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脂类染色法
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脂肪和类脂（磷脂、糖脂、固醇脂等）统称为脂类。它是构成人体组织的正常成分，不溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶剂中。在化学组成上，脂类属于脂肪酸的酯或与这些酯有关的物质。脂类的主要功能是氧化供能。 脂肪主要存积于脂肪组织中，并以油滴状的微粒存在脂肪细胞浆内。 在病理检验中，脂类染色法最常用以证明脂肪变性，脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑及油红O等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。经研究认为组织中脂质在液态或半液态时，对苏丹染料着色效果最好。根据这一原理，适当提高温度（37℃-60℃）对组织切片染色效果是有好处的。 脂类染色，用冰冻或石蜡切片，以水溶性封固剂封固，如甘油明胶和阿拉伯糖胶等。 一、苏丹Ⅲ（Sudan Ⅲ）染色法： 操作方法： （1） 固定于10%甲醛的组织。 （2） 水洗后采用冰冻或石蜡切片。 （3） 经蒸馏水后，浸染于Harris苏木素 或明矾苏木素中淡染1-2分钟。 （4） 自来水冲洗。 （5） 水洗后，移入70%酒精5秒钟。 （6） 投入苏丹Ⅲ染液中约30分钟或更长时间，置于56℃温箱中。 （7） 在70%酒精中洗涤5-10秒钟。 （8） 洗于蒸馏水中，然后将切片移于载玻片上。 （9） 切片移于玻片上，将切片周围的水分小心擦掉。 （10）
甘油明胶封固。 结果：脂肪呈橙红色或鲜红色或黑色，胆脂素呈淡红色，脂肪酸不着色，细胞核呈蓝色。 试剂配制： 1、苏丹Ⅲ染液配法：将0.15克苏丹Ⅲ溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精混合液中（各50ml），临用时过滤，所得滤液即为饱和浓度。 注：浸染时，容器必须盖好，否则酒精或丙酮挥发，染料沉淀。 2、甘油明胶配制： 明胶
40g 蒸馏水
210ml 甘油
250ml 石碳酸结晶
5ml 先将明胶浸入蒸馏水中2小时或更长时间，然后加甘油和石碳酸，加热15分钟，摇搅直至混合液均匀为止。
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【专题】组织细胞固定的原理、基本要求和注意事项等
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这个帖子发布于7年零268天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
在病理学中，组织只有经过固定，才能完成随后的一系列制作过程，直至切片的最后完成。每个医学研究者都能容易地把组织细胞固定起来，但是，要掌握组织固定的原理、过程及其意义是一件十分困难的事，下面我们将逐一阐述。一、固定的作用组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。二、固定的目的1、 能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都 由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。2、 保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。3、 使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。4、 对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。5、 保存好大体标本。对于有教学任务的医院病理科，除搞好疾病的诊断外，还有收集有价值的大体标本，有些大体标本，是很难得到的。因此要求在平时就要留心观察，小心处理。遇到有教学价值的罕见的典型的标本，就必须及时固定，认真给予对待。6、 可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。三、固定的注意事项1、 组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。2、 组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。3、 对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。有的固定液对于组织有膨胀作用。固定剂是一种化学试剂，有液体和固体之分，一般使用较多的是液体，而固体固定剂如多聚甲醛，则多用于实验研究的组织固定。固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同，英国著名的组织化学专家Pearse指出：对于每个既定的组织化学方法来说，选择最合适的方法是极为重要：在组织化学研究准备阶段不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分的反应基团的效用。Jones（1973），指出理想的固定剂必须具备的条件是，防止渗透损伤和收缩，以达到在各级可见度的水平皆无形态变化；要求组织所有的成分能保留于原位。