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我在做PCR时需要人体GAPDH或β -actin 引物,我能不能用手头现有的鼠的GAPDH或β -actin引物代替?人和鼠的引物不同吗?
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你可能喜欢关于内参的选择、大小和引物设计(内参,引物设计,引物,内参引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: 关于内参的选择、大小和引物设计(内参,引物设计,引物,内参引物)
摘要: [关于内参的选择、大小和引物设计(内参,引物设计,引物,内参引物)] 一个菜鸟问题：能用作内参的Ｂ－actin, GAPDH，为什么不同的文献上报道的大小均不同呢？是不是可以选择不同的内参引物？这各内参的引物该如何设计？还是有专门的引物可以用？由此而来的引物的大小又该怎么定呢？盼各位学长赐教。预谢!! 关键词:[内参 引物设计 引物 内参引物]……
一个菜鸟问题：能用作内参的Ｂ－actin, GAPDH，为什么不同的文献上报道的大小均不同呢？是不是可以选择不同的内参引物？这各内参的引物该如何设计？还是有专门的引物可以用？由此而来的引物的大小又该怎么定呢？盼各位学长赐教。预谢!!
回复内参是固有表达的，丰度较高，一般用来对逆转录的RNA定量。可以根据实验要求自行设计内参引物，设计方法同一般的引物设计。回复能做作内参的条件一般是表达较稳定，丰度较高。它能在组织当中广泛表达，通常用来来检测cDNA的完整性的，如果看家基因能表达，说明你的cDNA质量是好的。没有内参跑出来的结果是没有说服力的。目前Ｂ－actin, GAPDH较符合条件，应用也较多。Ｂ－actin更好一些。朋友所问的为什么不同的文献上报道的大小均不同呢？因为一般有这样一个原则，就是内参的大小和你的目的基因差别在100个BP以上，否则跑胶出来后后很难和目的基因区分开来，如果要在同一个管P的话，退火温度应该和目的基因相近。回复还是明白了一些，多谢指导。回复是不是内参可以不扩全长?回复我个人意见，半应该可以，请高手再回答，并讲一下道理。
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【求助】内参GAPDH和β-actin趋势不同是什么原因？
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这个帖子发布于3年零169天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
提完组织蛋白后，根据所测蛋白浓度调整上样体积，上样相同蛋白量，结果GAPDH条带比较整齐一致，各组条带大小密度较一致；但是做出的β-actin条带就不一致。重复过几次，GAPDH一直比较好，β-actin总是参差不齐。请问大家有么有碰到类似的情况？到底该不该根据β-actin条带再次调整上样体积呢？为什么GAPDH和β-actin趋势不同呢？
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自己顶啊。
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我也发现这个问题了。
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核内参PCNA抗体-用于细胞核内参的PCNA单抗增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）由Miyachi等于1978年在 SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶的辅助蛋白。由于其在细胞核内稳定表达，因此其抗体被广泛应用于细胞核蛋白的内参抗体。如何选择合适的细胞核内参抗体？常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。另外，我们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。PCNA的检测分子量大约在28kD，而Histone H3的检测条带大约在18kD，因此PCNA比较适合用于检测目标蛋白在较大的WB实验，而Histone H3则不适合用于13kD-23kD大小的目的蛋白内参。另外，虽然PCNA是最合适的核内参抗体之一，但是在某些条件下，一些影响增殖的因素会导致样品间PCNA含量的变化，就不适合作为内参。β-Actin抗体推荐—高效价的Beta-Actin内参抗体Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。如何选择合适的β-Actin抗体？内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，我们需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于β-Actin的检测分子量大约在42kD，因此该内参抗体不是很适合 用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，虽然β-Actin是最合适的内参抗体之一，但是在某些条件下，一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化。特别需要注意的是，在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。很耐用，质量也很稳定，购买后放了一年了，拿出来用效价还是很高，后来买了他们大包装的，直接定制的5ml，很推荐。——北京工业大学生命科学与生物工程学院一客户另外，我们还需要考虑自己的需要，特别是实验应用上的需要。一般来说，应用类型越多，在使用过程中的选择余地就越大，而小鼠源的单克隆抗体一般在特 异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl β-Actin抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:5000，最终使用液相当于500ml），要比效价低的1ml的β-Actin抗体（假如 WB检测的稀释比率是 1:200，最终使用液相当于2ml）性价比更高。因此在选择抗体的时候，不但需要考虑抗体的量，还需要考虑抗体的效价，即不同应用的建议稀释比率。详细地址： 如有兴趣和需要请致电免费客户专线<font style="color:#ff00-868到**捷科技有限公司垂询相关的产品信息及完整实验解决方案。
