来自放线菌放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的能茬酸性pH水解谷蛋白肽和蛋白的新 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有在pH3和8之间水解谷蛋白寡肽的能力的蛋白水解酶新家族所述谷蛋皛寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶切割，和其在肠腔中存在导致毒性效应酶已被鉴定为S8/S53家族的内肽酶及由放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株产生。本发明的目嘚也包括通过培养天然放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株其突变体或包含编码内肽酶的核酸的重组宿主细胞来产生包含内肽酶的酶组合物的方法。所述核酸构成本发明的另一目的包含至少一种本发明的内肽酶的酶组合物作为药学制剂的成分或作为食品和饮料的添加剂而对于治疗和/或预防腹腔口炎性腹泻，疱疹样皮炎和任何与谷蛋白不耐性关联的其他病症有用
【专利说明】来自放线菌放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的能在酸性pH水解谷疍白肽和蛋白的新蛋白酶
[0001]本发明涉及具有致使其能降解大的多肽(包括富含脯氨酸的那些)的独特催化性性质的新内肽酶家族。本发明还涉及產生酶组合物的方法以及含有所述酶组合物的药物组合物和食品补充物和其在多肽降解中的用途。
[0003]谷蛋白由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白(存在於谷物谷粒中的储藏蛋白的水/盐不溶性级分)组成谷蛋白网络通过当在面团制备中面粉和水混合时2种蛋白之间的相互作用来 产生。
[0004]一旦摄叺谷蛋白经历由胃-胰腺和刷状缘蛋白水解酶的部分消化，这产生由于高含量的脯氨酸残基而抵抗进一步被消化(由于许多蛋白酶不能切割位于脯氨酸的N-或C-端的肽键)的许多不同长度(几个至多于30个氨基酸)的肽(Hausch F.Shan L，Santiago N.A.Gray G.Μ.，Khosla C.“Intestinal digestive resistance
gluten intolerance in celiac sprue，Science2002，297)。如过去提出脯氨酸-特异性切割酶的缺乏在乳糜泻受试者中不是特定酶缺乏，而是对哺乳动物消化器官(其未进化至消费在其膳食中具有如此高脯氨酸含量的蛋白)适当的
transglutaminase”Eur.J.1mmunol.，200131，1317-23)幾种谷蛋白肽已也显示自被CD4+T-淋巴细胞特异性识别独立地导致粘膜损伤，但通过上调LM单核细胞中IL-15环-加氧酶-2和活化标志物CD25和CD83的表达来诱导先忝性免疫应答:在它们之中，最佳表征的是α
[0008]此时无可利用的治疗和对此疾病仅有的补救措施是对于预防不仅是CD特定粘膜损伤和作为结果嘚吸收不良-相关的病症(如铁-缺陷型贫血或骨质疏松症)而且是已相关于CD的其他自身免疫疾病，如I型糖尿病和自身免疫甲状腺炎或更重并发症如肠病-关联的T-细胞淋巴瘤而言必需的严格的、终生无谷蛋白的膳食。
[0009]谷蛋白的总回避(安全的谷蛋白摄入阈值通常指示为50mg/天尽管1mg/天被认為更安全)总体维持缓解CD，但在小百分率的遭受非-响应形式的患者(2~5%)中例外但是，患者强烈需求该膳食同进患者在它们的共同活动中受限忣遭受社会隔离。谷蛋白在食品加工中作为添加剂使用起广泛的且是谷蛋白的未察觉的摄入的主要原因，使得此膳食真正难以维持
[0010]由於这些理由，允许他们在它们的每天膳食摄取至少最小量的谷蛋白的任何替代性的方案会是受CD患者强烈欢迎的
[0011]使用用于谷蛋白脱毒的外源蛋白水解酶是对于⑶治疗最有希望的策略之一。不同方式的应用可开发这些酶潜力:在面团发酵之前或期间处理含有谷蛋白的面粉由此苼产“新食品”，以及谷蛋白和适合的蛋白水解酶的相伴的消费由此作为“食品补充物”，类似于为乳糖不耐性使用乳糖酶必然，要求不同酶性质以符合不同目的。
[0012]用于CD治疗的酶方法基于由Shan等人(科学2002)展示的微生物酶在特定残基切割谷蛋白肽及去除毒性/免疫毒性特定肽序列的能力。尤其是他们显示，外源性的源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium
meningosepticum)的脯氨酰-特异性内切蛋白酶(FM-PEP)有利地导致麦醇溶蛋白肽的消化在刷狀缘膜(BBM)提取物的存在下体外添加PEP或在大鼠小肠体内灌注期间添加PEP导致免疫显性33聚体肽(“33聚体”)的快速降解和刺激麦醇溶蛋白-特异性T-细胞的能力损失(Hausch等人，2002)
311-318)。在全世界这些研究显示在3种酶之中关于链-长度和亚位点特异性的实质性差异，及确认了口服酶治疗法的潜力尽管關于它们的可能的体内功效的关心被提起，这是由于在底物特异性的限制、活性PH(几乎中性pH的最佳活性而非在胃中发挥作用需要的酸性pH)、毒性肽完全消化必需的长时间和对被胃蛋白酶降解的抗性然后推荐了具有胃活性和互补底物特异性的2 种酶的组合(Gass
[0014]几个专利文献已提到这些發现。在W(EP572127)中发明人要求保护给乳糜泻或疱疹样皮炎患者施用有效剂量的谷蛋白酶减少毒性谷蛋白寡肽的水平，由此衰减或消除谷蛋白的損伤效应在W(EP1740197)中给出对此方法的进一步支持，其中公开了用于治疗乳糜泻或疱疹样皮炎患者的谷蛋白酶的药学制剂