他认为有三种试剂即甲醛、戊二醛和丙稀醛接近于达到上述要求。为了更好地把组织中各种成分尽量保存好，尽量好给予显示出来，就决不能千篇一律地使用一种固定液，而必须认真地深入研究各种固定液的性能和使用方法。例如：丙酮，它对组织有明显的皱缩，硬化作用，平常它是决不会被用来作固定液的，用它不但太浪费，造价太高，而且也使切片较为困难，但是，对于某些酶的研究，狂犬病脑组织的固定，某些细胞的培养等。最好的固定液还是丙酮。因为如果使用福尔马林固定液、石蜡切片显示酸碱磷酸酶就显示不好，狂犬病病毒的包函体就会消失掉，又如醋酸，它对胶原纤维等有膨胀的作用。由于各种固定液对不同的组织有不同的作用，因此许多专家将根据各种固定液的优缺点，配制出许多混合液的方法来，给组织的良好固定起到了非常积极的作用。但是，值得指出的是并非所有的固定液都不是十全十美的，例如，酒精、甲醛、醋酸固定液，对组织固定很好，组织中各物质的染色也十分清晰，但对固定脱水盒为铜质的组织时，效果就不好，原因是醋酸跟酮可发生反应，产生醋酸铜，沉淀于组织中，可造成对抗原的损害，对于免疫组织化学的显示，经实验证明：可呈弱阳性乃至阴性。由此可见，固定液的选择正确与否决定着对某些病例的免疫组化标记的成败关键。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。4、 组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。时间太短，就不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。5、 固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败，有的人认为，固定液的量与组织的比应是20：1，这个要求对于小组织来说是完全可以达到的，但对于大标本来说，则是一件非常困难的事情。因为对于大医院来说，每天都有几十上百例的标本，小如大头针大小，大的达几十斤的肿瘤，对于这样大的标本，按20：1的比例来做，显然是不可能的事，既要做到组织能固定好，又不使组织吹干就必须具体情况具体处理。对于大的标本，原则上是不让其暴露部分被吹干，这是因为在现实当中，大的标本往往露出容器一大半，因此对于这种情况，应取些脱脂棉或纱布，浸湿固定液后，盖于组织表面，以免使组织被风干，影响制片效果。6、 特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。固定剂是一种化学语试剂，有液体和固体及之分，平常使用的多为液体，Pearse指出，对每个既定的组织化学方法来说，选用最合适的固定方法是极为重要的；在组织化学研究中的准备阶段，不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分反应基团的效用。7、 组织的第二次固定或后固定。在一般的常规病理活检组织中，往往用一种固定液，就能够达到目的，获得满意的结果。但是，对于某些特殊病例光用一种固定液是不够的，必须根据不同的情况，使用特殊的固定液再次将组织固定，或者在切片后染色前再行固定。这种方法称为二次固定或后固定。例如：胚胎性横纹肌肉瘤，由于肿瘤细胞发育较幼稚，完全不象成熟的横纹肌组织所固有的横纹，在进行特殊染色前，就必须用Zenker氏固定液进行第二次固定，方能较好地显示出横纹肌纤维来。否则，效果不佳。另外，电镜固定的标本，通常都需要后固定。其使用方法是先用戊二醛固定，再用奥酸固定。四、固定液的使用当前，应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。1、甲醛：商品名为福尔马林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛气体饱和于水而成，比重为1.12。它也可以稳定的固体形式存在，它的成分为高分子量的聚合体，称为多聚甲醛。甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质如甲醇，这种在组织化学方法当中，能使酶钝化，影响其反应。甲酸，它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的组织，由于酸的作用，往往细胞核染色欠佳。甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链。参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及酰氨基，肽，胍基，羟基，SH和芳香环。甲醛与组织蛋白类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键。甲醛有这种交联的功能，也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中，需要做免疫组化的，往往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以利于后来的染色。甲醛可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，这就是10%的福尔马林.当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要。