百合上李属坏死环斑病毒和百合无症病毒的研究--《中国农业科学院》2008年博士论文
百合上李属坏死环斑病毒和百合无症病毒的研究
【摘要】：
百合(Lilium L.)是集观赏、食用、药用于一身的重要经济作物,现已成为国际上重要切花观赏花卉之一。近年来,随着我国观赏百合种植面积的迅速增加,从国外引进种球的数量和批次迅速增长,百合病毒病开始在各百合种植区发生流行。本文以发生在百合上的两种重要的病毒,百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)和李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)为研究对象,利用分子生物学技术,对上述两种检疫性病毒基因组的分子特征进行了比较研究,分析不同地区LSV的来源、分布及相关性,建立了多重PCR、RNA点杂交和RNA玻片杂交等适用于进境口岸百合种球病毒检疫工作的快速检测方法。研究获得的主要结果和结论如下:
1、揭示了PNRSV外壳蛋白基因序列与其病害症状类型间的相关性,并利用该分子特征建立起的多重RT-PCR检测方法,用于PNRSV轻型和重型两种不同的株系的初诊和快速检测。
根据GenBank中已报道的PNRSV外壳蛋白的基因序列,分析不同致病型株系间核酸水平上的差异,设计了两对特异性引物,并通过扩增条件的优化,建立了可区分PNRSV轻型和重型株系的多重PCR检测方法。该方法对已知的待测样品进行检测,在同一反应体系中扩增出了450bp和170bp两种大小的条带,可区分PNRSV轻型和重型两种不同的株系。揭示了PNRSV外壳蛋白基因序列与其病害症状类型间的具有相关性并可用于不同致病型株系的快速诊断和检测。
2、在分子水平上鉴定了百合上发生的PNRSV,证实PNRSV可通过百合种球带毒传播。
对待测荷兰进口的百合种球进行随机抽样,在温室内种植并观察,长出叶片后,用RNA Extraction Kit (Sangon, China)从幼嫩的叶组织中提取核酸。用根据PNRSV外壳蛋白基因序列设计的特异性引物进行RT-PCR扩增,电泳PCR产物。从待测的两个样品(P-299和P-503)中获得了450bp的目标片段。低熔点胶回收PCR产物,经纯化后克隆至pGEM-TG1载体,测序后进行序列比对分析。将所获得的上述两个分离物的核酸序列与GenBank中已报道的27个PNRSV分离物的CP基因序列进行比对,结果表明,P-299与P-503 CP基因序列相似性为99.8%。P-299和P-503 CP基因序列与27个已报道的分离物CP基因序列的相似性为84.5%～99.1%。据此可知扩增片段为PNRSV的部分CP基因序列,在分子水平上鉴定了百合上发生的PNRSV。将上述两个分离株的CP基因序列登陆GenBank进行了注册,P-299的登陆号为DQ992416;P-503的登陆号为DQ992417。
用插入了P-299分离株的部份CP基因互补序列的质粒P-299B做模板进行PCR,回收PCR产物,制备32P标记探针,对来自浙江丽水县田间的野生百合样品进行RNA斑点杂交检测,在24个百合样品中有5个杂交结果为阳性,证实了PNRSV在自然条件下可通过百合种球带毒传播,说明了百合是PNRSV的一个新寄主。
3、本研究采用RT-PCR法从来自国内不同地区进口百合次生代样品上获得了7个含有LSV基因组3′端部分序列的分离株。经过测序,应用DNAStar软件比较了其与已报道的12个LSV分离株的CP基因和16kD基因的同源性。序列分析结果表明:7个分离株蛋白外壳部分基因序列和16kD蛋白基因序列的相似性分别为87.4%~100%和97.9%~100%;在氨基酸水平上的相似性分别为95.9%~100%和95.7%~100%。系统发育树的比较显示,本研究获得的7个LSV分离株间在系统中有较近的进化关系,但这些分离株间没有明显的地域相关性,也没有发现与块根频繁运输相关的新亚群。
4、建立了RNA玻片杂交检测LSV的新方法。使用该方法对国内不同地区的进口和野生百合上LSV的发生情况进行了检测,结果表明LSV是存在中国境内百合上最为普通的病毒之一。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2008【分类号】：S436.8【目录】：
Abstract8-13
第一章 绪论13-33
1.1 百合的生产情况13-14
1.1.1 生产与种植情况13
1.1.2 制约百合生产的主要矛盾13-14
1.2 两种重要的检疫性病毒14-18
1.2.1 百合无症病毒（LSV）引起的病害及病毒生物学特性14-16
1.2.2 李属坏死环班病毒（PNRSV）引起的病害及病毒生物学特性16-18
1.3 植物病毒诊断技术方法18-28
1.3.1 生物学方法19
1.3.2 电子显微镜观察法19
1.3.3 血清学方法19-21
1.3.4 分子生物学方法21-26
1.3.5 蛋白与核酸特征结合的鉴定方法26-27
1.3.6 几种常用方法检测植物病毒灵敏度比较分析27-28
1.4 百合无症病毒的分子特征及检测技术研究进展28-30
1.4.1 LSV 病毒分子特征研究28-29
1.4.2 LSV 病毒的检测技术研究29-30
1.5 李属坏死环斑病毒的分子特征及检测技术研究进展30-31
1.5.1 PNRSV 病毒分子特征研究30-31
1.5.2 PNRSV 病毒的检测技术研究31
1.6 本研究的目的和意义31-33
第二章 PNRSV 的CP 基因特征与多重PCR 检测技术构建33-51
2.1 引言33
2.2 材料与方法33-36
2.2.1 病毒材料的准备33
2.2.2 制备TES DIECA 抽提缓冲液33-34
2.2.3 总RNA 的提取34
2.2.4 RT-PCR 体系的建立34-36
2.3 结果与讨论36-51
2.3.1 PNRSV 与等轴不稳环斑病毒属成员的RNA 3 结构特征比较36-37
2.3.2 PNRSV 不同株系间在RNA3 上CP 基因的结构变异研究37-38
2.3.3 基于PNRSV 中RNA3 特征的特异性引物设计38-41
2.3.4 PNRSV 不同致病类型的分子鉴定41-42
2.3.5 讨论42-51
第三章 李属坏死环斑病毒百合分离物的鉴定51-69
3.1 引言51-52
3.2 材料与方法52-53
3.2.1 病毒材料的采集与保存52
3.2.2 方法52
3.2.3 引物的设计与合成52
3.2.4 RT-PCR 扩增体系的建立52-53
3.2.5 RT-PCR 产物克隆、鉴定和测序分析53
3.2.6 RNA 斑点杂交53
3.3 结果与分析53-60
3.3.1 PNRSV 百合阳性样品的检出53-54