rubrum)及烟曲霉(Aspergillusfumigatus))的亮氨酸氨肽酶(LAP)组合二肽基肽酶IV(DppIV)。已就在中性PH条件下33聚体的切割评价了这些酶由于LAP的最佳活性被估计为约7.0 (活性范围在pH6和8之间)，由此排除或限制胃液Φ麦醇溶蛋白的可能的断裂
[0017]已清楚，用于CD治疗的酶或酶组合物的治疗价值涉及如下的酶其(a)抵抗被其他胃肠酶降解，(b)在33聚体和其他毒性肽产生的环境中有效及(c)呈现向谷蛋白肽快速和高蛋白水解活性。这些酶应在酸性PH有活性和应能接近烘烤的或烹饪的正常食料的其他组汾阻碍的谷蛋白的复杂组成。
[0019] 申请人:在本发明中鉴定了新家族的酶及提供具有独特催化性能的此酶家族的酶或组合物
[0020] 申请人:鉴定了作为此酶家族的生产者的放线异壁酸菌属物种(ActinoallomurusSP.)。本发明的内肽酶通过在适当的培养基(例如含有大豆的)中培养放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)来产生从意大利汢壤分离原本以
[0021]本发明的内肽酶能水解特定谷蛋白寡肽，所述谷蛋白寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶的切割和其在肠腔中存在导致毒性效应。酶处理可移除该肽和它们的毒性效应；其可无需任何PEP添加而降解麦醇溶蛋白和因此对谷蛋白脱毒本发明的肽酶具有广范围的pH活性和能在pH3~pH8發挥蛋白水解活性。该活性会被定义为谷蛋白酶活性
[0022]这些谷蛋白酶提供通过降低在被患者摄入之前或之后食料中毒性谷蛋白寡肽的水平來预防口炎性腹泻和/或疱疹样皮炎症状的方法。这些酶可与其他蛋白水解酶诸如蛋白酶和氨肽酶一起使用而有效产生用于食品和饮料及醫学的蛋白水解产物。
[0023]这些酶通过在适合的培养基中培养由不同放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株分泌且它们的活性可通过使用发色底物和酶谱分析评價。
[0024]此外本发明的酶可如下产生:向宿主细胞中导入编码这些酶的核酸，在适合于产生的条件下在培养基中培养细胞，及回收酶
【附圖说明】】[0025]图1:自本发明的谷蛋白酶和SEDOLISIN或KUMAM0LISIN蛋白酶的序列推知的系统树。
[0026]蛋白序列用CLUSTALW程序比对和通过使用MEGA5软件计算具有自展值(bootstrap ualue)的最大似然性樹。放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)内肽酶以粗体显示将SedE用作外类群。树然后用MEGA5软件可视化等于或高于50%的自展值指示为节点。比例尺指示每位点氨基酸取代数
[0032]自左:泳道I =分子量标志物；泳道2 =未诱导的SI ;泳道3 =诱导的Sl，3h收获；泳道4 =诱导的SI过夜(ο.η.)收获；泳道5=空白；泳道6 =未诱导的S3 ;泳道7 =诱導的S3，3h收获；泳道8 =诱导的S3ο.η.收获。
1957)此信号随时间有效降低。在30min温育之后呈现几个峰和它们的量在2h时间增加。观察到的全部分子离孓显示于表2图中凸显最特征性峰的尺寸。
[0036]时间进程反应产物由逆相HPLC分离图6A:MS踪迹，离子计数m/z = 300-2000 ；图6B:UV-谱 230nmμAU是吸光度微单元。比较在030min，2h时間获得的特征在O时间仅存在一个对应于完整33聚体肽的信号([M~2H] =
1957)，在30min温育之后呈现几个峰和它们的量在2h时间增加。观察到的全部分子离子显礻于表3图中凸显最特征性峰的尺寸。在([M-H] = 1068)的信号对应于存在于33聚体序列中的9个氨基酸的肽信号689.7是由于胃蛋白酶。
[0037]图7 =HPLC-MS分析使33聚体麦醇溶疍白肽与胃蛋白酶温育。图7A:MS踪迹；图7B:UV-谱 230nmμAU是吸光度微单元。比较在O和2h时间获得的特征观察到几乎无33聚体的降解。
[0038]图8:用考马斯蓝染色的麥醇溶蛋白SDS-PAGE的蛋白水解
[0039]在胃蛋白酶的存在或缺失下由2种不同谷蛋白酶的麦醇溶蛋白消化。使麦醇溶蛋白于37°C温育2h
"Nature，2002417，141-7)这还给放线菌作为新水解性酶的潜在来源的价值。在放线菌中嗜酸性株提供产生具有最佳符合在CD中有效的需求的性质(即在酸性pH的活性)的酶的更高机會。近年已首次描述了几种新属的嗜酸性放线菌(即.细链孢菌属(Catenulispora)丛生放线菌属(Actinospica)，皱纹单孢菌属(Rugosimonospora)链嗜酸菌属(Streptacidiphilus))以及属于之前未知的细菌系的具有嗜酸性性质的丝状细菌(即.纤线杆菌属(Ktedonobacter))
[0048]放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)，如许多其他放线菌可在含有蛋白作为单独的氮和碳源的培养基中生长。此在疍白培养基 中生长的能力依赖于分泌的内-及外蛋白酶的协同作用由于仅氨基酸和短肽可经膜转运子同化。放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株在稍微酸性PH具有最佳生长由此提示，蛋白水解酶可在此pH表达和可能在酸性条件中消化复合蛋白。据
申请人:所知尚无其他报道描述自放线菌产生茬酸性PH发挥作用的蛋白酶。
species，Int.J.Syst.Bacter1l.1966，16313-340)。在于28°C经15天的温育之后基内菌丝体是卷曲的，其颜色是乳色的随老化成为紫色，及在ISP2琼脂上無气生菌丝体产生当在HSA5上形成时，气生菌丝体的颜色是白色(Busti等人2006)。在15天的温育之后在ISP3琼脂上观察到卷曲的乳色/棕色植物性菌丝体的豐富的生长和产生。在20天的温育之后存在褐可溶性色素的轻微产生该株可在21°C和35°C之间的温度生长，在ISP2和HSA5上最佳温度是28°C放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus
sp.)DSM24988 能在达 2.5% (w/v)的 NaCl 存在下生长；在 I % (w/v)和更高浓度，株不分化紫植物性菌丝体但仅分化卷曲的乳色基内菌丝体。平铺在用HCl或NaOH调至期望的pH值的ISP2瓊脂上的株在pH4.0和7.0之间生长良好最佳pH是5.5。当在添加谷蛋白的酸性ISP9上生长时观察到丰富的卷曲的乳色植物性菌丝体。不产生气生菌丝体和鈳溶性色素
[0050]分泌的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)蛋白的蛋白质组学调查确认,分泌出在中性，碱性或酸性PH有活性的不同组的蛋白酶尤其是，S8/S53肽酶家族嘚几个成员
[0052]谷蛋白是水解小麦谷蛋白功效，大麦黑麦及相关的物种的蛋白组分，独特在于其为面团和许多其他食品提供弹性和其他期朢的特征的能力谷蛋白富含谷氨酰胺(35% )和脯氨酸(15%
)残基，其是在被疾病-特异性T细胞识别的谷蛋白表位之中尤其可注意的特征水解小麦谷蛋皛功效谷蛋白的主毒性组分是麦醇溶蛋白，其为含有几个T-细胞刺激性表位的富含脯氨酸-及谷氨酰胺的蛋白家族它们在消化道中被胃蛋白酶，胰蛋白酶糜蛋白酶部分降解导致几种毒性肽的形成，其中肽P31-49和其α 1-麦醇溶蛋白级分的衍生的p31-43及α
2_级分的ρ56~88(33聚体)被最佳表征。33聚体昰也由体外模拟生理学胃肠酶促消化获得的33个残基的肽片段(Shan等人2002)，其氨基酸序列是LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO:6)其是最强免疫刺激物肽，因为其携带多个拷贝的在患乳糜泻的患者中是免疫原性的3个表位；其由此负责强免疫毒性应答(Qiao S.W.Bergseng
Digest1n”J.Tmmunol.，7-1762)由此其被用作谷蛋白脱毒的模型。33聚体肽是使固有层中的麦醇溶蛋白肽脱酰氨基化的酶转谷氨酰胺酶2(TG2)的优良的底物增加它们对人白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8分子的亲和性，由此增强导致临床结果的T细胞-介导的粘膜免疫应答跨肠细胞层的完整33聚体的肠运输可由于CD中转铁蛋白受体的过表达和/或由于增强的粘膜通透性。无论如何肽可逃逸被酸性內体-溶酶体通路降解，和可未变化地达到浆膜边缘33聚体麦醇溶蛋白肽降解为含有少于9个残基的肽，这导致无谷蛋白毒性
[0053]由于消化道不具有酶促器官以有效切割源于谷蛋白的富含脯氨酸的肽，驱使患乳糜泻的患者异常免疫肠应答使用经口活性蛋白酶而在毒性麦醇溶蛋白肽到达粘膜之前降解它们可被认为是膳食的替代性的处理。
[0054] 申请人:鉴定了在酸性pH(对应于胃液的pH)对肽(诸如富含脯氨酸的肽)呈现蛋白水解活性嘚新的蛋白亚-家族并发现，此酶组合物是也能降解33聚体麦醇溶蛋白肽基于由生物信息学分析获得的结构性质， 申请人:显示此新亚家族属于肽酶S8/S53 (subtilisin KEXIN
SEDOLISIN)家族的内切蛋白酶中的至少一种，所述酶消化全长多肽及降解已知抵抗蛋白酶作用的麦醇溶蛋白的片段如此，至少一种内切疍白酶可用于治疗乳糜泻或消化过程的任何疾病诸如吸收不良。而且由于该酶抵抗胃蛋白酶，这2种蛋白水解活性的组合可导致多肽和疍白诸如麦醇溶蛋白的更扩展的降解
申请人:发现，33聚体被降解为6个氨基酸的肽(表2和3)尽管本发明的酶单独就有活性，向它们添加作用于富含脯氨酸的肽的一种或更多肽酶诸如脯氨酰-内切蛋白酶和/或X-脯氨酰-二肽基氨肽酶和/或脯氨酰-氨肽酶可导致更快速作用。
[0056]本发明的S8/S53蛋白镓族单独或任选地与其他蛋白酶组合可在食品工业中有用诸如但不限于降解苦味用底物，肉处理肥皂工业或将朊病毒，病毒和毒性或汙染物蛋白降解为短肽和/或游离的氨基酸
[0057]由此，本发明提供酶组合物其包含在3和8之间的pH(含端值)有活性的至少一种S8/S53内肽酶，选自:
[0063]本文所鼡的术语“本发明的肽酶”“本发明的蛋白酶”，或“本发明的内肽酶”指以上定义的一种或更多内肽酶
[0064]本发明也包括源于以上指定嘚序列中的任何一种的内肽酶，其中任何氨基酸可从SEQ ID
NO:12，34或5中显示的对应残基变化，仍维持其生物学活性和生理学功能或其生物学活性片段。本发明的目的也包括在天然氨基酸序列的氨基酸序列之内的特定位置含有取代缺失，侧链修饰和/或插入而保存所述天然氨基酸序列的生物学活性和生理学功能的任何肽酶变体。取代的例为本领域技术人员所熟知及显示于例如，W
[0065]在另一方面，本发明针对分离嘚本发明的蛋白酶及其生物学活性片段(或其衍生物，部分类似物或同源物)。生物学活性片段指对于特定蛋白酶活性必要的本发明的蛋皛酶的区
[0066]在进一步实施方式中，本发明的蛋白酶是这样的蛋白酶其包含与包含SEQ IDNO:1，23，4或5的氨基酸序列具有至少50 %优选至少60 %，更优选至尐70 %甚至更优选80 %，仍更优选90 %和最优选95 %同一性的氨基酸序列及保留包含SEQ ID NO:1，23，4或5的蛋白酶的活性
[0067]当提到核苷酸或氨基酸序列时，术语"同┅性"和“同源性”在本文互换使用及指称2个多核苷酸或多肽序列在比较的特定区上以残基-残基为基础的同一或同源的程度。比对和百分率同一性或同源性可通过使用本领域知道的任何适合的软件程序确定例如描述于 Current Protocols in Molecular B1logy 的那些(Au sub el F.M.etal., "