从组织学的观点来说，甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点： 组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好；固定均匀,穿透力强；能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片；能保存脂肪及脂类物质；成本较低。虽然甲醛有上述的优点,但这都是相对而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有许多缺点： 杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应；含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色；可产生福尔马林色素,影响观察；不能固定尿酸和糖类物质；容易挥发,污染环境,可导致标本干涸；可长期存在于固定过的组织上。有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,但需要经过长时间的流水冲洗(24天的冲洗)方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。应用甲醛,可以配成许多种固定液:1）10%缓冲福尔马林固定液甲醛 100ml蒸馏水 900mlNaH2PO4　4gNa2HPO4 　 6.5g该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固定较好,损伤较少,因对其后的各方面的研究都较好,尤其是对免疫组化的染色.2）10%福尔马林固定液甲醛100 ml自来水900ml这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。3）10%福尔马林盐固定液甲醛 100ml自来水 900mlNacl 9克先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染色，增加染色的强度。4）Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液 75ml甲醛 2 ml冰醋酸 5 ml该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平。5）醛糖钙固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸钙20g蒸镏水90ml先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对IgA ，IgM，J链，K链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭抗原。固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。2、酒精：又称乙醇，为无色透明的液体，沸点是78度，工业酒精是95%。酒精它有许多优点：1）存尿酸结晶和糖原等物质。高浓度的酒精如95%，无水酒精可保存上述两种物质，因它们易溶于水，因此，要证明上述两种物质的存在，就不能用含水的固定液来固定组织。2） 能在任何比例的情况下与水混合，在病理技术中，酒精是一种十分重要的试剂，它起着关键的作用。如果没有酒精，将会无法完成必要的工作。如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，在常规的工作中，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。3）可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，常用的有苯类试剂，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在这里充担着除去苯和连接水的作用，为切片入水架起了桥梁，因此称它为桥梁试剂。4）除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，由于所用的试剂都为水溶液，因此在切片上含有大量的水份，这些水份经系列梯度酒精的置换吸附后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。5）可用来保存标本。大体标本经福尔马林固定后，如为了陈列保存，必须取出冲冼。然后移入75%的酒精中。如果用福尔马林作陈列标本的固定液，则因为福尔马林含有杂质较多，液体容易酸化，时间一长，会逐渐变为微黄*色或淡黄*色，影响美观，影响陈列的效果。6）可与其它试剂配成多种的混合固定液，有时为了加快固定，常采用酒精和其它试剂来配成混合固定液，这种固定液在固定的同时，兼有对组织脱水的作用。应用酒精配成的混合固定液有：① Carnoy氏固定液氯仿 300ml冰醋酸 100 ml95%酒精 600 ml该固定液固定组织快速，在固定的同时兼有脱水的作用。溶液中的氯仿和酒精，对组织的收缩较厉害，但应用了冰醋酸，这种现象便被中和去。② AF固定液甲醛 100 ml冰醋酸 50 ml95%酒精 850 ml这种固定液的作用与上液有相似之处，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脱水用具不能使用铜制的脱水盒，因冰醋酸跟铜离子起反应，生成醋酸铜，这种物质可沉淀于组织间，可破坏组织中的抗原，造成免疫组化检测的失败。