途径。细胞在受到诸如DNA损伤、
滞、毒素和ATP耗竭等的凋亡刺激时，可导致线粒体膜肿胀，通透性增高，从而使原先位于线粒体内的与凋亡相关的活性物质释放出来，这些活性物质包括细胞色素C，凋亡诱导因子（apoptosisinducingfac-AIF）核酸内切酶[15]和Bitltor，（Bcl-2inhibitoftran-[16]scription）等，其中，由AIF和Bitl介导的凋亡是
去。线粒体内部释放的pro-caspase-3直接参与凋亡信号的转导。这样就有可能存在一个Caspase和线粒体自身反馈的环，凋亡刺激导致线粒体细胞色素c、AIF、Caspase释放，Caspase的活化又促进诱发这一过程，这对于凋亡的加速和凋亡信号传递有十分重要的意义。线粒体参与凋亡转导的机制主要有2PT孔的开放使个方面：线粒体质膜的渗透性改变，
线粒体基质和胞浆内的离子得以平衡流动，使原来存在的线粒体跨膜电位（△Ψm）被驱散。离子的流动有可能造成线粒体基质的高渗状态，从而使线粒体膨胀、细胞骨架蛋白受压，直接导致细胞凋亡的发生。线粒体的释放反应，线粒体内膜含有许多死亡，包括细胞色素C、凋亡诱导因子促进因子（DPF）Caspase酶原等。（AIF）、促死亡蛋白、
这两种途径并不是相互独立的,而是相互交错FAS介导的，如在FAS应答的肝细胞凋亡途径中，的Caspase-8活化不能达到足够的水平，需要借助线粒体途径放大凋亡信号。活化的Caspase-8将胞质中的BID剪切，形成活性分子即梭基端tBid（trun-catedBid）tBid进入线粒体，，导致细胞色素C释放，使凋亡信号放大，激活更多的Caspase-8。Caspase-8是通过二聚化作用而激活的，如DonepudiM所说，DISC联合高效的激活的影响因子Caspases，尤其是Caspase-3，导致凋亡最终步骤的执行[18]。3.3
内质网介导的凋亡通路
内质网参与维持细
胞内钙离子内环境稳定、膜蛋白的合成、修饰和折叠，内质网在凋亡信号处理过程中有重要作用。导致下游Caspase和其他蛋白酶的激活。虽然其确切机理还不清楚，但是内质网通路不同于线粒体或死亡受研究表明，钙离子在凋亡的调节体介导的凋亡通路。
Calreticulin是内质网腔主要的过程中发挥重要作用。
结合钙离子的分子伴侣，调节细胞内钙离子的动态研究发现Caspase-12存在于内质网膜，是内质平衡。
网应激（如内质网钙离子内环境紊乱以及过量内质网蛋白积累）诱导的凋亡所必需的。当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚于内质网时，可直接激活位于内质网上的Caspase-12。同时也导致胞质中的Caspase-7转移到内质网表面，进一步激活Caspase-12，激活的Caspase-12可进一步剪切Cas-pase-3，而引发细胞凋亡，此过程由内质网失常引起，与以膜或线粒体为靶位点的凋亡信号触发无关。
Caspase非依赖性的凋亡。细胞色素C能与凋亡酶激Apaf-l）活因子-1（optosisprotease-activatingfactor1，Caspase-9（即aptoptosome），及Caspase-9形成凋亡体自我剪切活化
ATP存在下活化Cas-，在dATP、
pase-3、Caspase-6、Caspase-7等成员，使凋亡进行下
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2型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Caspase3、Bak+及Bcl-2基因表达的影响
