来源:蜘蛛抓取(WebSpider)
时间:2016-08-21 04:32
标签:
western blot
君,已阅读到文档的结尾了呢~~
昆虫神经毒素的表达、抗体制备、活性分析及应用研究论文,神经毒素,vx神经毒素,神经毒素属于,书神经毒素,单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备过程,单克隆抗体制备原理,单克隆抗体制备,活性炭制备
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昆虫神经毒素的表达、抗体制备、活性分析及应用研究论文
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Ni柱结合不上目的蛋白如何处理
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丁香园荣誉版主
这个帖子发布于12年零232天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
目的蛋白过Ni柱后,上清中仍有目的条带,是什么原因?如何处理?我是新手,请高手指点!!
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下次麻烦给电泳图作一说明,另外你的上清是指穿透峰吗?下面这个帖子可供你参考
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不好意思,先作一说明:右起1、2、3、4条带分别为:蛋白Marker、破碎前上清、破碎后上清、过Ni柱后的上清;目的蛋白分子量14KDa,在图上最下位置的条带为目的蛋白条带,纯化还处于初步阶段,我是用离心方法得到的上清。另外,我作了WESTERN BLOT,已经证明表达了的目的蛋白。
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减少上样量,降低流速,增加介质与目的蛋白的接触时间,如果效果不好,可以适当的加一些非离子的表面活性剂如Triton x-100
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如果洗脱中有目的蛋白,而上样穿透中也有,那么说明上样量太大,如果洗脱中没有,应该是没有结合上去,Q1:为什么没有洗脱的电泳条带?Q2:冒昧,目的蛋白是否是可以结合Ni柱的?
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从电泳结果看上样穿透前后没有明显变化,表明上样穿透液中有目的蛋白;在洗脱液中没有见到目的条带,分析蛋白没有结合上去。但我之前做了抗His Western blot,结果表明目的蛋白带有His标签。我再减少上样量、加Triton x-100 试一试,谢谢各位!!
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fruitsu 下次麻烦给电泳图作一说明,另外你的上清是指穿透峰吗?下面这个帖子可供你参考请问 fruitsu
穿透峰 指什么东西?谢谢
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在平衡缓冲液和样品中都不要加咪唑,降低流速0.5-1ml/min,这样再挂柱看看,或者可以参照我们以前的说法,直接把介质加到样品中,震荡2-3小时,直接用介质加loading buffer,煮5-10min跑电泳看有没有带,然后再在柱上分离。
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我减少了上样量、加了Triton x-100 ,重新进行了一次纯化,但结果仍不好.我怀疑是Ni-NTA Agrose的问题,想问问高手,Ni-NTA Agrose有沉淀,加填料之前,需要把Ni-NTA Agrose混匀吗?
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当然需要均匀了,要不然会影响柱效的,轻轻搅碎,你可以加20%乙醇过夜
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Ni-NTA Agrose上层是乙醇,加入的调料中有乙醇对实验有影响吗?做了两次仍得不到结果,哪位高手能否提供一些纯化方面的资料或你们纯化的实验步骤,非常感谢!!Email:wjun_2000_.cn
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我给你发了份详细的金属螯合层析的材料,你看看吧,会有帮助的,当然乙醇会有影响了,使用前先用水后用缓冲液平衡柱子,否则样品遇到乙醇如果有沉淀那就什么也做不出了,此外有机溶剂也许会对吸附不利,无论什么原因都需要平衡好柱子再上样。
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请问版主,镍柱遇到乙醇了还能再使用么?
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关于丁香园western blot中目的蛋白分子量<=30KDa(30KDa,24KDa,14KDa)时,电泳和转膜(湿转)各需要多长时间较好?
电泳一般电泳就行.浓缩胶 80v ,蛋白跑出后,电压增大为110v 跑结束即可.湿转条件为100mv 时间为50-80分钟都行.关键是采用的配胶浓度10%以上,12% 15%.
你所说的100mv是不是打错了?指的是100mA吗?
是的.100ma
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你是不是发了两次问啊?
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【求助】做western blot ,164个氨基酸有多大,换算成KDa,等于多少kda呀?
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这个帖子发布于2年零317天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
做western blot ,抗体说明书没写有分子量大小,只写有164个氨基酸大小,不懂换算,换算成KDa,等于多少kda呀?实验紧急,谢谢各位老师,
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每个氨基酸的平均分子量大约是110。所以这个的预测分子量是18kda左右。
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【求助】请教关于分子量14kDa蛋白的western blot??
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这个帖子发布于4年零258天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做western blot,测一个小分子量蛋白(14kDa),一直没有结果。我的电泳条件:1、普通聚丙烯酰胺凝胶,上层胶5%,下层胶15%;2、电泳80V,30min左右,待marker散开后,加电压110V-150V,继续电泳约503、转膜80V,30-50min。请教各位前辈:1、普通聚丙烯酰胺凝胶能跑出来吗?是否有必要用Tricine-SDS-PAG?
2、电泳时间、转膜时间是否合适?
3、其他还需注意些什么?
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14kd的蛋白用普通15%的westen可以的,不会跑出来,根据你的溴酚蓝来决定跑胶时间。电转条件没什么问题。如果是夏天电转,记得槽内放冰袋。否则温度过高。
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蛋白分子量比较小,建议你用PVDF膜,不要用NC,因为NC对小分子蛋白的截留能力不好。另外,如楼上所述,转印时尽量保证低温。
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第一个就是用SDS-PAGE胶是可以的,15%的浓度也没问题,再就是要用0.22um的PVDF膜,转膜液里面不要加SDS,不知道你用的什么仪器转膜,你用横流试试,200mA 45min,注意降温,仅供参考
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能跑出来,转膜 60V 30min,0.22 NC膜,没问题,能出来
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应该用0.22um的PVDF膜
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