应用时应多加注意。酒精也有许多不足之处，它的缺点是：1）可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片，因为酒精可将它们溶解去，而石蜡切片组织中含有的脂类物质，则在组织脱水时被溶解去，只留下脂类或类脂物所占有的空间。2） 对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。高浓度的酒精，对组织有显著的收缩作用，造成组织发硬易脆，难以切片等现象。因此，它不作为单纯的固定液。3）渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。4） 可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。5） 可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。6）价格较贵。从经济学的角度，应用酒精固定组织划不来，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例标本需要100ml计，可固定50例标本，而一瓶 500ml的酒精，即使配成80%酒精，也只能固定6例标本，因此，若用酒精固定组织，其价格比用甲醛固定组织的要高8倍。3、冰醋酸。冰醋酸为无色透明的液体，易挥发，气味大，一打开瓶盖，整个文章都可闻其味道，纯醋酸在17℃时常为结晶状，因称为冰醋酸，在冬天使用时，可用微波炉进行解冻，再行使用，它的优点有：1）能迅速固定染色质，助于染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均匀，对于染色质的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明矾苏木素和伊红时，常常需加入一定量的醋酸，以促进染色。2）能使组织尤其是富含纤维的组织膨胀。各种固定液对组织都有收缩的作用，尤其是对富含纤维的组织。而它不但不会使组织收缩，而且还会令许多组织发生膨胀的作用。根据这个特点，用它配成许多种不同的混合固定液，以达到固定好，收缩少，易切片，效果好等目的。用它配成的混合固定液有：1） Zenker氏固定液：重铬酸钾 25G升汞 50G蒸馏水 1000ml冰醋酸 50ml先将重铬酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铬酸钾，应用热水或加温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中，如暴露于空气中，该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深，导致失效。临用时，取贮存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h，取出组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。应用该固定液的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。2） Flemming氏液2%酸水溶液 200ml1%铬酸水溶液 700ml冰醋酸 100ml该液中的奥酸对脂肪组织既有固定作用，又有染色作用，对有髓神经纤维也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色，该液不适合。应用该液固定的组织，切片不能太大过厚，一般1-2毫米厚固定时间1-3天，后经水洗，保存于80%酒精中，除上述两液体外，还有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有许多不足之处：1）不能作为单一的固定剂。冰醋酸在实际应用中，常被作为添加剂来使用，如许多种固定液，都加入了冰醋酸。另外，在苏木素和伊红染液中，也常加入了冰醋酸。2） 不能凝固蛋白质，不能保存白细胞颗粒，红细胞及含血铁黄素等。3）价格较贵。4、铬酸钾是一种固体，粉末状，桔红色，具有毒 性，较难溶解于凉水，因此在配制时用较高温度的水来溶解，也较易发生沉淀。它的优点是：1）能固定脂肪及类脂物。2）为髓鞘及嗜铬细胞优良的媒染剂。3）可配成多种的混合固定液（1） Helly氏液重铬酸钾 25g升汞 50g蒸馏水 1000ml甲醛 50ml临用时加入甲醛，因其加入后于24小时后可发生沉淀而失效，因用时应特别注意。该液是白细胞颗粒的优良固定剂，因此凡为白细胞或造血器官如骨髓，脾脏及患先天性梅毒之肝脏等，可用此液固定。此液原配方要求加入硫酸钠，但据我们经验认为，硫酸钠在液中对组织无任何作用，故省去。（2） Orth氏液重铬酸钾 20g蒸馏水 1000ml甲醛 100ml该液固定组织较缓慢，不适合于作临床的活检固定液，4毫米厚的组织固定时间需36-72小时，该液对于染色质的固定好，显示清晰，但可溶解部分红细胞和含铁血黄素。重铬酸钾的不足之处有：1）不能沉淀蛋白质，它必须和醋酸配成混合固定液，方能发挥作用，产生铬酸，沉淀蛋白质。2）具有毒性及产生高温。在配制液体时，如清洗剂，当加入硫酸时，可产生很高的温度，并挥发出刺鼻的气体，应特别注意。3）它不能长期固定组织，经它固定的组织应充分水洗后保存于80%酒精中。5、氯化汞又称升汞，具有毒性。