第３１卷第５期２００９年５月中国预防兽医学报ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＶ０１．３１．Ｎｏ．５Ｍａｙ２００９Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂａｋ及Ｂｃｌ一２基因表达的影响秦宏阳１，罗玉均１，２，张得玉１，冯春复２，何逸民１，张桂红１’（１．华南农业大学兽医学院，广东广州５１０６４２；２．哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨１５０００１）摘要：Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｉ．２、Ｂａｋ是细胞凋亡过程中３种重要的调节蛋白，为研究感染猪圆环２型病毒（ＰＣＶ２）后体内细胞的凋亡情况，本实验以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠为实验模型，建立了ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ检测细胞凋亡的方法。结果表明实验组Ｃａｓｐａｓｅ３的表达在各时间段里与对照组相比均呈上升趋势，提示了ＰＣＶ２感染可以上调Ｃａｓｐａｓｅ３水平，从而增加被病毒感染组织的细胞凋亡，而小鼠心、脑、脾等组织Ｂａｋ基因表达明显上调，Ｂｃｌ一２基因表达水平也伴随Ｂａｋ基因而升高。这些结果揭示了ＰＣＶ２感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，相关细胞凋亡基因在体内的作用与机制，同时为今后细胞凋亡的检测提供了新的方法。关键词：ＰＣＶ一２；细胞凋亡；Ｃａｓｐａｓｅ３；Ｂｃｌ．２；Ｂａｋ中图分类号：￥８５２．６５９文献标识码：Ａ文章编号：１００８―０５８９（２００９）０５．０３４２．０４Ｃａｓｐａｓｅ３，ＢａｋａｎｄＢｃｌ一２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｉｃｅｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｖｉｒｕｓＱｍＨｏｎｇ―ｙａｎ９１，ＬＵＯＹｕ－ｊｕｎｌ”，ＺＨＡＮＧＤｅ－ｙｕｌ，ＦＥＮＧＣｈｕｎ―ｆｕ２，ＨＥＹｉ―ｍｉｎｌ，ＺＨＡＮＧＧｕｉ―ｈｏｎ９１’（１．ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ２．Ｈａｒｂｉｎ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；ＷｅｉｋｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｓｐａｓｅ３，Ｂｃｌ一２，Ｂａｋａｒｅｔｈｒｅｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｅｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２（ＰＣＶ－２）ａｎｄＣａｓｐａｓｅ３，Ｂｃｌ一２，ＢａｋｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｍｏｎｉｔｏｒｅｄｂｙＳＹＢＲＧｒｅｅｎ１ｒｅａｌ―ｔｉｍｅＰＣＲ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔＣａｓｐａｓｅ３ｌｅｖｅｌｗａｓｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｆｔｅｒＰＣＶ一２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢａｋｇｅｎｅａｎｄＢｃｌ一２ｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｍｏｕｓｅｈｅａｒｔ，ｂｒａｉｎ，ｓｐｌｅｅｎａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｓ，ｔｈｅｒｅｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＣＶ一２：ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｃａｓｐａｓｅ３；Ｂｃｌ一２；ＢａｋＣａｓｐａｓｅｓ（Ｃｙｓｔｅｉｎｅａｓｐａａｉｃａｃｉｄｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ）ｔａｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ），研究发现线虫在发育过程中，是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地断开天冬氨酸残基后的肽键。