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用凝胶回收试剂盒割胶回收小片段DNA忘了加异丙醇有没有影响？
试剂盒上要求回收小于400bp DNA时要加异丙醇，但是我做实验时忘加了，DNA回收率特别低，请问是不是没有加异丙醇的问题？异丙醇起什么作用
不加的话影响大吗？
这个看个人操作了& &有的回收得多&&有的就少&&最好加
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扫描下载送金币琼脂糖胶回收大片段DNA（23KB）遇到的问题！_百度知道
琼脂糖胶回收大片段DNA（23KB）遇到的问题！
回收效果非常不理想！！！回答满意,所含杂质特别的多，求有经验的大侠指点请问哪位大侠知道回收大片段DNA的方法！！我从土壤里提取的DNA，双倍增分，所以最好只能用胶回收！感激不尽，我用天根的胶回收试剂盒，而且片段要比回收前小
提问者采纳
好几年没做实验了，再纯化，那就换柱子。（呵呵，楼主是不是直接从土壤的细菌里头直接提取DNA，跑了一次电泳，以及未过柱前的溶液D（如果浓度太低，发现纯化之后的片断比目的片断小了？似乎我印象中PCR要这么长的长度本身就很难能全长扩增吧，吹打几次吸取一些溶液A。那么如果我的理解没错的话，天根的产品不过关（或者是你自己没有选对），应该可以很容易理解问题所在了，DNA到底留在了什么地方。当然问题有可能象1楼所说的那样，再将过柱后的洗脱液C。检测回收率，你可以在DNA溶解液过柱之后，可相应浓缩）肆个溶液再上一次凝胶电泳。我相信有这个电泳图的话，究竟你在过柱的这个过程中，柱子洗脱之前在柱子上加试剂盒溶解液，我也忘了细菌DNA大概多长），一切都将看得明明白白，同时吸取一些离心下来的溶液B，现在有能做23000bp这么长的PCR，再跑电泳，然后把目的片断割下来，不过我对1楼的回答有些疑问
提问者评价
感谢您，我用的天根的盒子，改进了他们的一些回收的步骤！虽然回收量比较小，但是总是没白干！
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其他3条回答
从你的实验结果看.com/zhidao/wh%3D450%2C600/sign=3fd0f759ee3d6d166d224e4adecc.Gel&nbsp，看他们是否有其他针对大片段DNA的试剂盒（我在国外，而只滤过了较小的杂质片段://b，这也是为什么纯化后目标基因变小的原因（实际上你回收的是杂质）;buffer溶解后.jpg" target="_blank" title="点击查看大图" class="ikqb_img_alink"><img class="ikqb_img" src="http.baidu，所以实在不知道国内的试剂品种.baidu。所以。我不是很明白什么叫做“片段要比回收前小”，一定要做凝胶回收;and&nbsp，一定要先将你的全部PCR产物做凝胶电泳;SV&nbsp，这就是为何你的DNA回收效果不理想的原因，回收效率只剩下47%，回收率要再下降将近50%.com/zhidao/wh%3D600%2C800/sign=094b36dbc713eb93fc50e1/503dd6d166d224e4adecc.jpg" esrc="http。首先.hiphotos，也无法滤过纯化柱，即使在加水或者TE&nbsp://b;System的回收效率与DNA大小的关系（下图）;Clean-Up&nbsp，但是在回收23000bp的DNA片段时。建议你联系天根公司。而且，给你看一下Wizard&nbsp，再切出你的目标DNA片段;PCR&nbsp.baidu://b！<a href="http.hiphotos，估计你所用的试剂盒根本无法滤过23000bp的DNA分子，如果你是从琼脂糖胶上回收的DNA片段，难道你是直接将PCR产物进行纯化而没有做凝胶纯化吗，抱歉）.com/zhidao/pic/item/503dd6d166d224e4adecc，而不是PCR产物直接纯化？直接纯化对多个大片段DNA的纯化是没有意义的。这家公司的purification肯定比天根的好，然后，做凝胶纯化回收，不过我非常肯定问题出在哪里，导致部分DNA遗失，这是因为回收DNA片段过大我没有用过国内的试剂盒
同意一楼！建议换用一下别的试剂盒，我现在一直用BioMiga的，感觉还不错！
用Qiagen的啦，有专门回收大片段的，效果还不错哦
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出门在外也不愁DNA目的片段的回收方法
DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于基因或是制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求：
（1）回收片段应有非常高的纯度
如从普通凝胶中分离出来的片段不可带有即使是微量的凝胶&#8213;&#8213;凝胶会抑制大部分的酶活力，对于后续DNA片段用于再酶切分析或连接均是不利的。
（2）回收过程必须是严格的无DNA酶污染的操作过程
衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，当降解作用仅发生在粘性末端时，在凝胶电泳中是无法看到回收的DNA片段有任何差异，但会导致DNA连接实验的失败，最终影响后续的实验。
（3）能回收不同大小的DNA片段
对于采用的回收方法必须能对不同大小的DNA片段均能回收，当回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用，造成大片段断裂。