单独用于固定组织，对组织有较大的收缩力，故很少单独使用。它可使组织蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，这是由于它穿透力极弱所致，因此它不适合固定较厚的组织。它常与其它的试剂配成混合固定液，彼此抵消各自存在的不足，使固定组织的效果非常好。应用升汞配成的固定液的优点有：1）细胞核及细胞浆染色清晰。2）对白细胞颗粒，造血器官如骨髓和脾脏等是优良的固定剂。3）可配成许多混合固定液如：Zenker氏、Helly氏和Stieve氏等。它的不足之处是：1）容易产生汞盐沉淀。经升汞配成的混合固定液固定的组织，一是不能固定太长时间，经24h后冲水，然后保存于70%或80%的酒精中，二是在洗色前，都必须用碘除去汞盐的沉淀，以免由于汞盐沉淀在切片上而影响对切片的观察。2）对组织有较大的收缩力且穿透力弱，用它不能固定过厚的组织，因穿透力弱，组织中间部分固定不好。3）具有毒性。五、微波辐射固定组织组织固定的结果是组织中的蛋白质凝固，以保存组织中原有的微细结构。常规固定用的是甲醛或酒精等。但是这些固定剂从某些方面来说其穿透力不很强，因而需要较长时间的固定，另者，临床上的冰冻切片，有的应用快速加热法预先固定组织，造成福尔马林的极度挥发，污染环境，影响人们的身体健康，因此寻找其它固定组织的方法就成为研究的重点。微波辐射固定组织，就是在这种情况下产生的。微波是一种具有能量的电磁波，在其运动期间可产生瞬间热。由于微波的快速运动，也导致了物体内部极性分子的快速运动，产生了热量，致使组织蛋白凝固，因此，旧的叫法称微辐射固定组织。按实际的应称为微波辐射凝固蛋白。1、 组织固定温度和时间的选择。究竟微波产生的热量需要多高，才级使蛋白凝固的呢：Masson氏等人的研究表明，700-90℃，对没有固定的蛋白可发生变性。Bernard经过一系列的研究后认为，肝、肾、肺的最佳固定温度是70℃，和77℃，因为各种组织的结构不同，成分不一，电子密度不一样，因而固定所需要的温度也不样。我们的实验认为，65℃左右的温度可适合于各种组织，条件是固定取小块材料，时间在截取3-4min。2、 微波炉档次的选择目前市售微波炉品种繁多，要选用合适的微波炉，必须根据各人的使用习惯和爱好。微波炉一般分为高火、中火及低火。使用时要进行系列实验。例如多少ml的固定液需要多少时间达到多少温度，用的是哪一档次的火等。3、 微波辐射需固定液的选择张素娟等应用临床活检新鲜组织如：甲状腺、乳腺和淋巴结，实验小鼠的肿瘤、肝脏、肾脏、心和肺等组织，分别用10%的福尔马林和生理盐水经微波辐射后，通过HE、网染、AB-PAS以及几种抗体如CEA、EMA和L26等的检测后发现，生理盐水的结果最好。一提固定，以往总与福尔马林分不开，而经微波辐射后的固定效果，竟然比前者好，这就解决了一大难题，即快速石蜡切片及冰冻切片的组织固定，以往用加热固定的方法，其结果导致福尔马林蒸发，使整个房间都充满福尔马林气味，既污染了环境，也影响了身体的健康。虽然生理盐水用微波辐射后对组织有良好的固定效果，但是它只能适合于少量的快速制片和某些研究，绝不可能适合于大批量的活检。因为活检取材，现目前组织的制作，都基本上用机器来进行，而所用的脱水盒，有铜和不锈刚的金属物所制成，组织取材后，一个一个的盒子装着组织，如果除去金属来用微波固定，这是不现实的事情。另外，微波辐射，它的穿透力较弱，大量的组织块，其中间是达不到要求的。
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紧跟其后：组织的取材方固定法和注意事项：1.1 取材对送检组织的要求 尽可能短时间内取材，10%福尔马林固定，特殊标本事先与相关部门联系。取材 根据需要确定取材部位、块数，切取的组织分别标号或标记，以便镜检时对照。注意事项 防止人为因素的影响
切取时用锋利的刀、剪，刀刃要薄，长。从刀根部开始向后拉动，避免前后拉动或用力挤压组织，用无齿镊轻轻挟组织，避免用有齿镊。 标本大小 paraffin: 1.5 X 1.5 X 0.2~0.3 cm, ICC: 1 X 1 X 0.2, cryosetion: thick 0.3-0.4cm 取材时间
应尽快取材，有时先固定后取材 包埋方向
边缘标记 1%硝酸银或碳素墨汁，伊红液 修整组织 尽量去除坏死组织、血凝块、污物、脱钙，去除多余的周围组织 核对 取材完毕应核对无误，方可保存。 组织存放
取材完毕，标本有序存放。 冰冻切片取材 同时作“冰对”、“冰剰”的常规石腊切片组织速冻法 液氮法，异戊烷-液氮法注意事项：标本盒不能直接浸入液氮；OCT适量；速冻，不能用冰箱缓慢冷却；组织块应密封保存不同组织取材方法 尺检 活检 细胞 1.2 固定方法固定的意义 用化学的方法，使细胞内的物质尽量接近生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为“固定” 保持细胞形态，防止自溶或凝固；蛋白质沉淀或凝固，使其定位；硬化组织，利于切片等 组织固定及固定方法 固定量：组织块的4-5X， 15-20X 固定温度：一般在常温(25C)下固定，酶组化等冰箱低温(4C)固定 固定液：多数固定液要临时配制 固定时间：固定液穿透速度一般为2-3mm/24h，所以应固定24小时，然后70%酒精保存 固定容器：玻璃瓶为宜，底部常垫以棉花使固定剂均匀渗入组织，并轻轻搅动。 