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1.请问各位高手，chip 实验最后PCR时，提取的DNA模板的浓度和纯度分别是多少才能做出来啊？2.PCR时的注意事项能否指导一下下，非常感谢
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谁做这个实验？
很多方面都需要摸条件
很难得到理想结果，实验过程并不是一概而论
刚好要做这个，目前还在学习中，很好的帖子！！
看着过程就很复杂，比Western-blot难多啦，周期也长
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DXY All Rights Reserved.染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点
染色质免疫沉淀技术(Chromatin
Immunoprecipitation，简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。
它利用抗原抗体的特异性反应,可以真实地反映体内蛋白分子与基因组DNA结合的状况。
以下是实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。
①&细胞固定
甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时。
需注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。
②&染色质片段化
交联后的染色质需被超声波切成400~600bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗体识别，其片段破碎的均匀一致性对结果影响至关重要。
传统的超声波破碎是利用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。而来自比利时的Bioruptor非接触式超声波破碎仪采用温和的破碎方式，保证了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同时外接水循环仪保证了实验的温度稳定性，成为目前ChIP实验的首选。
③ 色质免疫沉淀反应
Input对照：
在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
Beads选择：
接下来，利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体特异反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose
beads或Magnabeads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS
NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。
抗体选择：
染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。
阴性对照设置：
在做ChIP实验时，需设置对照，以便于对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。
阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNAPolymerase
II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。
目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能得出正确结论。另外，还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。
最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。
④&交联反应的逆转和DNA的纯化
用不含DNase的RNase和Proteinase
K，65℃保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。在逆转交联时不使用Proteinase
K，然后用丙酮回收有机相中的蛋白质，进行分析。
⑤&DNA的鉴定
最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time
PCR。由于启动子区域序列多样性的特点，所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同，因此可设计多对引物来反复验证ChIP实验的结果。
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ChIP染色质免疫沉淀技术
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你可能喜欢　　染色质免疫共沉淀技术（chromatin-immunoprecipitation，ChIP），因其能真实、完整地反映结合在DNA序列上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。ChIP技术由Orlando等人于1997年创立。
它的基本原理与过程如下：通过在特定时间点上用甲醛交联等方式“固定”细胞内所有DNA结合蛋白的活动，相当于这一时间点上细胞内蛋白和DNA相互作用的关系被瞬时“快照（snapshot）”下来。再通过后续的裂解细胞、断裂DNA，将蛋白质-DNA复合物与特定DNA结合蛋白的抗体孵育，然后将与抗体特异结合的蛋白-DNA复合物洗脱下来，最后将洗脱得到的特异DNA与蛋白解离、纯化DNA后，进行下游分析。
ChIP是相对成熟的技术，但目前还存在一些技术难点。例如，ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，需要大量的起始材料；染色质免疫沉淀获得的DNA数量往往很多，包含大量的非特异结合的假阳性结合序列；而对于神经细胞和干细胞等，往往培养困难，并且难以区分个别细胞与总体细胞的表型。在此背景下，配合使用芯片或者第二代高通量测序技术检测这些DNA片段，就形成了ChIP-chip技术和ChIP-Seq技术。
ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息。相对于ChIP-chip技术，ChIP-Seq是一种无偏向检测技术，能够完整显示ChIP富集DNA所包含的信息。ChIP-chip技术的缺点在于它是一个“封闭系统”，只能检测有限的已知序列信息，相比之下，ChIP-Seq的优势在于其强大的“开放性”，强大的发现和寻找未知信息的能力。因此，ChIP-Seq与传统的ChIP-chip技术相比具有明显的优势：
（1）&灵敏度很高。传统的ChIP-chip实验要求起始DNA的量在4ug以上，而一般ChIP-Seq实验对起始DNA量的要求是10ng。这直接反映在起始细胞数目的减少，对于像早期胚胎发育相关的研究中更占优势。（2）&灵活性很强。ChIP-chip实验以研究对象的特定物种的全基因组DNA芯片平台为基础，所以不适合应用在那些基因组序列信息不丰富或缺少相关芯片平台开发的物种。ChIP-Seq技术则不存在这方面的限制，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息。（3）&分辨率极高。传统的微阵列芯片技术受制于当前芯片的容量，事实上不能涵盖真正的全基因组DNA序列信息，这导致ChIP-chip的实验结果分辨率不高，精确定位蛋白与DNA的结合位点存在一定的困难。而ChIP-Seq技术辅之以强大的生物信息计算能力，可以高效地将测序得到的序列定位到特定基因组的精确碱基位置上，分辨率大大提升。（4）&不具备其它一些芯片相关的负效应，如由核酸非特异杂交带来的噪音信号。
因此，随着目前测序的成本不断降低及通量迅速增高等优势，ChIP-Seq已经基本上取代ChIP-chip成为研究转录因子、RNA聚合酶、核小体等DNA结合蛋白体内结合靶点的主打技术。
ChIP-Seq实验设计的关键主要有以下几个方面：
1，&抗体质量：一个灵敏度高和特异性高的抗体可以得到富集的DNA片段，这有利于探测结合位点。2，&空白对照：空白对照是必要的，存在很多假阳性情况需要通过空白对照进行判断。一般来说有三种类型的空白对照：(1) 部分进行免疫沉淀前的DNA（input DNA），这是最常用的；(2) 由免疫共沉淀得到而不含有抗体的DNA（mock IP DNA），使用这个的问题在于收集到的量可能不够；(3) 使用非特异免疫共沉淀方法得到的DNA。3，&测序深度：在发表的ChIP-Seq实验中，一般使用Illumina Genome Analyzer上的一个lane产生的数据作为一个基本单位，目前一个lane大概是8-15 million reads。判断足够的测序深度的标准是：当增加测序得到更多的reads时不能发现更多的东西。将这一标准应用到结合位点的数量上就是：进行测序，增加reads数而无法得到更多的结合位点。4，&Multiplexing：对于基因组比较小的物种（E.coli, C.elegans）来说，一个标准的illumina lane得到的数据太多了，仅仅测一个样本比较浪费，所以可以将多个样本加不同的adapter放在一起测。
由于现在提供高通量测序的服务商很多，大家只需要把经ChIP富集得到的DNA样品纯化好交给测序公司就可以了。但是大家经常会遇到测序结果信号弱，背景高等令人头疼的问题，其实ChIP-Seq除了找一家专业的测序服务提供商以外，更重要的是如何获取更高质量的ChIP实验结果。
常见的两种ChIP实验技术有N-ChIP和X-ChIP技术。N-ChIP采用核酸酶消化染色质，适用于研究DNA与高结合力蛋白的相互作用，比如组蛋白修饰等方面的研究；X-ChIP则采用甲醛或紫外线进行DNA和蛋白交联，通过超声波片段化染色质，适合用来研究DNA与低结合力蛋白的相互作用问题，例如大多数非组蛋白方面的蛋白研究。
破碎DNA及具有较高的特异性和亲和力的抗体是ChIP实验成功与否的关键因素。大多数的ChIP实验都使用超声的方法打断DNA，最理想的情况是将DNA打断成200-1000bp的弥散片段，而不同类型及不同数量的细胞对超声的条件都不一样，这往往导致超声的结果无法重复，因此，超声要根据细胞类型和数量对条件进行摸索，将最佳超声条件固定下来，以保持实验的可重复性。
抗体又有单抗与多抗之分，选择起来也需要仔细考虑。单抗特异性强，背景低。但致命的弱点是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能因该位点被其他蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白；而多抗特异性较差，背景可能会偏高。最好的解决方法是使用严格经过ChIP-Seq或ChIP实验验证的抗体，以获得最高的免疫共沉淀实验效率。Merck Millipore提供一系列经过ChIP或ChIP-Seq验证的抗体，具有更高的抗体特异性和灵敏度。此外，Merck Millipore专门为ChIP实验设计的ChIP Ab+套装，不仅包含严格验证的ChIP级抗体，还包含阴阳性对照抗体和引物，保证实验结果的准确性。
免疫共沉淀则常用偶联Protein A或G的琼脂糖beads，这些beads有着多孔的松散表面，极易吸附DNA分子，造成假阳性，所以在使用前需要进行封闭，一般使用鲑鱼精DNA进行封闭。做ChIP-Seq要尽量降低背景信号，而封闭用的鲑鱼精DNA会对后续的测序带来干扰，因此不推荐使用琼脂糖beads进行ChIP-Seq实验，最好是使用表面光滑偶联Protein A/G的磁珠，实验表明这种磁珠比单独偶联Protein A或G的磁珠有着更低的实验背景，能显著提高信噪比。Merck Millipore 专门提供了两种规格的Protein A/G磁珠供不同实验需求的科研者选择：16-663x，10次；16-663，50次。
目前有一些商品化的试剂盒包含实验所需的整套试剂，非常适合用来做ChIP-Seq的样品准备工作，如Merck Millipore公司的Magna ChIP HiSens Kit（17-10461）有着非常高的灵敏度和极低的背景，能在104个细胞中（一般ChIP试剂盒样品起始量的1/100）富集到靶标DNA，很好地满足下游深度测序对DNA样品浓度、纯度及丰富性的要求。Magna ChIP-Seq kit（17-1010）进行文库构建仅需1ng ChIP DNA。试剂盒中含有阴阳性对照抗体和引物，经严格质控和验证的酶及缓冲液体系使文库构建更加简洁。
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联系信箱：用ChIP DNA构建Illumina测序文库 - 分子生物 - 生物秀