Ｃａｓｐａｓｅ能高度选择性的切割某屿蛋白质。Ｃａｓｐａｓｅ的研究源于线虫（ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）细胞程序化死－Ｉ＝（Ｐｒｏｇｒａ一＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ１１个基因与ＰＣＤ有关，其中Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｃａｓｐａｓｅ４基因是决定ＰＣＤ所必需的，而Ｃａｓｐａｓｅ９基因则能抑制ＰＣＤ。线虫ＰＣＤ的研究促进了哺乳动物ＰＣＤ的研究，Ｂｃｌ一２是Ｃａｓｐａｓｅ９的哺乳动物同源物，起抑制收稿日期：２００８―１０．２０基金项目：８６３计划（２００６ＡＡｌＯＡ２０４）；国家生猪现代农业产业技术体系科学家岗位，财政部、农业部项目（ｈｙｃｙｔｘ００９）；广东省自然科学基金（５００６６７８）；农、Ｉｋ部制标项目作者简介：秦宏阳（１９８４，），女，满族，河南南阳人，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究；岁乇均（１９８０一），男，广东韶关人，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究．＋通信作者：Ｅ．ｍａｉｌ：ｇｕｉｈｏｎｇｚｈ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ万方数据　第５期秦宏阳，等．２型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂａｋ及Ｂｃｌ．２基闪表达的影响３４３细胞凋亡的作用。而Ｂａｋ具有ＢＨｌ和ＢＨ２同源序列，作用与Ｂａｘ相似，可以与Ｂｃｌ一２和Ｂｃｌ―ＸＬ作用，拮抗它们的作用，并促进凋亡进彳亍【１１。罗玉均等利用ＰＣＶ２毒株对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠致病性进行了研究１２】。为了进一步研究ＰＣＤ的３种重要相关调节蛋白Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｌ．２、Ｂａｋ在２型猪【员】环病毒感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠过程中的表达，以便准确理解ＰＣＤ基因表达调控机制。本研究以感染２型猪圆环病毒的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠为研究对象，利用荧光定量ＰＣＲ方法研究了２型猪图环病毒感染小鼠不同时间内Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｌ一２和Ｂａｋ在组织中的表达，以揭示２型猪圆环病毒感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的ＰＣＤ相关基因在体内的作用与Ｊ０１，Ｎ，为该病的防治提供理论依据。１材料和方法１．１病毒ＰＣＶ２．ＨＬＪｌ株由华南农业大学禽病研究室分离保存。１．２试验动物６刷龄雌性ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃ小鼠购自中山大学实验动物中心。１．３酶和试剂Ｍ―ＭＬＶ反转录酶、ＲＮＡ酶抑制剂为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；２ＸＲｅａｌｔｉｍｅＭａｓｔｅｒＭｉｘ为Ｒｅａｇｅｎｔ培养基为Ｉｎｖｉｔ－１．４总ＲＮＡ提取２４只６周龄雌性ＳＰＦ级ＢＡＬＢ／ｃ０００ｐｆｕ／只，空白ｄ、１４ｄ、２１ｄ各组迫杀４只小鼠，分别剖取小鼠的大脑、心脏、１．５．１引物设计和合成根据ＧｅｎＢａｎｋ中的登录的５ｍｍｏｉ／Ｌ、ｄＮＴＰ１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＲＮａｓｅ１６Ｕ、ＡＭＶＲＴａｓｅＸＬ２Ｕ、ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒｐｍｏＬ．４２℃１ｈ。万　方数据表ｌ实时荧光定量ＰＣＲ引物Ｔａｂｌｅ１Ｐｒｉｍｅｌ＇ｓｆｏｒＲｅａｌ－ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＣａｓｐａｓｅ３Ｆ５’一ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＧＡＡＡＧＡ一３’１４３ｂｐＲ５＇－ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＡ一３’Ｂｃｌ．２Ｆ５’一ＧＧＡＴＣＧＧＡＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡ一３’ｌ１５ｂＤＲ５＇－ＡＣＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣＧＴＡＡＣＡＧ一３’ＢａｋＦ５’一ＣＧＧＧＡＡＴＧＣＣＴＡＣＧＡＡＣＴＣＴ－３’１０４ｂＤＲ５＇－ＧＣＣＡＧＡＣＧＧＴＡＧＣＣＡＡＡＧＣ一３‘Ｂｅｔａ．ａｃｔｉｎＦ５’－ＧＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＧＡ．３’１９９ｂＤＲ５’一ＡＣＧＧＴＴ（ＫｊＣＣＴＴＡ（ｊＧＧＴＴＣＡ一３’１．５．３ＲＴ－ＰＣＲ及其测序分别对４个基因进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增。２５ＩＬＬＰＣＲ反应体系包括：１０ＸＢｕｆｆｅｒ（Ｍ９２＋ｐｌｕｓ）２．５ｉｘＬ；ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）２斗Ｌ；上下游引物各ｌＩＬＬ；逆转录产物２斗Ｌ；ＥｘＴａｑ０．５斗Ｌ；Ｈ２０１６斗Ｌ。反应条件：９４℃１０ｍｉｎ；９４℃３０Ｓ，５６℃３０Ｓ，７２℃３０ｓ，３０个循环后７２℃延伸７ｍｉｎ。反应完成后ＲＴ．ＰＣＲ产物经２％琼脂糖凝胶电泳，回收各目的片段并送交上海生物工程技术服务有限公司测序。１．５．４标准曲线的制作取各基因ＲＴ．ＰＣＲ扩增的回收产物进行倍比稀释（１０一ｔ～１０’６或１０４～ｌｏ。９）后进行扩增。２０¨Ｌ体系包括：２ＸＲｅａｌｔｉｍｅＭａｓｔｅｒＭｉｘ，引物，ｃＤＮＡ模板。反应条件为９５℃１ｍｉｎ预变性；９５℃１５Ｓ、５６ｏＣ１５Ｓ、７２℃４５ｓ、４０个循环。连续监测荧光值，对扩增产物进行分析。以循环阈值（ｃｔ）对浓度的对数作图，得到各斜率和回归系数。１．６相对定量检测Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｌ一２和Ｂａｋ的表达水平按照优化后的反应体系，管家基冈和目的基因各扩增３管。实验组与对照组每组同时扩增管家基因ｂｅｔａ―ａｃｔｉｎ和目的基冈Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｌ．２、Ｂａｋ。反应结束后，根据每个反应的阈值，利用统汁学分析再利用公式计算凋亡相关基因对ｂｅｔａ―ａｃｔｉｎ的相对表达量。２结果２．１实时荧光定量ＰＣＲ标准曲线根据ｃｔ值，经对数拟合做图，得到定量标准曲线，起始模板浓度与ｃｔ值之间呈良好的线性关系。经实时荧光定量ＰＣＲ程序中的熔解曲线分析，证实设计的引物扩增出的ＰＣＲ产物是唯一的扩增子（见表２）。２．２各组织中Ｃａｓｐａｓｅ３ｍＲＮＡ的动态变化分别在病毒接种后７ｄ、１４ｄ和２１ｄ，采取对照组和实验组各组织脏器，提取总ＲＮＡ，经反转录后。对其ＴＯＹＯＢＯ公司产品；ＴＲＩｚｏｌｒｏｇｅｎ公司产品，其它常规试剂均为国产分析纯试剂。小鼠随机分为２组，分别为腹腔注射接种病毒组和空白对照组。接种病毒剂量为１对照组注射细胞培养液。在接种后７肝脏、脾脏、肺脏、肾脏。参照总ＲＮＡ提取试剂盒的使用ｉ兑明书提取样品组织总ＲＮＡ。用紫外分光光度汁测总ＲＮＡ含量，并置于一７０℃保存备用。１．５实时荧光定量ＰＣＲ标准曲线的制作鼠Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｌ．２、Ｂａｋ、ｂｅｔａ．ａｃｔｉｎ序列设计特异引物，其中ｂｅｔａ．ａｃｔｉｎ为内参引物（表１），上述引物均由上海生工有限工程公司合成。