固定方法：蒸气固定法；注射固定法；灌注固定法；细胞涂片浸入法、滴加法；微波固定 固定液 单纯固定液 甲醛formaldehyde formalin, 37-40% ,久存自行分解，形成白色沉淀，可过滤后使用。10%formalin (9:1, 水：40%formalin), 实际4%formalin 渗透能力强，组织收缩小，但脱水后收缩较大。 稳定二硫鍵而产生固定作用。 组织固定仅需数小时 苦味酸 pricric acid 黃色结晶体，强酸，易燃易爆。用饱和溶液 穿透慢，组织收缩明显，组织不硬化。 固定时间不宜超过24小时，尽快放入70%酒精 饿酸 osmium OsO4 强氧化剂，常用1-2%水溶液，电镜必需的固定剂 剧**，注意保护眼睛，皮肤，呼吸器官 主要为脂类固定剂 固定后水洗12h-24h 丙酮 acetone 易燃品 渗透力强，使蛋白质沉淀 酒精 alcohol, ethanal 固定兼脱水 固定速度慢，组织变脆 固定浓度为80-95% 混合固定液 Bouin液 配方：satrated picric acid:formalin:glacial acetic acid = 15:5:1 外科活检良好的固定液 固定液pH 3-3.5, 不宜长期 保存 PLP液 periodate-lysine paraformaldehyde 过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛 适用于富含糖类的组织固定 对细胞结构和抗原性保存良好 固定6-18小时 配方：A液 ：0.1moL/L lysine-0.5mol/L Na2HPO4 B液：8% paraformaldehyde 临用前，3份A液和1份B液混合后，加入结晶过碘酸钠(终浓度为2%) Zamboni液 对细胞超微结构保存好，常用于电镜免疫组化 固定6-18小时 配方：PFA 20g, 150ml satrated picric acid, PB (pH 7.2) 加至100ml Zenker液 形态学观察常用的固定液 固定多种组织 固定12-36小时 配方：重铬酸钾2.5g, 升汞5g, H2O 100ml, 冰醋酸 5ml , 避光保存 4% paraformaldehyde (PFA) 光镜免疫组化 配方：4g PFA， 0.1mol/L PB 100ml, 加热60C（或100C），滴加少量1 mol/L NaOH 临用前配，4C保存 中性甲醛生理盐水 应用最广泛的固定液 配方：formalin: 0.9% NaCl=1:9 中性缓冲甲醛 免疫组化常用的固定液 配方：40%formalin: 0.01 mol/L PBS =1:9 中性甲醛 常用固定液 配方：40% formalin 120ml, NaH2PO4 4g, Na2HPO4 13g, H2O 880 m 组织固定后洗涤 流水冲洗：2-12h 反复换液
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固定的目的是利用物理或化学的方法，使组织尽可能保存接近生命状态的结构，固定细胞内的各种成分，避免死后自身酶分解出现自溶，或外界微生物侵入繁殖导致细胞的超微结构受到破坏。能够固定细胞、组织结构的化学试剂称为固定剂。理想固定剂应具备以下几个条件：①穿透力强，能够迅速而均匀地渗透到细胞组织结构内，又不引起细胞的明显收缩和膨胀，不产生变形；②能够稳定细胞的结构和化学成分，使其保存在原位，保存细胞器的空间位置关系；③将细胞内的成分（蛋白质、脂类、糖类、核酸等）变为不溶状态，避免这些成分溶解和流失；④使细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能基团得以保存，以供电镜细胞化学测定；⑤能够增强图像的反差。但是固定过程不可能不对细胞、组织结构产生影响，目前尚未找到完美无缺的理想固定剂。各种固定剂作用特点不同，单独使用时弊病较多，配合应用可互相取长补短，收到较好的固定效果。补充几种：⑴四氧化锇又称锇酸(Osmium tetroxide，OsO4)，熔点40～41℃，沸点131℃，溶于水，酒精，呈浅黄色结晶，价格较昂贵，易挥发，其蒸气对眼、鼻、咽喉粘膜有强烈刺激，操作时应注意，一般锇酸被密封在玻璃安瓿内，配制操作应在通风罩内进行。锇酸为强氧化剂，能与蛋白质形成交联，稳定蛋白质的各种结构成分而不产生沉淀，它对脂类也有良好保存作用，是唯一能固定脂类的固定剂。另外，高密度的金属锇与被固定的组织成分结合，在电子束轰击时能散射大量电子，使图像反差增大，起到“电子染色”的作用。锇酸固定可避免组织块收缩或膨胀，便组织软硬适度，利于超薄切片。四氧化锇的主要缺点是由于分子大，渗入组织的速度很慢，不能保存糖原，不能固定核酸，对碳水化合物类固定效果也不好，能使酶活性丧失较多，不宜用于细胞化学研究。常用0.1M磷酸缓冲液(PH 7.2～7.4)配制的1～2％四氧化锇，固定时间一般为1～4小时(4℃)。常用于电镜。