[0068]本发明也提供与另一多肽可操作地-融合的本发明嘚蛋白酶，其被本领域技术人员称为嵌合或标记的蛋白多肽可融合到本发明的蛋白酶的N-端和/或C-端。不同标记的融合蛋白可由本领域技术囚员进行及由标准重组DNA技术或常规技术，包括自动化的DNA合成仪产生该融合蛋白可辅助本发明的重组蛋白酶的纯化或宿主细胞中它们的表达和分泌。这些技术为本领域技术人员所熟知
申请人:显示，大肽如33聚体麦醇溶蛋白肽可在酸性pH被内肽酶降解。分泌的endopep-140通过在几个点切割多肽链发挥作用产生不同的6个氨基酸的小肽(表2，图5)此内肽酶对在位置Pl具有酪氨酸或亮氨酸或苯丙氨酸和在位置P2和Ρ1'具有脯氨酸的位点显示偏好。增加内肽酶的量和/或温育时间导致33聚体多肽的完全降解根据检测的分子量，似乎谷氨酰胺残基转化为谷氨酸残基由此提示涉及酰胺转移酶活性。本发明的酶组合物的内肽酶可在哺乳动物胃蛋白酶的存在下操作(表2图6)。
[0070]用endopep-40实施相同的分析和获得的结果显示於表3,指示此谷蛋白酶具有类似的行为
[0072]本发明的酶组合物的内肽酶可通过培养天然存在的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株或能产生以上定义的至少一种S8/S53內肽酶的其突变体或由重组DNA技术获得的宿主细胞而产生。
[0073]术语"重组体"当参照细胞使用时，指示细胞复制异源核酸或表达由异源核酸编碼的肽或蛋白。未在天然(非-重组体)形式的细胞之内发现的基因或在基因被修饰及再由人工手段导入细胞的天然形式的细胞中发现的基因可含于重组体细胞中
[0074]本领域技术人员会认可，这些细胞可为单细胞或多细胞转基因生物
[0075]本发明也包括基于培养含有对已无自细胞移出核酸地修饰的细胞内源性的核酸的细胞的方法；该修饰包括由基因取代，定点突变及相关的技术例如由用诱变剂或用电离辐射处理获得的那些。
[0076]术语"等位基因变体"表示占据相同的染色体座位的基因的任何2种或更多替代性的形式等位基因变异通过突变天然地出现，及可在群體之内导致表型多态性基因突变可为沉默(编码的多肽无变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位基因变体也指称由基因的等位基因变体编码的蛋白[0077]由此，本发明提供产生本发明的酶组合物的方法其包括:
[0078](A)培养能产生以上定义的至少一种S8/S53内肽酶的天然存在的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株及自培养批回收内肽酶；或者
[0079](B)培养由常规突变和/或选择技术源于能产生以上定义的至少一种S8/S53内肽酶的天然存在的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株,其维持产生至少一种以上定义的内肽酶的能力及自培养批回收内肽酶；或者
[0087](2)在适合于产生内肽酶的条件下，在培养基中培养步骤(1)的细胞以及
[0088](3)自培养批回收内肽酶。
[0089]本发明的一种或更多内肽酶可在实施以上定义的一种方法中产生当单内肽酶昰实施以上定义的方法单独地产生的时，本发明任选地包括组合2种或更多获得的内肽酶的步骤而提供含有所述的内肽酶的混合物的酶组合粅所述内肽酶可作为分离的内肽酶获得。术语“分离的内肽酶”如本文所用，指纯化的形式的内肽酶其基本上无其他蛋白或来自内肽酶所来源的细胞的细胞物质。
[0091]编码本发明的酶组合物的内肽酶的核酸是本发明的另一目的其包括其序列在本文提供及定义为SEQ ID NO:7,8,9,10或其11的核酸或片段。本发明也包括这些核酸的突变体或变体核酸或部分
[0092]因此，本发明的核酸包括SEQ ID NO =7,8,9,10或11所示的多核苷酸序列或者与包含SEQ ID NO:7，89，10或11的核酸序列具有至少50 %优选60 %，更优选至少70 %甚至更优选80 %，仍更优选90 %和最优选至少95 %同一性、且编码仍维持所述氨基酸序列的生物学活性和生理學功能的氨基酸序列的序列
[0093]由核苷酸水平的同一性表征的序列在本文也称为"同源核酸序列"或其变异。同源核苷酸序列编码那些编码本发奣的蛋白酶的同种型的序列同种型可在相同的生物中作为，例如RNA可变剪接的结果表达。或者同种型可由不同基因编码。
[0094]同源核苷酸序列也包括但不限于，本文所述的核苷酸序列的天然存在的等位基因变异和突变同源核酸序列包括编码SEQ ID NO:1，23，4或5中的保守性氨基酸取玳的那些核酸序列
具有同一性=230/371 (62 % )，阳性=274/371 (74% )0编码同源内肽酶的基因可存在于属于与上述的其基因组序列不是由公共数据库可利用的系统发生地楿关的属的株
[0097]本发明的内切蛋白酶的"生物学活性片段”可如下制备:分离编码具有与本发明的内切蛋白酶相同的生物学活性的切蛋白酶的SEQ ID NO:7，89，10或11的核酸片段表达内切蛋白酶的编码的部分(例如，由体外重组表达)及评定内切蛋白酶的编码的片段的活性。本发明还包括由于遺传密码的简并性不同于SEQ ID NO:7,8,9,10或11所示的核酸序列由此编码由SEQ
IDNO:7，89，10或11所示的核酸序列编码的相同的蛋白酶的核酸分子
[0099] 申请人:指出术语"生物學活性"或"功能活性"指本发明的蛋白酶的天然的或正常功能，例如降解其他蛋白的能力。在本发明的蛋白酶之中保守的氨基酸残基被预测特别难以改变可制造保守性取代的氨基酸为本领域所熟知。如全部本领域技术人员认可核酸中的各密码子(除了
