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重楼总皂苷对人胃癌MKN-45细胞凋亡及Fas／FasL信号通路的影响
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纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞凋亡及对Fas介导的细胞凋亡通路的影响
优质期刊推荐组织细胞做流式及western&blot&价格
& 本实验室提供流式细胞检测及western blot
技术服务，流式和western blot 技术只限动物或临床类样本（组织），以下是常做流式及western blot
的一些常规操作方法及费用：
流式细胞检测方法：
一、&&&&&&&&&&&
细胞表面标记：
细胞表面分子的流式检测，利用相应的流式抗体直接标记单个细胞群体。根据抗体的类型（荧光标记一抗/无标记一抗）分为直接标记和间接标记。表面标记的细胞无需固定，只需处理为单个细胞即可。需要注意的是细胞消化过程中，所使用的酶对表面分子的影响。有的表面分子会受到消化酶的影响，检测之前需要做预实验检测。另外就是非特异吸附的去除，一般用1%BSA或相应的血清封闭即可。
二、&&&&&&&&&&&
细胞凋亡检测
细胞凋亡（apoptosis，Apo），又称细胞程序性死亡（programmed cell death
,PCD），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。在形态上，早期细胞核固缩、染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折、卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前向角散射光与细胞大小有关，而侧向角散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
流式检测凋亡的方法：
1、早早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3），Caspases-3
又称半胱氨酸蛋白酶3，是细胞凋亡信号传导通路中的ICE 蛋白酶家族的重在细胞凋亡发生的早期被激活。
2、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：Annexin V-FITC/PI
法：在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移到细胞外层表面。由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞DNA
可被PI 着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI
不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin
V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V
3、晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：TUNEL 法。细胞凋亡时，核酸内切酶活化，双链DNA
会出现许多不对称的断裂点，即产生一系列3'-OH的末端。外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶（terminal
deoxynucleotidyl tranferase,TdT）能够催化外源性荧光素或酶标记的dUTP 连接到DNA 的3'-OH
末端，用流式细胞术检测。近来的研究证实，Br-dUTP比生物素/荧光素标记的脱氧核苷酸磷酸盐复合物、地高辛更容易掺入到凋亡细胞的DNA中。因为Br-dUTP有很强的掺入能力，所以在用荧光素标记的抗BrdU单克隆抗体来检测时，会得到更好的流式细胞信号。未凋亡的细胞因为没有暴露的3’未端，所以不会被检测到荧光。
4、晚晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法。细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致DNA
广泛断裂。目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA
含量分析。细胞在染色之前，首先经去污剂处理，使细胞通透性增加，或者用沉淀固定剂进行固定。由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使降解的DNA
不能完全封闭于细胞中，在细胞洗染过程中DNA 碎片从细胞内逸出。因此，凋亡细胞DNA含量减少；加之由于DNA
的降解，与荧光染料的结合减少，故细胞DNA 荧光强度降低；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA
含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰。
5、细胞凋亡相关基因蛋白的流式细胞术检测：
（1）Fas/FasL(Fas 配体)：Fas 抗原与Fas
配体的交联是淋巴细胞诱导靶细胞凋亡的必需途径，它们的异常与免疫相关疾病、肿瘤、移植排斥、病毒性肝炎、肾小球肾炎等多种疾病高度相关。
（2）p53：p53 是细胞周期中的‘检查点’分子，其控制着细胞在DNA
损伤无法修复时启动细胞的‘自杀’进程。p53 的缺失或突变已被证明是多种肿瘤（如：乳腺癌、胃肠道肿瘤
及肝细胞癌等）发生的重要原因。其表达高低是肿瘤诊断和预后的重要指标。
（3）Bcl-2：Bcl-2 是细胞凋亡的抑制蛋白，其与肿瘤的发生、发展和治疗等有着密切关系。
三、&&&&&&&&&&&
细胞增殖检测
细胞增殖是生命的基本特征，种族的繁衍、个体的发育、机体的修复等都离不开细胞增殖。细胞增殖的流式分析方法大体分两类：
1、检测细胞增殖抗原标志物为基础的分析方法，Cyclins/DNA双参数法、Ki67/DNA双参数法、PCNA/DNA双参数法和BrdU/DNA双参数法等。
BrdU/DNA双参数法：BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类类似物，在DNA合成过程中能够掺入DNA链中，
细胞利用荧光标记的抗BrdU单克隆抗体和DNA荧光染料通过双参数进行流式分析。
Ki-67/DNA双参数法：Ki-67抗原是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原，与细胞DNA半保留复制相偶联，在有丝分裂的G1、G2、M、S期都表达，其中G2、M其表达最强，G0期不表达。流式检测中有多种标记方法，如Ki-67/细胞表面抗原染色法、Ki-67/DNA双参数色法、Ki-67/PCNA双参数色法。
PCNA/DNA双参数法：PCNA是一种分子量为36kD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶的辅助蛋白。其功能是将DNA单链连接成双链。在G0/G1期无明显表达，在G1晚期表达增加，S期达到高峰，G2/M期明显下降，其变化同DNA合成一致。
2、以检测细胞分裂情况为基础的分析方法，如CFSE单参数/多参数法、PKH67或PKH26单参数/多参数法。
CFDA-SE单参数/多参数法：CFDA-SE是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成带负电荷的CFSE，CFSE可自发不可逆的通过赖氨酸侧链或者其他胺偶联到细胞膜蛋白质上。在细胞分裂的时候CFSE标记物可平均分配到两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞以荧光强度的2倍递减为特征。
流式收费价格（标准）：
上机费：50元
&以下为代为标记收费标准：
&胞膜标记：30元/样
&胞内核内标记（如CD4IL-17,CD8IFNIL-2) ：100元/样
&Treg：55元/样
&细胞凋亡：25元/样
&试剂费用: 10元/管
&细胞周期：25元/样
&试剂费用：10元/管
&100管以内不优惠，100-500管8.5折，500管以上8折
&以上收费标准不包含抗体等试剂费用。
western blot 操作步骤：
收集蛋白样品
1、裂解细胞或组织，将其收集到EP管中，加入适量的裂解液，12000rpm/15min。将上清移至新的EP管中，加入LoadingBuffer稀释，混匀。（以上操作均在冰盒内进行）
2、沸水里加热5-10min，以充分变性蛋白。取出后直接放入冰盒内或者-20℃保存,如果需要长期保存，放于-80℃即可。
测蛋白浓度
比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。根据试剂盒调整蛋白浓度，使内参一致。
& 1、 将玻璃板洗净后晾干按要求装配好垂直电泳板，检查电泳板是否漏水。
& 2、 配制所需%浓度凝胶的毫升数。
&配制分离胶时，加入TEMED后，立即混匀，用枪从玻璃板的一端缓缓加入，待胶面升到绿带中间线高度，再加入异丙醇封压液面至排出气泡。待30min左右，看到异丙醇与分离胶之间有一条明显的界限，说明胶已凝固。然后倒去异丙醇用水轻轻冲洗，再沥干。
配制浓缩胶时，加入TEMED后，立即摇匀开始灌胶，直到液体接近溢出时为止。
立即插入适当的梳子，注意防止梳齿下产生气泡。
等浓缩胶室温凝固一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向内。）槽内倒入1X缓冲液。
& 4、 轻轻向上取出梳子，开始加样。
电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，我们通常设置在60V，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳，通常设置在100V左右。通常电泳时可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