１．５．２逆转录反应合成ｅＤＮＡ取正常或感染ＰＣＶ２的小鼠各组织总ＲＮＡ进行ｃＤＮＡ合成，反应体系中包括：ＭｇＣｌ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２０中国预防兽医学报２００９矩进行Ｃａｓｐａｓｅ３以及ｂｅｔａ―ａｃｔｉｎ的荧光定量ＰＣＲ扩增，结果见图ｌ。结果表明，实验组不同时间段各组织中Ｃａｓｐａｓｅ３表达高于对照组，Ｐ＜０．０５，差异显著。在接种后７ｄ实验组感染鼠在心、脾、脑组织中Ｃａｓｐａｓｅ３实验组／对照组的表达比值分别为１．２９、１。４８、１．２３。在接种后１４ｄ实验组感染鼠在心、脾、肾组织中Ｃａｓｐａｓｅ３实验组／对照组的表达比值分别为１．２６、１．４０、１．７３。在接种后２１ｄ实验组感染鼠在肾、脑组织中Ｃａｓｐａｓｅ３实验组／对照组的表达比值分别为１．２７，１．２０。表２各凋亡相关基因与内参的标准曲线数据Ｔａｂｌｅ２ｉｎｔｅｒｎａｌＴｈｅｄａｔａ组织脏器，提取总ＲＮＡ，经反转录，对其进行Ｂｃｌ一２以及ｂｅｔａ．ａｃｔｉｎ的荧光定量ＰＣＲ扩增，结果见图３。结果表明，在整个试验过程中实验组在７１４ｄ、ｄ肝、脾、肾等组织中Ｂｃｉ一２基因表达低于对照组，在接种后２１ｄ实验组各组织中Ｂｃｌ．２基因表达开始增高，脾组织中实验组／对照组的表达比值为２，ｐ＜０．０５，差异显著。疆础瓤．【珊魏如ｂｅｔｗｅｅｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄａｎｄｇｅｎｅｓｏｆｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ摹ｌ』：ＩＧｅｎｅ△Ｒｎ阈值Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ稀释度Ｄｉｌｕｔｉｏｎ相关系数Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ回归方程ＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎＢｅｔａ－ａｃｔｉｎＣａｓｐａｓｅ３０．００５Ｏ．００５１０１－１０‘０．９９８０．９７６Ｏ．９９３Ｏ．９９４ｙ＝一３．３２ｘ＋３１．５７ｙ＝一３．９６ｘ＋３５．００ｙ＝一３．４３ｘ＋４５．８３１０１～１０‘Ｂｃｌ一２ＢａｋＯ．００５０．００５１０～１０４１０屯１０４ｙ＝－３．４９ｘ＋４３．３２颡雌贼啦蛊器嚣：砧撼蔷氍譬；：：兰盛怒麓爱蔷列然：告墨：：：怒勰图３Ｆｉｇ．３Ｂｃｌ一２实验组相对于对照组各时间段ｍＲＮＡ基因表达的差异ｏｆＢｅｌ－２ｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｇｒｏｕｐｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，图ｌＦｉｇ．１实验组相对于对照组各时间段Ｃａｓｐａｓｅ３ｍＲＮＡ基因表达的差异ｇｒｏｕｐ，ａｔａｔｄｉｆｆｏｒｏｎｔｔｉｍｅｓｐｏｉｎｔｓｐｏｓｔｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣａｓｐａｓｅ３ｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓｐｏｓｔｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ３讨论病毒是一种严格的细胞内寄生性微生物，因此宿主细胞的活性对于产生大量的子代病毒是非常重要的。病毒在机体中大量繁殖，诱导大量组织细胞发生凋亡。细胞凋亡必然影响着病毒的大量复制，虽然可以使部分病毒的扩散受到抑制，但ｌ一时却使机体组织细胞发生死亡。显然，这对机体是不利的。这就需要机体自发的来调控这种细胞的过度凋实验组Ｃａｓｐａｓｅ３的表达在各时间段里相对于对照组均呈上升趋势，说明在ＰＣＶ２感染可以上调Ｃａｓｐａｓｅ３水平，从而增加各感染组织的细胞凋亡。２．３各组织中ＢａｋｍＲＮＡ的动态变化种后７ｄ、１４分别在接ｄ和２１ｄ，采取对照组实验组各组织脏器，提取总ＲＮＡ，经反转录后，对其进行Ｂａｋ以及ｂｅｔａ．ａｃｔｉｎ的荧光定量ＰＣＲ扩增，结果见图２。