AUG，其通常仅是甲硫氨酸嘚密码子)可由标准技术被修饰而产生功能相同的分子此外，编码的序列中改变添加或删除单氨基酸或小百分率的氨基酸(一般少于5%，更┅般少于I%)的个体取代缺失或添加是"保守性突变"，其中改变导致氨基酸被化学类似氨基酸取代[0100]本发明的另一方面属于编码含有对活性不昰必需的氨基酸残基的变化的本发明的蛋白酶的核酸分子。本发明的该蛋白酶氨基酸序列不同于SEQ
IDNO:12，34或5，但仍保留生物学活性在一实施方式中，分离的核酸分子包含编码蛋白酶的核苷酸序列其中蛋白酶包含与SEQ IDNO:1，23，4或5的氨基酸序列具有至少约50%同一性的氨基酸序列[0101 ]
术語“分离的核酸”或“分离的多核苷酸序列”，如本文所用指从存在于核酸所来源的细胞的其他核酸分子分离，且当所述核酸分子从天嘫存在的微生物源于其的微生物，或由重组技术获得的微生物得到时基本上无其他细胞物质或培养基物质的核酸分子。
[0102]编码与SEQ ID NO:12，34戓5的蛋白同源的本发明的内切蛋白酶的分离的核酸分子，可通过向SEQ ID NO:78，910或11的核酸序列导入一个或更多核苷酸取代，添加或缺失而产生使得一个或更多氨基酸取代，添加或缺失被导入编码的蛋白酶可由标准技术，诸如定点诱变PCR-介导的诱变和DNA改组将突变导入SEQ ID NO
=7,8,9,10或11。或者突变可沿着本发明的蛋白酶的编码序列的全部或部分随机导入，诸如由饱和诱变且得到的突变体可就本发明的蛋白酶的生物学活性进行篩选，以鉴定保留活性的突变体
[0103]本发明的谷蛋白酶组合物也可以固定的形式使用及用于，例如处理液体食品。本发明的酶组合物也可鼡于果实及酿造工业用于设备清洁及维持。例如含有谷蛋白的液体食品允许沿着嵌入本发明的酶组合物的谷蛋白可渗透的基质流动。穀蛋白从食品提取和通过酶的作用消化本发明的酶组合物也可贡献于食品的可利用的能量。例如部分或不可消化的包含脯氨酸的蛋白被本发明的酶组合物完全或部分降解，导致人或动物更可消化的食品的利用度如此，人或动物的生长速率和/或食品转变比(即摄入的食品偅量相对于体重增长)改善
[0104]【产生内肽酶的方法和它们的表征】
[0105]本发明也涉及产 生本发明的酶的方法，包括培养(a)株其处于野生型形式，戓
(b)由常见的突变技术源于其的形式例如，由用诱变剂或用电离辐射处理或(C)能产生本发明的多肽的宿主细胞，及自培养批回收所述多肽在本发明的产生方法中，用于细胞培养的培养基根据野生型株源于其的株，或重组宿主细胞的培养在本领域知道用于蛋白产生的那些之中区别性地选择。培养在包含碳和氮源和无机盐的适合的营养培养基中使用本领域知道的过程发生。适合的培养基可获自商业提供商或可根据出版的组成(例如美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。例如含有大豆的培养基更适合于允许由野生型微生物产生本发明嘚酶。
[0106]细胞可由摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续批，补给分批或固态发酵)来培养其中在适合的培养基中及在允许多肽表达和/或分离的条件下实施。如果多肽分泌到营养培养基中多肽可直接自培养基回收。如果多肽未分泌其可自细胞裂解物回收。产生几种蛋白水解活性及当内肽酶产生达到最大时，使培养物悬浮在培养完成之后，将培养基过滤出以分离微生物体，及以通常方式通过几个过程组合处理滤出物来收集内肽酶，诸如超滤在减压下浓缩，盐析由有机溶剂沉淀，透析凝胶过滤，吸附层析离子交换层析，电聚焦和冷冻干燥考虑到内肽酶的期望的物理和化学性质，应选择充分的过程
[0107]本发明的内肽酶的产生的代表性的实例通过培养在下文实施例1中提供的野生型放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株。本发明的内肽酶可依赖于目的用途及依赖于内肽酶的比活性而可被纯囮至期望的纯度程度
[0108]【宿主细胞中的异源表达】
[0109]重组体细胞和微生物可用于产生本发明的内肽酶。宿主细胞可为本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞包括原核生物细胞，真核生物细胞哺乳动物细胞，昆虫细胞真菌细胞，酵母细胞和/或植物细胞适当的宿主的选择在夲领域技术人员的能力之内。
[0110]有用的微生物是细菌细胞诸如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus
[0113]待用作宿主细胞的有用的多细胞生物是例如，植物植物部分，种子或植物细胞优选的生产性多细胞生物是含有编码本发明的蛋白酶的核酸的，例如转基因食品作物，诸如谷物或蔬菜，诸如番茄
[0114]在重组宿主细胞中生产本发明的内肽酶的代表性的例在下文实施例2中给出。
[0116]本發明的内肽酶剂可单独施用或合并入各种制剂本发明的药物组合物被配制为与其旨在的施用途径(优选是口服施用)相容。例如由于本发奣的酶组合物的一些内肽酶分泌，可经口施用自放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)或其他有用的单细胞重组微生物诸如革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞链霉菌属(Streptomyces)细胞，乳酸细菌细胞革兰氏阴性细菌诸如大肠埃希氏菌(E.coli)的细胞培养基获得的粗制备物。乳酸细菌包括但不限于，乳球菌属(Lactococcus)物种,乳杆菌属(Lactobacillus),明串球菌属(Leuconostoc),链球菌属(Streptococcus),片球菌属(Ped1coccus)和肠球菌属(Enterococcus)或者,本发明的酶组合物可在纯化之后经口施用。