⑵戊二醛：(glutaraldehyde，C5H8O2)：戊二醛沸点73～75℃，吸收光谱280nm。市售戊二醛为25％或50％水溶液，使用时配制成1～6％的不同浓度。长期保存的戊二醛因聚合或含有杂质使pH下降，吸收光谱在235nm左右，固定作用很弱，应予纯化。提纯的戊二醛应保存在4℃环境中。戊二醛渗入组织速度比四氧化锇快，所固定的组织可大至数毫米，且所固定的组织置于缓冲液可在冰箱内可保存数月，因此适于到远离实验室的现场取材固定。对糖原，核蛋白，微管，内质网等膜系统和细胞基质均有较好的固定作用，适宜于作超微细胞化学工作的固定剂。缺点是对脂质不起固定作用，没有“电子染色”作用，不适宜于单独作为电镜标本的固定剂。戊二醛与四氧化锇的双重固定能相互弥补缺点，从而取得良好的固定效果。常用磷酸缓冲液配制的2～3％戊二醛作前固定，时间可为30分钟至数天(4℃)。⑶高锰酸钾：高锰酸钾对磷脂蛋白固定作用良好，因此对固定细胞的膜性结构很有用，特别是能很好保存神经髓鞘结构和叶绿体，具有“电子染色”作用，但是不能固定细胞的其它成份。现已少用。⑷甲醛(Formaldehyde，HCHO)：甲醛固定液可用多聚甲醛粉(Paraformaldehyde)或40％中性福尔马林溶液配制。甲醛的优点是渗透力强、固定迅速、价格低廉，它对细胞基质保存不如戊二醛，但对酶的活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于组织化学灌注固定或作为前固定。一般不单独使用，仅作为戊二醛或锇酸的前固定液。固定时间为30分钟一2小时。电镜细胞化学样品固定常用多聚甲醛。以上四种是电镜所用的固定剂，但也常在光镜固定时使用。
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很强，很有用，原理和目的使我们日常工作中出现问题后查找原因的根据，一定好好学习。从免组到病理，在丁香园和WH2008学到了很多知识、学习的方法，感谢！
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我试过微波固定，能显示一般固定夜无法显示的超微结构，因为在一般情况下，即使是低温，在固定液到达并发挥作用之前，组织已经自溶了。
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切取时用锋利的刀、剪，刀刃要薄，长。从刀根部开始向后拉动，避免前后拉动或用力挤压组织，用无齿镊轻轻挟组织，避免用有齿镊。 标本大小 paraffin: 1.5 X 1.5 X 0.2~0.3 cm, ICC: 1 X 1 X 0.2, cryosetion: thick 0.3-0.4cm 取材时间
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这么好的帖子竟然没人顶！楼主辛苦了！请教一下，免疫组化也可以用甲醇固定的原理。谢谢！
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“扬子鳄与小鸭子”版主又出好帖了！“lyl06_10”战友的帖子也不错！问一下：大家在实验中，有多少采用了微波固定的方法？效果改善真的很显著吗？貌似不同的微波炉的条件不好摸索啊
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savid888 “扬子鳄与小鸭子”版主又出好帖了！“lyl06_10”战友的帖子也不错！问一下：大家在实验中，有多少采用了微波固定的方法？效果改善真的很显著吗？貌似不同的微波炉的条件不好摸索啊还望savid888战友在形态版多多指导工作和解答疑问，谢谢你了。微波固定我没有尝试过，没有经验。望有经验的战友来解答一下，谢谢合作，加分从优哦。。。
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不错，收藏了
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问一下，为什么基础研究文献中4%多聚甲醛paraformaldehyde很常用，特别是用于培养细胞固定？
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好贴一定要顶，版主们辛苦了！
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好的 谢谢了 好帖子
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对于我这种刚开始科研的新手，非常有帮助，谢谢！
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固定的目的是利用物理或化学的方法，使组织尽可能保存接近生命状态的结构，固定细胞内的各种成分，避免死后自身酶分解出现自溶，或外界微生物侵入繁殖导致细胞的超微结构受到破坏。能够固定细胞、组织结构的化学试剂称为固定剂。理想固定剂应具备以下几个条件：①穿透力强，能够迅速而均匀地渗透到细胞组织结构内，又不引起细胞的明显收缩和膨胀，不产生变形；②能够稳定细胞的结构和化学成分，使其保存在原位，保存细胞器的空间位置关系；③将细胞内的成分（蛋白质、脂类、糖类、核酸等）变为不溶状态，避免这些成分溶解和流失；④使细胞内酶的活性和其它大分子物质的活性功能基团得以保存，以供电镜细胞化学测定；⑤能够增强图像的反差。但是固定过程不可能不对细胞、组织结构产生影响，目前尚未找到完美无缺的理想固定剂。各种固定剂作用特点不同，单独使用时弊病较多，配合应用可互相取长补短，收到较好的固定效果。补充几种：⑴四氧化锇又称锇酸(Osmium tetroxide，OsO4)，熔点40～41℃，沸点131℃，溶于水，酒精，呈浅黄色结晶，价格较昂贵，易挥发，其蒸气对眼、鼻、咽喉粘膜有强烈刺激，操作时应注意，一般锇酸被密封在玻璃安瓿内，配制操作应在通风罩内进行。锇酸为强氧化剂，能与蛋白质形成交联，稳定蛋白质的各种结构成分而不产生沉淀，它对脂类也有良好保存作用，是唯一能固定脂类的固定剂。另外，高密度的金属锇与被固定的组织成分结合，在电子束轰击时能散射大量电子，使图像反差增大，起到“电子染色”的作用。锇酸固定可避免组织块收缩或膨胀，便组织软硬适度，利于超薄切片。四氧化锇的主要缺点是由于分子大，渗入组织的速度很慢，不能保存糖原，不能固定核酸，对碳水化合物类固定效果也不好，能使酶活性丧失较多，不宜用于细胞化学研究。常用0.1M磷酸缓冲液(PH 7.2～7.4)配制的1～2％四氧化锇，固定时间一般为1～4小时(4℃)。常用于电镜。