结果表明，在不同间段内实验组感染鼠心、脑、脾中Ｂａｋ基因表达高于对照组，ｐ＜０．０５，差异显著。在接种后７ｄ、１４亡Ⅲ。机体对细胞凋亡的调控主是通过Ｂｃｌ一２家族蛋白、半胱氨酸蛋白酶（Ｃａｓｐａｓｅｓ）的作用来实现的。在半胱氨酸蛋白酶中，Ｃａｓｐａｓｅ２、３、６、７、８、９、１０在细胞凋亡中起作用［４－５］，但Ｃａｓｐａｓｅ３是最重要的效应Ｃａｓｐａｓｅ，它的主要功能是使抑制凋亡的蛋白失活。Ｃａｓｐａｓｅ３表达的增加、激活是２种凋亡信号转导路径中共同的关键环节，也是凋亡启动过程中的早期事件。Ｂｃｌ一２基因家族是凋亡信号下游调节ｄ实验组感染鼠心组织中实验组／对ｄ照组的表达比值分别为１．４２和１．２６。在接种后７实验组感染鼠脑组织中Ｂａｋ实验组／对照组的表达比值为１．４，在接种后２１ｄ实验组感染鼠脾组织中Ｂａｋ实验组／对照组的表达比值为２．９２。２?４各组织中Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的动态变化分别在接种后７ｄ、１４ｄ和２１ｄ，采取对照组和实验组各万方数据　第５期秦宏阳，等．２型猪同环病毒感染对小鼠组织中Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂａｋ及Ｂｃｌ．２基闪表达的影响３４５的主要目标。依据其同源结构域的不同【６】，Ｂｃｌ．２家族成员又被分为３个亚家族，Ｂｃｌ．２、Ｂａｋ是其中重要的成员。此外，Ｂａｋ还是一个非常重要的ＰＣＤ调节基岗［７－８］。Ｂａｋ表达的失控与许多疾病的发生有关。目前普遍认为，Ｂｃｌ一２高表达可以抑制细胞凋亡，而Ｂａｋ（Ｂａｘ）高表达则可以促进细胞凋亡。Ｂｃｌ一２和Ｂａｋ对凋亡的调节与线粒体有关。Ｂｃｌ．２位于线粒体外膜并朝向胞浆，调节离子的转运并维持线粒体膜的完整性。Ｂａｋ存在于细胞浆，当接受到凋亡信号时便移行至线粒体膜与ＰＴ孑Ｌ（Ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｐｏｒｅ）结合。这种膜的改变可以导致线粒体内物质的释放，其中凋亡诱导因子直接进入细胞核，使染色质凝集，细胞色素ｃ则通过作用于Ａｐａｆ－Ｉ（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ－１）继而激活凋亡蛋白酶Ｃａｓｐａｓｅｓ，导致细胞的凋亡【９ｌ。因此人们认为在凋亡刺激物作用后，细胞的生存能力依赖于细胞内部Ｂｃｌ．２／Ｂａｋ的比值。Ｂｃｌ．２／Ｂａｋ比值变化可能激活或抑制凋亡下游的Ｃａｓｐａｓｅ．３的表达和活化『１０】。本研究在国内外首次利用荧光定量ＰＣＲ方法初步探讨了ＰＣＶ２感染对小鼠各组织中Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｂｃｌ一２和Ｂａｋ基因表达之间的关系。结果表明Ｃａｓｐａｓｅ３随着感染时间的延长而逐渐增强，这将使得Ｃａｓｐａｓｅ３通过一系列底物切割、裂解，最终诱发各受感染组织发生细胞凋亡。研究结果还表明ＰＣＶ２感染后Ｂａｋ基因表达上调促进小鼠心、脑、脾等组织诱发细胞凋亡。同时ＰＣＶ２感染使得小鼠机体通过上调Ｂｃｌ一２表达，有助于抑制病毒在体内增殖。另外在研究中发现，在接种后７ｄ、１４ｄ脾脏中Ｂｃｌ．２和Ｂａｋ表达量下降，而接种后２１ｄＢｃｌ一２和Ｂａｋ表达量升高，这可能与该病毒特点和脾脏的免疫功能有关。脾脏作为免疫效应器官，是Ｔ细胞的主要产生器官。在病毒机体过程中，Ｔ细胞的抗原万　方数据染引发的凋亡信号通路中关键分子是如何相互作用仍需要深入的研究。目前细胞凋亡的检测方法有很多…】，如ＤＮＡ片段化、流式细胞仪检测、线粒体跨膜电位的检测、ＴＵＮＥＬ检测等，但未见有ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ检测方法。本研究建立了ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ检测细胞凋亡的方法，为今后细胞凋亡的检测提供了新的方法。可以采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ与其他儿种细胞凋亡检测方法平行比较，充分发挥各种检测方法的优势。参考文献：［１】傅强，侯铁胜。鲁凯伍．大鼠脊髓急性损伤后Ｂａｘ和Ｂｃｌ一２的表达【Ｊ】．