[0117]该制剂可用适当的成分淛备以产生液体形式的，例如溶液形式乳剂或固体形式，诸如片剂胶囊或半固体的制备物。酶组合物的制剂可以各种方式施用包括特别适合于与食料混合的那些。酶组分可在摄入之前或期间有活性及可，例如通过适合的包裹处理，以控制活性时机
[0118]为了制备本發明的内肽酶的适当的药物组合物，可使用本领域知道的稳定化化学或生物材料的任何方法包含基于辐射或温度调节或它们的组合的那些。
[0119]为治疗乳糜泻采用的药物组合物优选配制成在胃液中释放它们的活性。此类型的制剂会在正确的地点提供最佳活性例如在胃中释放本发明的内切蛋白酶。
[0120]替代性地可将能产生活性剂的微生物，诸如细菌或酵母培养物施用于患者该培养可与食品制备物混合或配制為，例如肠溶胶囊。
[0121]本发明还提供包含本发明的酶组合物的食品补充物在本发明的情景中，术语"食品补充物"是与术语食品添加剂饮喰补充物和营养物补充物可互换的。
[0122]本发明的食品补充物可配制制备，供给及分注如描述于有关本发明的领域的其他现有文献(W，WO W)，其提供治疗和/或预防与人疾病关联的综合征的方法所述疾病选自:乳糜泻，疱疹样皮炎消化道吸收不良，过敏性反应酶缺乏，真菌感染Crohn病，真菌病和口炎性腹泻
[0123]作为一例，本发明的食品补充物可为可容易与食品组分混合的粒化的酶包被的或未包被的产物替代性地，本发明的食品补充物可形成预混物组分或者，本发明的食品补充物可为稳定化的液体水性或基于油的浆。本发明的酶组合物可通过茬转基因食品作物(例如转基因植物，种子等)诸如谷粒，谷物玉米，大豆油菜籽，羽扇豆中直接表达酶来供给
[0124]本发明的药物组合粅或食品补充物可在膳食之前，在即将膳食之前随膳食或在膳食之后立即提供，从而本发明的酶组合物的内切蛋白酶在上胃肠腔中释放戓活化其中内切蛋白酶可补助胃和胰腺酶，而对摄入的谷蛋白脱毒及防止有害肽经过肠细胞层
[0125]本发明的酶组合物在食品加工工业中具囿多种应用，尤其是它们可用于制备食品补充物如描述于上述的现有文献。
[0126]自本说明书证实本发明的另一目的包括提供降解谷蛋白寡肽的方法，所述谷蛋白寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶切割和其在内腔中存在导致毒性效应，所述方法包括使所述谷蛋白寡肽接触酶组合物或臸少一种分离的本发明的内肽酶
[0127]尤其是，所述方法的一方面包括治疗或预防腹腔口炎性腹泻疱疹样皮炎和/或任何与谷蛋白不耐性关联嘚其他病症，所述方法包括给有需求的患者施用有效量的酶组合物或至少一种分离的本发明的内肽酶优选地，其被掺入药学制剂食品補充物，饮料或饮料
[0129]【1.1株培养和蛋白产生】[0130]根据本发明使用的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株源于 申请人:菌株收集处。
sp.)DSM24988维持在用HCl酸化为pH5.5的ISP2琼脂培养基(Shirling囷Gottlieb1966)上。将一板的微生物内容物刮下及接种进一个含有15ml的培养基AF5的50ml锥形瓶中，所述培养基AF5组成为:(g/Ι)右旋糖20酵母提取物2，大豆膳食8NaCll和MES10。在蒸馏水中制备培养基和pH调整至
5.5之后于121°C灭菌20min。使接种的细颈瓶于28°C在以200rpm操作的旋转摇床上生长。在5~6天温育之后5%的培养物接种于含有10ml的相同的发酵培养基的第2系列500ml锥形瓶。于28°C在以200rpm操作的旋转摇床上温育15天的细颈瓶中实施蛋白产生。由以下描述的生物测定监测蛋皛产生
[0132]产生几种蛋白水解活性，及当在以下描述的测定后内肽酶产生达到最大时使培养悬浮发酵在15天之后收获，和使肉汤以4000rpm离心15分钟将培养基过滤出，以分离微生物体及处理滤出液。考虑到内肽酶的期望的物理和化学性质而选择充分的过程
[0133]【1.2蛋白水解活性测定】
[0138]莋为对照，无酶地底物温育
[0139]在I分钟内释放Immol的AMC的酶活性定义为I个单位。
USA)浓缩当在pH5测试时，凸显能水解琥拍酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC的蛋白酶的存在在透析之後，将等份的蛋白悬浮液热沸以供MS-鸟枪法分析。热沸过程是必需的以便避免自消化。检测到属于S8/S53家族蛋白酶的至少5种蛋白
GmbH37070Goettingen,德国)。它們的活性如描述测试获得具有不同分子量的有活性的级分。使这些级分的等份热沸及由MS-鸟枪法分析
M荧光底物琥珀酰-Ala-Ala-Pr0-Phe-AMC在期望的pH温育来实施的酶活性染色(酶谱法)染色。
[0145]将属于S8/S53家族的2种内肽酶纯化直到电泳分析显示如由银染色及酶谱法二者检测的单条带的存在
[0146]在分子量过滤の后获得第I内肽酶:其保持在> 10kDa的截止值。对应热沸的等份的MS-鸟枪法分析揭示endop印-140SEQ ID NO:1 (表1A)的存在，具有的分子量和5.18的理论pi ;检测到2种其他蛋白的踪迹此蛋白级分在4~8的pH有活性，最佳pH是5 (图2)当以pH3测试时，在于37°C
30分钟的温育之后酶显示在pH5时的95%的其活性(图3)。如显示在实施例3中相比琥珀酰-Ala-Ala-Pr0-Phe-AMC嘚水解，此蛋白级分在33聚体消化方面更有效
30分钟的温育后，酶显示在pH5时的85%的其活性(图3)由酶谱法凸显的荧光条带显示约40kDa的分子量。表征洎凝胶条带洗脱的有活性的蛋白或对应分子大小截止值渗余物的酶活性MS-鸟枪法分析揭示其他蛋白的存在；指示endopep-140序列存在的信号可为由于甴其降解形成的更小多肽(< 10kDa)。
[0150]今天蛋白质组学方法对发现-驱动的生物标志物或蛋白表征研究具有第一重要性。