3.3.2 PNRSVCP 基因片段的克隆54-55
3.3.3 PNRSV 的CP 基因核苷酸序列特征分析55-57
3.3.4 利用斑点杂交技术检测百合中的PNRSV57-60
3.4 讨论60
3.5 结论60-69
第四章 百合无症病毒的分子特征与分子检测技术研究69-81
4.1 引言69
4.2 材料与方法69-71
4.2.1 病毒来源和试剂69
4.2.2 引物69-70
4.2.3 反转录与PCR 扩增70
4.2.4 核酸序列及同源性比较70
4.2.5 RNA 玻片杂交检测70-71
4.3 结果与分析71-75
4.3.1 序列分析71-74
4.3.2 LSV RNA 点杂交检测74-75
4.4 讨论75-81
第五章 全文结论81-82
5.1 结论81
5.2 本研究的创新点81-82
参考文献82-92
作者简历93
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悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析
目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析.方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析,收集主要蛋白质,SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量,并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清.结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白,而第二峰降段蛋白含量甚微,收集各段进行SDS-PAGE,出现6条蛋白区带,分子量分别为7、50、35、39、22和16kd.第一峰主要含22～71 kd蛋白质,峰2升段以14～16kd之蛋白质为主.对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带,蛋白分子量为50、39、22和16kd,病人血清结合百分比分别为100%、28.57%、57.14%和14.29%.结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分,第一峰的50、39和22 kd的蛋白质为主要致敏组分,第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原.
Abstract：
[Objective] To partially purify Platanus acerifolid of Wild pollen allergen and analyze the immunocompetence of its major proteins. [Methods] The Platanus pollen allergens extracts were purified by gel filtration with Sephadex-G-100 and the major proteins were collected. The molecular weight (MW) of major protein was tested by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel electrophoresis and the immunocompetence of its main proteins were analyzed by immunoblotting with sera of seven asthmatic patients allergic to Platanus pollen allergen specifically. [Results] Two elution peaks were collected after gel filtration. The first peak and the ascending branch of the second peak had plenty of proteins whereas the descending branch of the second peak had little proteins. The major proteins were tested by SDS-PAGE and the results showed six protein bands with the MW were 71, 50, 35, 39,22 and 16 kd. On SDS-PAGE, the proteins of the first peak were major in 22 to 71 kd and that of the ascending part of second peak were mainly in 14 to 16 kd. The results of immunoblotting analysis with seven asthmatic patients' sera showed 4 strip of IgG-binding components whose MW were 50, 39, 22 and 16 kd and the percentages of its combination with patient's sera were 100%, 28.57%, 57.14%, 14.29% respectively. [Conclusion] The Platanus pollen allergen had six kinds of main proteins and the proteins of 50, 39, 22 kd in the first peak were the major allergenic components and that of 16 kd in ascending part of second peak was the minor allergenic components.
SUN Xiu-zhen
LI Dong-fan
作者单位：
西安交通大学第二医院,呼吸内科,陕西,西安,710004
年，卷(期)：
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在线出版日期：
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