⑵戊二醛：(glutaraldehyde，C5H8O2)：戊二醛沸点73～75℃，吸收光谱280nm。市售戊二醛为25％或50％水溶液，使用时配制成1～6％的不同浓度。长期保存的戊二醛因聚合或含有杂质使pH下降，吸收光谱在235nm左右，固定作用很弱，应予纯化。提纯的戊二醛应保存在4℃环境中。戊二醛渗入组织速度比四氧化锇快，所固定的组织可大至数毫米，且所固定的组织置于缓冲液可在冰箱内可保存数月，因此适于到远离实验室的现场取材固定。对糖原，核蛋白，微管，内质网等膜系统和细胞基质均有较好的固定作用，适宜于作超微细胞化学工作的固定剂。缺点是对脂质不起固定作用，没有“电子染色”作用，不适宜于单独作为电镜标本的固定剂。戊二醛与四氧化锇的双重固定能相互弥补缺点，从而取得良好的固定效果。常用磷酸缓冲液配制的2～3％戊二醛作前固定，时间可为30分钟至数天(4℃)。⑶高锰酸钾：高锰酸钾对磷脂蛋白固定作用良好，因此对固定细胞的膜性结构很有用，特别是能很好保存神经髓鞘结构和叶绿体，具有“电子染色”作用，但是不能固定细胞的其它成份。现已少用。⑷甲醛(Formaldehyde，HCHO)：甲醛固定液可用多聚甲醛粉(Paraformaldehyde)或40％中性福尔马林溶液配制。甲醛的优点是渗透力强、固定迅速、价格低廉，它对细胞基质保存不如戊二醛，但对酶的活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于组织化学灌注固定或作为前固定。一般不单独使用，仅作为戊二醛或锇酸的前固定液。固定时间为30分钟一2小时。电镜细胞化学样品固定常用多聚甲醛。以上四种是电镜所用的固定剂，但也常在光镜固定时使用。
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楼主，您好，我有个问题想请教您：
标本取下后本应该立即经适当时间的固定然后做组织病理切片染色和免疫组化，但是由于其他原因而导致可能不能在要求时间内染色，或者说该批标本需要经过其他检测后再做组织病理，而这检测所需时间又未知，对于这样的情况，应该何时对组织进行固定。我采取的办法是取下组织放入-80度冰箱保存，再做完其他检测（这些检测是在常温下的）后，准备做组织病理前再开始固定等一系列操作，请问这样是否会影响实验结果以及免疫组化抗原活性。谢谢
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很有用！谢谢！
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讲的非常的好。论坛上大多是医生或研究生，不是搞病理技术的。对没有搞过病理技术的医生，不一定理解。专一的人，做专一的事情。谁想做蜡块，切片，可以找我。
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分享啦，楼主辛苦啦，很受用呵呵
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楼主，可否推荐下比较好的AB-pas试剂盒？辛苦搂主了。
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很实用！楼主辛苦啦！！！
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LZ你好~~你这里面没有提到多聚甲醛，在园子里看到免疫组化推荐多聚甲醛固定，能介绍一下吗？我是做小鼠肺的固定，有介绍用注射器抽真空的办法，你对肺的固定有什么建议吗？非常感谢
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学习了，谢谢！
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楼主，我想问一下组织放戊二醛中固定最长可放多久啊？我想把组织都固定号，然后再从里面选一部分做电镜
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好帖子，顶一个！
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楼主大牛你好：我想请问一下我做激光共聚焦，细胞用多聚甲醛固定后，然后用粘附蛋白去作用细胞，细胞固定以后，是不是蛋白只能作用于细胞表面，而不能进入细胞内部了？我们不搞基础，这方面知识很少，谢谢楼主的帮助！
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楼主大牛！感谢分享，看到了很多有用的！
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学习了，谢谢
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