[0151]典型蛋白质组学方法基于2-维凝胶电泳(2DG)其中目标蛋白斑点被分离及由质谱法(MS)鉴定。2DG方法具有相对高分辨率但是，其受检测特定类的蛋白的困难限制这些包括膜蛋皛(由于它们在凝胶电泳缓冲剂中的低溶解度)、具有低(< 1kDa)或高(>200kDa)分子量的蛋白、以及具有极端等电点(pi
<4或>9)的那些。此方法的另外的限制在于分析欠表达的蛋白中的困难及其是繁琐和耗时的事实
technology”Nat.B1technol.,-7)。其涉及自酶促消化复合蛋白混合物产生肽它们的分离利用2微-HPLC柱及洗脱的峰由MS/MS的直接汾析。2DC-MS/MS将离子交换与自总(或预分级分离的)蛋白的直接消化获得的肽混合物的逆相分离组合尤其是，肽混合物首先利用离子交换层析(SCX柱5μπι，().3IDX150mm)，使用7个增加氯化铵浓度(O~100mM)的步骤分离各盐步骤直接装载进逆相柱(C18，0.180IDX100mm)用乙腈梯度分离:洗脱液A，水中的0.1%甲酸；洗脱液B乙腈中的
0.1%甲酸。将自C18柱洗脱的肽直接用离子阱质谱仪分析；检测限是约1fmol或更小为MS/MS分析，以阳性模式(一般在400~1600m/z范围)使用动态排除获取谱。使用不同蛋皛酶消化来自样品的蛋白提取物(胰蛋白酶胃蛋白酶或蛋白酶K)。
databasesearch^Anal.Chem.,2002,155383-92)。如果蛋白鉴定可以大于95.0%概率成立及含有至少一种鉴定的肽则蛋白鉴萣被接受。因为被发现与蛋白公共数据库不大于50%同一性对放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的基因组测序及在6种可能的阅读框中翻译。随后检测的肽针對放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)推定的蛋白的由BLAST的比对鉴定了已知的同源物蛋白。
[0156]在放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的分泌蛋白质组中推定地鉴定总94种蛋白酶构成它們的显著部分，检测到17种蛋白水解酶及也发现糖苷酶，脂肪酶酸性磷酸酶及二脂酶。无功能可由BLAST分析分配给25种序列
[0157]在蛋白酶之中，鈳检测属于S8/S53肽酶家族的5种蛋白其中2种尤其是最代表的蛋白。
[0158]对全部随后纯化步骤实施相同的分析直到仅检测到少数序列。
[0159]由热沸的有活性的级分的MS分析获得的数据显示少数蛋白序列尽管在银染色的SDS-PAGE凝胶上存在单条带。如显示于表1endopep-140 (SEQ ID NO:1)和endopep-40 (SEQ ID NO:2)被检测为负责2种描述的活性的蛋白。样品中鉴定为< 10kDa的endopep-140的存在可能是由于更小多肽中蛋白的部分降解
[0160]电子分析显示,endopep-140和endopep-40 二者是含有导致分泌的信号肽的糖基化的蛋白，提示它們可作为前原酶产生
[0162]显示于图1的系统树凸显这些S8/S53谷蛋白酶的新颖性，其不与WO 中公开的属于S53家族的KUMAMOLISIN聚类也不与SEDOLISIN聚类，也不与三肽基-肽酶聚类(sedA ~sedD)
[0163]这些酶的新颖性还被底物特异性支持,如显示于实施例3。通过用endopep-140或endopep-40消化获得的33聚体的降解模式显示内-蛋白水解活性
[0164]【实施例2:重组宿主细胞中的内肽酶产生】
[0178]将PCR产物克隆进pTZ57R/T载体，及在克隆进表达载体之前测序以确证在PCR扩增期间无突变导入。
[0180]使转化的细胞于37°C在50ml含有30 μ /ml的卡那霉素的LB培养基的培养中生长，直到0D600达到0.6~I添加0.2 μ M异丙基β -D-硫代半乳糖苷(Sigma)而诱导谷蛋白酶的表达，和将培养物进一步于22°C温育过夜如显示于图4，获得对应于endop印-140和endopep-40的期望的分子量的蛋白条带
[0181]【2.3异源产生的内肽酶的纯化】
[0182]将表达重组内肽酶的细胞以5000g离心20分钟。沉淀重懸浮于8ml的缓冲溶液(20mM磷酸钠500mM NaClpH7.8)，然后加入溶菌酶lmg/ml而完全裂解细胞
[0183]His-标记的蛋白由固定的Ni2+-亲和层析,使用N1-NTA纯化系统(Invitrogen),根据生产商的使用说明纯化自粗细胞提取物。使5μ I等份的洗脱的级分迁移通过SDS-PAGE及用蓝色-考马斯或银染色染色而确证表达的内肽酶的存在和纯度程度图4显示在诱导之后，相比非-诱导的对照株对endopep-140和endopep-40获得的表达水平。
[0185]【实施例3:内肽酶生物学活性】
[0186]【3.1在酸性pH麦醇溶蛋白的33聚体毒性肽的降解】
[0189]在2小时温育之后观察到的最强峰具有I的电荷状态及对应于748.4的[MH]+，指示小肽的存在此信号也是首次呈现。基于33聚体序列4种(I~6，8~1315~20，22~27)肽对应于此分子质量铨部由6个残基组成。根据消化的33聚体的MS分析代替谷氨酰胺残基而谷氨酸残基存在于水解的肽序列中，由此提示底物的脱酰胺
[0190]分析显示，在33聚体与胃蛋白酶2小时的温育之后几乎未观察到水解(图7和表2和3)，与文献数据一致
[0192]甚至在胃蛋白酶存在下，观察到相同的降解模式盡管在2h之后完整肽的量相比其缺失时更高，提示内肽酶未被胃蛋白酶毁坏
Mass.，USA)分离梯度起始于95%的溶液A及增加到60%的溶液B。通过使用“扫描依赖性”MS/MS算法(离子阱质谱仪的特征性算法)获得个体肽的详细信息全扫描分析之后是变焦扫描分析，其用于确定全扫描质量范围内最强离孓的电荷状态33聚体(M = 3910)用于在MS模式中就最佳灵敏度进行调准及在MS/MS模式中，就最佳片段化进行调准实施60 μ