标题: 用ChIP DNA构建Illumina测序文库
摘要: Illumina公司的测序平台在下一代测序平台中广受欢迎，但是其出售的DNA测序文库构建试剂盒却仍然价格昂贵。本方法可用于从染色质免疫共沉淀（ChIP）DNA构建高质量的测序文库。方法中使用的关键试剂均来自于第三方供应商，从而大大降低了测序文库构建的成本。本方法已由Snyder实验室不同研究者测试并优化。……
Illumina公司的测序平台在下一代测序平台中广受欢迎，但是其出售的DNA测序文库构建试剂盒却仍然价格昂贵。本方法可用于从染色质免疫共沉淀（ChIP）DNA构建高质量的测序文库。方法中使用的关键试剂均来自于第三方供应商，从而大大降低了测序文库构建的成本。本方法已由Snyder实验室不同研究者测试并优化。
材料和试剂
1. QIAquick PCR纯化试剂盒(#28104)
2. QIAquick 凝胶纯化试剂盒(#28704)
3. MinElute PCR纯化试剂盒(#28004)，柱子4度保存
4. Gibco 超纯水 (#)
5. End-it DNA末端修复试剂盒, Epicenter #ER0720
6. Klenow 片段(3& -& 5& 外切酶活性), NEB, #M0212S
7. 100mM dATP, Invitrogen # or VWR #PAU1201
8. LigaFast 连接试剂盒, Promega, #M8221
9. 2% E-gel, 预制琼脂糖凝胶, Invitrogen (可用自制 2%琼脂糖凝胶代替)
10. Phusion HF PCR 预混液, NEB, #F531S or #F531L
11. 来自Illumina测序试剂盒的接头混合物。可用经过快速变性缓 慢退火的接头混合物代替（见参考文献1）
接头序列如下:
5& P-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
5& ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
12. 来自Illumina测序试剂盒的 PCR 引物1.1 和2.1。可用普通合成的如下序列引物代替Illum1.1:
5&AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
5& CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT
1. BECKMAN公司离心机和转头
2. PCR仪(Perkin Elmer 或 Roche)
3. NanoDrop 微量紫外-可见光分光光度计
1. 纯化酒精沉淀的ChIP DNA。使用QIAquick PCR纯化盒，用50 ul洗脱缓冲液洗脱。其中，34 ul用于文库构建，剩下的用于定量PCR检测。
2. 构建文库前，DNA需要稀释。纯化后用Nanodrop测定DNA的浓度。如果浓度是20ng/ul，稀释5倍; 如果接近40ng/ul，稀释10倍。
3. 末端修复：在1.5ml离心管中混合以下成分
34 ul 纯化的ChIP DNA (或补水至34 ul)
5 ul 10X 末端修复缓冲液
5 ul 2.5mM dNTP混合物
5 ul 10mM ATP
1 ul 末端修复酶
室温放置45分钟。用QIAquick PCR纯化柱纯化，用34 ul缓冲液洗脱。
4. 3&末端加A。在1.5ml离心管中混合以下成分
34 ul 步骤3的ChIP DNA
5 ul Klenow缓冲液 = NEB buffer 2
10 ul 1mM dATP
1 ul Klenow 片段 (3& & 5& 外切酶活性)
（1mM dATP用100mM dATP母液稀释，每管25ul分装，只能冻融一次）
用MinElute PCR纯化柱纯化，12 ul缓冲液洗脱。
5. 接头连接：在1.5ml离心管中混合以下成分
11 ul 步骤4的ChIP DNA
15 ul DNA连接缓冲液
1 ul 1:20 稀释的接头寡核苷酸
3 ul DNA 连接酶
如果同时做多个重复，确保每个平行反应加入不同的接头，标记清楚。
6. 凝胶筛选除去多余的接头：
将6 ul稀释10倍的上样缓冲液加入到30 ul 第五步的反应液中，上样至两个E-gel胶孔中。另外取20 ul稀释10倍的50 bp DNA ladder上样。电泳20分钟。
切取大小在150bp到450bp之间的DNA，用QIAquick 凝胶纯化盒纯化，30 ul洗脱缓冲液洗脱。
7. 用Illumina引物PCR：
用Gibco水将Illumina PCR引物1.1和2.1进行1：1稀释
在PCR管中混合以下成分
30 ul 步骤4的ChIP DNA
28 ul Phusion PCR 预混液
1 ul 稀释的引物 1.1
1 ul 稀释的引物 2.1
98 &C 30 秒
98 &C 10 秒
65 &C 30 秒
72 &C 30 秒
GOTO step 2 for 15 次
72 &C 5分钟
8. 2%糖凝胶上进行分子量筛选：
将1ul稀释的上样加入到上一步的PCR反应液中，上样至三个E-gel胶孔中。另外分别取20 ul稀释10倍的50 bp 和100 bp DNA ladder上样。电泳30分钟。切取大小在150-450bp之间的DNA。切胶前后照相保存。注意不要切到100 bp左右的接头条带。高质量的文库应该包含集中在200bp左右的弥散状条带。如有100 bp左右的明显条带则说明接头过量扩增，降低了文库质量。用QIAquick 凝胶纯化试剂盒纯化DNA，用30 ul洗脱洗脱。
9. 测定浓度。用NanoDrop 测定所得的浓度。高质量的文库应具有相当的浓度（& 10 ng/ul）
References
1. Lefrancois P, Zheng W, Snyder M. 2010. ChIP-Seq: Using next-generation sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods in Enzymology Vol. 470, Chapter 4, 77-104
2. Lefrancois P, Euskirchen G, Auerbach R, Rozowsky J, Gibson T, et al. 2009. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics 10: 37
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