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amyjet 核内参PCNA抗体-用于细胞核内参的PCNA单抗增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen简称PCNA）由Miyachi等于1978年在 SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名。PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶的辅助蛋白。由于其在细胞核内稳定表达，因此其抗体被广泛应用于细胞核蛋白的内参抗体。如何选择合适的细胞核内参抗体？常用的细胞总蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等。对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参。当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。另外，我们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。PCNA的检测分子量大约在28kD，而Histone H3的检测条带大约在18kD，因此PCNA比较适合用于检测目标蛋白在较大的WB实验，而Histone H3则不适合用于13kD-23kD大小的目的蛋白内参。另外，虽然PCNA是最合适的核内参抗体之一，但是在某些条件下，一些影响增殖的因素会导致样品间PCNA含量的变化，就不适合作为内参。β-Actin抗体推荐—高效价的Beta-Actin内参抗体Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。如何选择合适的β-Actin抗体？内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，我们需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于β-Actin的检测分子量大约在42kD，因此该内参抗体不是很适合 用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，虽然β-Actin是最合适的内参抗体之一，但是在某些条件下，一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化。特别需要注意的是，在脂肪组织里，β-Actin的表达量非常低，不适合作为内参。很耐用，质量也很稳定，购买后放了一年了，拿出来用效价还是很高，后来买了他们大包装的，直接定制的5ml，很推荐。——北京工业大学生命科学与生物工程学院一客户另外，我们还需要考虑自己的需要，特别是实验应用上的需要。一般来说，应用类型越多，在使用过程中的选择余地就越大，而小鼠源的单克隆抗体一般在特 异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl β-Actin抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:5000，最终使用液相当于500ml），要比效价低的1ml的β-Actin抗体（假如 WB检测的稀释比率是 1:200，最终使用液相当于2ml）性价比更高。因此在选择抗体的时候，不但需要考虑抗体的量，还需要考虑抗体的效价，即不同应用的建议稀释比率。详细地址： 如有兴趣和需要请致电免费客户专线400-到**捷科技有限公司垂询相关的产品信息及完整实验解决方案。请问什么情况会影响actin变化呢？
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大神，我现在也遇到了同样的问题，请问您解决了吗？
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amyjet但是在某些条件下，一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化请问是哪些条件下β-actin会变化呢？
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dxy_py2z60ke 大神，我现在也遇到了同样的问题，请问您解决了吗？推荐用tublin或者actin。GAPDH本身就是一个代谢激酶，很容易受影响，导致内参不准确。
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GAPDH并不是一成不变的，感觉用它作为内参不太准确，因为它有时也进入到线粒体以及细胞核当中，需要好好斟酌
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关于丁香园关注今日：2 | 主题：400856
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western 内参用的GAPDH 和B－actin蛋白的分子量是多少？？
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actin 好像是42KD，GAPDH不知道。
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GAPDH is composed of four 30-40 kDa subunits. The molecular weight for GAPDH is 146 kDa. Since it is expressed in all cells it is for example becoming the marker of choice for a loading control in Western Blotting. The anti-GAPDH clone 6C5, which is developed at HyTest Ltd, gives very strong band in Western Blotting at dilution 1/2000, but it can be used down to 1/10,000 dilution!
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GAPDH是36KD。
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GAPDH 36kDa
B－actin 43kDa
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Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42KD左右。
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GAPDH即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步,它还参与核转录等事件,核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。 GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western Blotting的内参。
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