CENP-E基因表达下调增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性--《重庆医科大学》2009年硕士论文
CENP-E基因表达下调增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性
【摘要】：
紫杉醇是一种作用较强的化疗制剂,可与细胞内纺锤体微管结合,抑制微管的组装,破坏纺锤体微管聚合解聚的动态平衡,从而导致有丝分裂阻滞及细胞死亡。目前常用于乳腺癌和卵巢癌等实体瘤的治疗,但是其作用常因药物耐受的形成而受到限制[1]。临床上多认为宫颈癌对化疗不敏感,因此化疗仅用于宫颈癌复发及晚期不能手术患者的姑息治疗。故对紫杉醇耐药原因进行探讨、提高其敏感性是当今医疗界亟待解决的问题之一。目前对紫杉醇作用的机制尚不完全清楚,研究发现紫杉醇主要通过影响分裂期细胞起作用;细胞分裂是一个复杂的过程,受多种基因和蛋白质调控,所以探索影响细胞分裂的蛋白质与紫杉醇之间的关系,可能对研究其耐药机制有着重要的意义。
CENP-E(centromere protein E)是一种特异地作用于有丝分裂期的驱动蛋白,连接着丝粒与纺锤体微管,在细胞分裂过程中具有重要的作用:不仅在染色体运动及中板集合中起着重要作用;而且还可能是有丝分裂检查点信号途径的一个关键蛋白[2];通过各种方法如显微注射抗体,siRNA,反义寡核苷酸或表达显性负相突变体等破坏CENP-E的功能,均能使中期出现错排的染色体[3、4、5]。CENP-E也是目前研究发现的最有潜力的抗有丝分裂药物靶点[29];CENP-E mRNA在大部分肿瘤组织中的表达相对于癌旁组织都是过表达[6]。本研究拟通过抑制肿瘤细胞CENP-E表达和紫杉醇处理肿瘤细胞的双重作用,探索CENP-E表达与肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性的关系。
本研究利用RNAi技术下调Hela细胞中CENP-E的表达,通过MTT和FCM法观察低表达CENP-E的Hela细胞对紫杉醇的敏感性,从而探讨CENP-E与紫杉醇在抗肿瘤治疗中的相关性。结果显示下调CENP-E的表达能增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性。并构建针对CENP-E的腺病毒载体,为进一步验证CENP-E在体内对紫杉醇敏感性的影响提供有效的工具。
第一部分RNA干扰技术抑制内源性CENP-E基因在宫颈癌细胞中的表达
目的:重组表达干扰质粒载体转染宫颈癌细胞(Hela)后,观察CENP-E基因表达的变化;以及CENP-E基因下调对有丝分裂检查点的影响。
方法:pshRNA-CENP-E重组质粒转染人宫颈癌Hela细胞,转染48h后运用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹(Western blot)及间接免疫荧光方法评价CENP-E的mRNA水平、蛋白水平以及内源性表达变化。CENP-E干扰后用微管解聚剂Nocadazol处理16h,观察细胞周期的变化。
结果:pshRNA-CENP-E可有效的抑制CENP-E的mRNA水平,蛋白水平以及内源性表达。CENP-E下调后的细胞用Nocadazol处理,G2/M期细胞显著降低。
结论:pshRNA-CENP-E能够特异地抑制CENP-E的表达,为后续实验提供基础;CENP-E基因下调后,减弱了Nocadazol有丝分裂检查点依赖的细胞周期抑制,有丝分裂检查点的功能可能受到一定的损伤。
第二部分CENP-E基因下调对紫杉醇作用于宫颈癌细胞敏感性的分析
目的:探讨CENP-E基因与紫杉醇协同作用下对肿瘤细胞的影响。
方法:本实验将细胞分为三组,分别为:未转染组(即空白对照组,Hela),转染pGenesil-1质粒空载组(即实验对照组,Hela/ pGenesil-1) ,以及转染pshRNA-CENP-E质粒组(即实验组,Hela/pshRNA-CENP-E),用不同浓度(1,3,10,30,100,300,nmol/L)的紫杉醇处理,用MTT(四唑盐比色试验)检测细胞增殖情况,FCM(流式细胞仪)检测细胞凋亡。
结果:MTT结果显示,CENP-E下调的细胞在不同浓度下的增殖抑制率与对照组相比明显增加(P﹤0.05),并呈现剂量依赖性;流式结果显示下调CENP-E,细胞的凋亡率明显增加(P﹤0.05)。
结论:下调CENP-E的表达能增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性。
第三部分针对CENP-E基因构建的siRNA腺病毒载体
目的:为验证体内试验,构建针对着丝粒蛋白CENP-E的siRNA腺病毒载体。
方法:设计并合成针对CENP-E的siRNA的靶序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy -1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染HEK293细胞,包装得到含siRNA-CENP-E的重组腺病毒,并进行大量扩增。
结果:构建的穿梭质粒经测序测定,与设计的干扰质粒完全符合。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后可见一条4.5Kb和约30Kb的条带,表明同源重组成功。将线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后于荧光显微镜下可见红色荧光。
结论:成功构建CENP-E的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究CENP-E的功能及其体内试验提供了有效工具。
【关键词】：
【学位授予单位】：重庆医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：R737.33【目录】：
英汉缩略语名词对照5-7
中文摘要7-11
英文摘要11-17
论文正文：CENP-E 基因表达下调增强宫颈癌细胞对紫杉醇的敏感性17-49
第一部分 RNA 干扰技术抑制内源性CENP-E 基因在宫颈癌细胞中的表达20-32
1 材料与方法20-27
2 结果27-30
3 讨论30-32
第二部分CENP-E 基因下调对紫杉醇作用于宫颈癌细胞敏感性的分析32-38
1 材料与方法32-34
2 结果34-36
3 讨论36-38
第三部分 针对 CENP-E 基因构建的 siRNA 腺病毒载体38-49
1 材料与方法38-44
2 结果44-46
3 讨论46-49
全文总结49-50
参考文献50-54
文献综述54-61
攻读学位期间发表的文章62
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京公网安备75号紫杉醇脂质体对宫颈癌HeLa细胞作用的实验研究
作者：丁香园通讯员
通过本实验,从细实了紫杉醇脂质体对宫颈癌 HeLa 细胞系的伤作用, 其影响细胞信号转导的机制还深入研究。点击以下文字可直接在线查看：　　
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你可能喜欢紫杉醇对HeLa细胞生长影响的研究--《吉林医学院学报》1999年02期
紫杉醇对HeLa细胞生长影响的研究
【摘要】：目的:研究紫杉醇对 HeLa 细胞的生长影响。方法:通过生长曲线、集落形成试验、分裂指数实验观察紫棚醇对 HeLa的影响作用。结果:应用紫杉醇前后生长曲线、集落形成试验、分裂指数实验的结果有明显差别。结论:紫杉醇对 HeLa 细胞的生长有抑制作用。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R737.33【正文快照】：
紫衫醇是近年开发的一种抗癌新药,主要用于卵巢瘤和乳腺癌的治疗,尤其对其它化疗失败的晚期卵巢癌有更好的治疗疗效[1,卯。鉴于迄今未见有紫杉醇对子宫颈癌作用的报道,本文主要研究国产紫杉醉对人宫颈癌细胞生长的影响,以探讨国产紫杉醇对人宫颈癌细胞的作用。材料与方法1.1材
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