1、将胶轻轻从玻璃板中取出，切取所需条带的分离胶后再剪差不多大小的滤纸，把滤纸浸泡在倒有甲醇的玻璃皿内。
2、把转膜用的夹子、滤纸、分离胶都泡在转膜液里，然后依次把滤纸、分离胶轻轻移到转膜的夹子上使重叠覆盖并排出气泡后，把夹子合上。
& 3、将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。一般设置电流200mA，转膜时间90min。
&&转膜完后，把膜泡在预先准备好的脱脂牛奶里，室温摇床晃动5min至过夜都可。&
1、用TBST浸泡一下后倒去，加入稀释好的一抗，过夜4℃摇床，慢慢摇晃。
2、次日回收一抗，用TBST冲洗一次后倒去，再加适量的TBST摇床20min/3次，快摇。
& 3、加入稀释好的二抗，过夜4℃摇床，慢慢摇晃。
4、次日回收二抗，用TBST冲洗一次后倒去，再加适量的TBST摇床20min/3次，快摇。
用显影液试剂盒（A液：B液=1：1配制），曝光即可检测出蛋白分子量。
western blot 收费（价格）：
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。& 缺氧与缺氧后吸入纯氧致肺损伤新生鼠肺组织细胞凋亡及Fas／FasL表达和意义
缺氧与缺氧后吸入纯氧致肺损伤新生鼠肺组织细胞凋亡及Fas／FasL表达和意义
摘 要：目的探讨细胞凋亡与其相关基因Fas／FasL系统表达在缺氧、缺氧后吸入纯氧致肺损伤发病机制中的意义。方法通过复制缺氧、缺氧后吸入纯氧大鼠肺损伤模型，采用TUNEL法、原位杂交检测、SqRT―PCR，W
【题　名】缺氧与缺氧后吸入纯氧致肺损伤新生鼠肺组织细胞凋亡及Fas／FasL表达和意义
【作　者】贺娟 顾晓琼 陶莉 吕回
【机　构】广东省广州市儿童医院,510120
【刊　名】广东医学,
【关键词】缺血缺氧 肺损伤 细胞凋亡 Fas／FasL 大鼠
【文　摘】目的探讨细胞凋亡与其相关基因Fas／FasL系统表达在缺氧、缺氧后吸入纯氧致肺损伤发病机制中的意义。方法通过复制缺氧、缺氧后吸入纯氧大鼠肺损伤模型，采用TUNEL法、原位杂交检测、SqRT―PCR，Wester Blot技术观察肺组织细胞凋亡情况、Fas，FasLmRNA及蛋白表达强度探讨其相关基因的表达情况。结果缺氧组或缺氧后吸入纯氧组在缺氧4h后即可见大鼠肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞出现凋亡现象，并随着时间延长，细胞凋亡指数增高（P=0．0239，P=0．0425），同时FasmRNA，FasLmRNA表达及Fas蛋白质、Fas―L蛋白质表达均上调．且缺氧后吸入纯氧组大鼠FasmRNA，FasLmRNA表达和Fas蛋白质、Fas―L蛋白质表达均较单纯缺氧组明显增强（P〈0．05）。结论细胞凋亡与FasmRNA，FasLmRNA及其相关蛋白表达的上调可能参与缺氧和缺氧后吸入纯氧时导致的肺损伤。
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缺血缺氧,肺损伤,细胞凋亡,Fas／FasL,大鼠
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幽门螺杆菌cagA蛋白及其疫苗候选抗原对T细胞Fas Ligand介导凋亡的调节作用
【摘要】：目的　评价幽门螺杆菌 (Hp)多种功能蛋白致T细胞凋亡的能力 ,以探求它们在Fas/FasL介导的机体T细胞耐受中的作用 ,为Hp疫苗研制寻求安全有效的免疫原。方法　应用JAM技术对cagA阳性Hp及同源基因突变株、重组尿素酶、粘附素HpaA及外膜蛋白Hop2 5、35、38致T细胞系凋亡的能力进行了比较 ;应用流式细胞术对上述因素特别是cagA阳性菌株诱导T细胞FasL表达的能力进行了检测 ;应用金属蛋白酶抑制剂和蛋白合成抑制剂分别提高和降低Hp介导的T细胞凋亡 ,以证实其与FasL合成的关系。结果　HpcagA阳性株无论在提高T细胞表达FasL还是在诱导T细胞凋亡方面的作用均强于同源基因突变株。Hp抗原制品中尿素酶对T细胞无杀伤能力 ,而Hop38毒性最强 ,Hop2 5、Hop35和HpaA等作用较弱。金属蛋白酶抑制剂提高了cagA阳性Hp致T细胞凋亡的能力 ,而蛋白合成抑制剂Emetine则通过抑制T细胞FasL表达而抑制了Hp介导的T细胞凋亡。结论　cagA蛋白及Hop38能通过调节FasL表达造成T细胞耐受 ;尿素酶、外膜蛋白Hop2 5、Hop35和HpaA不会通过抑制T细胞而导致耐受机制的发生 ,因而可安全应用于疫苗研制。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R392-33【正文快照】：
幽门螺杆菌(Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)感染可以引起胃炎和消化性溃疡,并能促进胃癌的发生。常用的联合药物治疗方案存在病人依从性差、毒副作用大和细菌获得性耐药等不足,因此,开展疫苗的研制十分重要。Ｈｐ感染可导致宿主发生Ｔ细胞耐受。人们已在胃粘膜
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