（4）回收效率要高
回收方法要能对微量DNA也能进行操作，也即回收效率相对要较高，则对于实验中获得的非常微量的DNA样品也可进行分析。
（5）操作简单、快速
在回收过程中一般不需特殊的实验设备，也不需要昂贵的试剂，并且操作时间较短，象现在常用的试剂盒回收在电泳完成后整个回收过程只需30min左右，并且样品的回收率可达50％。&
1.1各类常用回收方法
由于分离方法众多，且各种不同的方法可能同时依据多项原理，所以只能粗略地将各种方法分成五大类：电泳法、收集孔法、机械破碎法、溶（熔）胶法与酶处理法：
&一、电泳法
根据凝胶割否分透析袋法与流动电洗脱法（割胶），滤纸-透析膜法与膜法（不割胶）。
&（1）透析袋法
该方法可回收大于5kb的片段，缺点是操作麻烦并易造成DNA酶的污染。
&（2）流动电洗脱法
该方法回收片段大小为4～50kb，且回收效率高达94～100％，极端条件下可回收大至550kb的片段。缺点是操作繁琐，而且为了取得较高的回收率，需特定的流动电洗脱槽。
&（3）滤纸-透析膜法
回收率平均达70％左右，不需割胶，操作相对简单，但实验中需将滤纸上的DNA洗脱，也较繁琐，也不易控制。
&（4）DEAE膜法
此方法用于回收小片段，一般小于5kb的片段回收效率较高，可达70％以上；对于大片段（&15kb）则难以从DEAE膜上洗脱下。
&二、收集孔法
&（1）蔗糖法
回收小片段效率较高，564bp的PCR产物带回收效率高达97.6%，并且回收中能将较宽的条带浓缩于收集孔中，但回收中制作收集孔较麻烦，并且收集孔中要加入蔗糖，故获得的DNA样品不能直接用于后续实验。
&（2）羟基磷灰石法
该方法回收效率也较高，不利之处与上述方法相同，获得的DNA需再纯化，操作也较繁琐。
&三、机械破碎法
指用机械力将凝胶压碎后再行回收DNA片段，有冻挤法，冻融法、压碎浸泡法、（单层）滤膜过滤法及双层（亲和）膜过滤法。
&（1）冻挤法
将胶条割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰冻30min后全速离心5min，收集清液，再经酚抽提、乙醇沉淀等纯化浓缩处理（也可直接沉淀）。其基本原理理是利用离心力将凝胶中原有的液体挤出，同时也带出胶中的DNA。从胶浓度为1%琼脂糖中回收650bp、1.1kb、2.0kb、4.5kb的片段时，回收率分别为90％、74％、56％、30％。这是因为大分子DNA更难于被胶中的缓冲液带出，所以此法只适用于回收较小的DNA片段。
&（2）冻融法
割下的胶条放在eppendorf管中，将之捣碎并放于-80&#8451;冰冻5min，取出后迅速放置于37&#8451;保温10min，如此反复3次能使DNA从胶中游离出来，离心获得上清中即含有目的DNA，可通过沉淀浓缩获得高浓度。对一般的DNA片段回收效率在60～80%。操作简单，并不需特殊设备。
&（3）压碎浸泡法
又称醋酸铵法，操作较费时，回收效率较低，一般改良的方法是在冻挤法操作中，加入一定的水并浸泡10min，增加DNA的回收率。
&四、溶胶法
根据物理或化学溶胶可分为低融点法（物理熔胶）与NaI、KI、NaClO4溶胶法（化学溶胶）。
&（1）低融点胶法
采用特殊的低融点凝胶，该胶在65&#8451;即溶化，实验中是先灌制正常的凝胶，然后用低融点胶取代其中的部分（即可节约低融点凝胶用量，也能保证电泳中整块凝胶的完整性。）电泳完成后割下的凝胶可于65&#8451;下保温溶解，后直接用于酶切，连接，DNA标记的实验。操作方便简单，但需特殊的低融点凝胶，成本较高，且回收得到的样品浓度较低。
&（2）化学融胶法
琼脂糖能溶解于一些盐溶液中（NaI、KI、NaClO4），然后可用特殊的纯化柱将DNA样品溶液纯化，现在广泛使用的凝胶电泳中DNA片段回收试剂盒基本采用了此中回收原理，能在短时间内获得目的DNA片段，成本也较低。
&五、酶处理法
对于大片段DNA的回收，象酵母人工染色体的克隆实验中，片段可大到2
000kb，一般采用此方法。利用琼脂糖酶降解琼脂糖，能较温和的裂解琼脂糖，最终成功回收DNA片段。
DNA回收中的注意事项
除了选择合适的方法外，实验中还要注意以下几点：
&（1）防止抽提过程中污染DNA酶
与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌（酶）处理，即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶，不然可能发生回收片段部分降解的现象，有时甚至一无所获。即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末端时也会导致严重的连接困难。
&（2）紫外照射选择长波段
回收过程往往需在紫外等监测下进行，与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯。因为短波紫外线（254nm）会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体，前者会使以后的连接与转化等实验失败，后者可能造成基因突变，给工作带来麻烦。即使是使用了长波紫外照射，回收DNA时也要尽量短时照射，避免连续长时间照射。
&（3）实验操作要轻柔
特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏，如吸取液体、转动离心管等操作均应缓慢、轻柔。
综上所述，只有在合适的回收方法基础上注意具作步骤是才能有效回收所需片段，为以后的酶切、连接、标记等工作打下良好基础。
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