请教一下老师,PCR有两个图,一个正常的扩增曲线,一个对应的对数曲线图,就是相当于把图旋转了一下

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每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,设为基线荧光阈值的(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold= 10*SDcycle 3-15

*起始拷贝数越多(病毒载量越多)Ct值越小。

阈值线就是在扩增曲线上人为设定的一条与扩增曲线相交的一条线而扩增曲线与閾值线相交出对应的循环数就是Ct值(如图1)。

在对荧光定量PCR的数据进行分析时机器一般将荧光阈值设置为3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,但实际应用时要结合扩增效率、噪音等因素来综合考虑阈值线设置得太低就会受到噪音的干扰,出现Ct值过低的情况;阈值线太高结果就不准确,甚至出现假阴性那么,阈值线设置在哪里合适呢

根据扩增曲线的基线期、指数增长期、线性增长期和平台期的分段(如图2),下面简述手动调整阈值线的一般原则:

第一阈值线通常设置在指数增长期的中后期(如图3),因为此处是样本重复性最好嘚区域(如图4);

第二在多重荧光定量PCR中,每个靶标或通道都要设置相独立的、合适的阈值线因为不同靶标扩增出的信号大小和指数期的位置都会有差异;

第三,阈值线要高于阴性对照和基线噪音

要注意,阈值线需要按通道依次调节

一般1000以上的 有典型S型曲线的 都要重點考虑

阴性对照出现的微微上扬 可能是体系经过多次的热循环的背景信号累计因为不断的热循环会对探针也有一定的破坏。还有可能是體系中各个分子之间的不确定性反应导致的背景信号增加

新冠判读需要综合分析:那就是阈值线的可调节范围可以很大

3本身的曲线是不昰标准的S曲线

4还有考虑调整后的Ct值是不是超过了设定值质控。

5阈值线没有一个标准的值的范围

对数图谱的阈值线就在指数中后期

就左边這个是对数图形,取了Log之后成了右边的了咱们看的都是线性图。

如图所示机器自动基线设置的太宽,就会出现基线下倾的现象标本茬15个循环之前就进入指数增长期,而机器自动基线固定的把指数增长期作为基线就导致此种曲线的出现,只需手动把基线起始循环数调整为指数增长期之前即可比如将此数据的起止循环数调整为3-8个循环数后,扩增曲线就恢复正常了

实验中常见的气泡干扰实验结果分析,气泡导致的折线不仅影响阈值线调节的准确性,更会影响结果的判读这种情况怎么调整基线呢?很简单只需把基线的起始循环数設置在气泡出现的循环数后即可。

比如图中的2个孔位气泡破裂的循环数为11、14,我们将起止循环数设置为15-20后即可恢复正常,如图

你好扩增曲线可粗略地判断扩增效率。SYBR Green的baidelta Ct法要求目的基du和内参的zhi扩增效率基本一致dao如果不一致,需要对公式进行修正部分qPCR仪的配套软件可以做到,直接輸入每对引物的扩增效率但无论如何,保证高扩增效率是实验成功的关键如果扩增效率一致,不同Ct的曲线显示出来就基本是平行的位迻其倾斜程度基本一致。而如下图一样一条比较“陡”,另一条比较“平”那么意味着扩增效率不一致。有可能是引物效率不一戓者个别样品、反应孔存在抑制PCR的污染等。

来自:肽度时界威客吴博士有科研难题、科研需求就上肽度时界吧!

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