中国矫形外科杂志，２００１，８（３）：２５９―２６０．【２】罗玉均．猪网环病毒２型荧光定量ＰＣＲ方法的建立及侵袭机理的研究【Ｄ］．广东：华南农业大学，２００８．【３】林忠嗣．银翘散及其君臣药对急性流感病毒感染小鼠的Ｂｃｌ一２与ＴＧＦ．Ｂ相关惟的研究【Ｄ】．辽宁：辽宁中医药大学，２００６．【４】袁长青，丁振华．Ｃａｓｐａｓｅ的结构与功能【Ｊ】国外医学分子生物学分册，２００２，３（２４）：１４６―１４８．【５】王筱冰，张小翠．Ｃａｓｐａｓｅ的活化机制【Ｊ】．现代生物医学进展，２００６，６（３）：５３－５５．【６】卿晨．丁健．Ｂｃｌ．２基因家族在调节细胞凋亡中的作用【Ｊ］．国外医学分子生物学分册，２０００，１（２２）：１７．２１．【７】ＢｕｒｌａｃｕＡ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙＢｃｌ一２ｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕ－ｒｅａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ【Ｊ】．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００３，７（３）：２４９―２５７．【８】ＭａｒｔｉｎＲ．ＴｈｅｉｎｔｅｒｐｌａｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＢｃｌ一２ｆａｍｉｌｙａｎｄｄｅａｔｈｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ【Ｊ】ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ（ＢＢＡ）ＭｏｌＣｅｌｌＲｅｓ，２００４，１６４４（２．３）：１２５－１３２．【９】张闻多，丁文惠．细胞凋亡与凋亡诱导因子［Ｊ】．中国病理生理杂志，２００６。（０９）：１８５８―１８６１．【１０】ＫｉｍＲ，ＥｍｉＭ．ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅＢｃｌ－２ａｓａｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｆｏｒｃａｑｅｅｒｔｈｅｒａｐｙ【Ｊ】．Ｃａｎｃｅｒ，２００４，１０１（１１）：２４９１?２５０２．［１１】刘海峰，孙文汇．细胞凋亡的特征及其检测方法［Ｊ】．动物医学进展，２００８，２９（３）：１０６．１０８．（特异性是宿主防御中的最高级、最精确的防御机制。病毒感染之后，机体进行防御保护，调节凋亡基因表达，以影响病毒在体内的增殖。但ＰＣＶ２感
2型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Caspase3、Bak 及Bcl-2基因表达的影响作者：作者单位：秦宏阳， 罗玉均， 张得玉， 冯春复， 何逸民， 张桂红， QIN Hong-yang， LUO Yu-jun， ZHANG De-yu， FENG Chun-fu， HE Yi-min， ZHANG Gui-hong秦宏阳,张得玉,何逸民,张桂红,QIN Hong-yang,ZHANG De-yu,HE Yi-min,ZHANG Gui-hong(华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642)， 罗玉均,LUO Yu-jun(华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642;哈尔滨维科生物技术开发公司,黑龙江,哈尔滨,150001)， 冯春复,FENG Chun-fu(哈尔滨维科生物技术开发公司,黑龙江,哈尔滨,150001)中国预防兽医学报CHINESE JOURNAL OF PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE)1次刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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