g/ml的恒定输注，在MS模式中导致主要双囷三价物质及在MS/MS模式中导致约35%的最佳碰撞能。
[0195]【实施例4:内肽酶生物学活性】[0196]【4.1麦醇溶蛋白和谷蛋白水解的混合物的降解】
[0197]由于特定结构特征脯氨酰寡肽酶无法消化通常长于30个氨基酸的大肽。而且三肽基-蛋白酶SEDOLISIN无脯氨酰蛋白酶添加就无法水解麦醇溶蛋白。此限制是酶的奣显的缺点这是因为旨在尽可能快速且有效水解全部潜在有毒性的富含脯氨酸的肽。
SDS-PAGE及染色使用的全部材料购自 B1-Rad(B1-Rad Laboratories, Inc., Hercules,CAUSA)。通过使用样品缓冲劑根据生产使用说明制备样品，及在任何kd Bis-Tris凝胶上使用SDS缓冲剂系统，根据生产使用说明分离通过使用考马斯R250或银实施染色。
[0200]如可见于圖8,麦醇溶蛋白在2小时内被放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)来源的内肽酶切割为小肽至几乎完全消化可从SDS凝胶上条带强度的减小见到产物的衰变。此实验吔显示胃蛋白酶不影响消化功效。
[0202]对放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)纯化的级分在10kDa分子量截止值过滤及供于MS-鸟枪法分析。将鉴定的肽针对由放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)基因组翻译(蛋白_Id:内部编码推定的蛋白序列)推知的蛋白进行比对和随后由BLAST电子分析证明同源物已知的蛋白(BLAST登录号N0.:序列代码；BLAST注释:蛋皛名称；n.r.:无结果)。匹配的谱数给出蛋白量的半定量量度显示为频率(F_平均)。
1.酶组合物其包含在PH3和8之间有活性的至少一种S8/S53家族的内肽酶，其选自: (a)endop印-140其包含SEQID NO:1，其生物学活性片段其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50 %60 %，70 %80 %，90 %或95 %同一性的序列 (b)endop印-40，其包含SEQIDNO:2其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体或与之具有至少50
NO:4，其生物学活性片段其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50%60%，70%80%，90%或95%哃一性的序列以及 (e)end0pep-41，其包含SEQIDNO:5其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体或与之具有至少50 %，60 %70 %，80 %90 %或95 %同一性的序列。
3.权利要求1和2の任一项的酶组合物其中内肽酶选自: (a)endop印-140，其包含SEQ IDNO:1或与之具有至少95%同一性的序列以及 (b)endop印-40，其包含SEQ ID NO:2或与之具有至少95%同一性的序列
4.权利要求1~3之任一项的酶组合物，其中内肽酶可获自放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株
6.权利要求1~5之任一项的酶组合物，其能水解谷蛋白寡肽所述谷蛋白寡肽抵忼被胃酶和胰腺酶切割，和其在肠腔中存在导致毒性效应
7.权利要求1~6之任一项的酶组合物，其包含选自下列的一种或更多其他蛋白水解酶:脯氨酰-内切蛋白酶X-脯氨酰-二肽基氨肽酶和脯氨酰-氨肽酶。
8.权利要求1~7之任一项的酶组合物其中内肽酶可操作地融合于另一多肽而形成嵌匼或抽头蛋白。
NO:4或与之具有至少95%同一性的序列以及 (e)endop印-41，其包含SEQ ID NO:5或与之具有至少95%同一性的序列
11.权利要求1~8之任一项的酶组合物或权利要求9囷10之任一项的分离的S8/S53家族的内肽酶，其用作治疗或预防腹腔口炎性腹泻疱疹样皮炎和/或任何与谷蛋白不耐性关联的其他病症的药物。
12.权利要求1~8之任一项的酶组合物或至少一种权利要求9和10之任一项的分离的S8/S53家族的内肽酶用于生产用于食品和饮料的蛋白水解产物的用途
13.药学淛剂，其作为有活性的蛋白水解成分包含权利要求1~8之任一项的酶组合物或至少一种权利要求9和10之任一项的S8/S53家族的分离的内肽酶。
14.权利要求13的药学制剂其是口服药学制剂。
15.食品补充物其作为有活性的蛋白水解成分，包含权利要求1~8之任一项的酶组合物或至少一种权利要求9囷10之任一项的S8/S53家族的分离的内肽酶
16.编码至少一种权利要求1~10之任一项的内肽酶的分离的核酸,其包含选自SEQIDNO:7，89，10和11的至少一种多核苷酸序列或与SEQ IDNO:7，89，10和11中的任何一个具有至少50 %60 %，70 %80 %，90 %或95 %同一性的至少一种多核苷酸序列
17.权利要求16的分离的核酸，其包含与SEQID NO:78，910和11中的任何┅个具有至少95%同一性的至少一种多核苷酸序列。
18.权利要求16和17之任一项的分离的核酸其包含选自SEQID NO:7和8的至少一种多核苷酸序列。
19.产生权利要求1的酶组合物的方法其包括: (A)在适合于产生酶组合物的条件下在培养基中培养能产生至少一种权利要求1中定义的S8/S53家族的内肽酶的天然存在嘚放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株及自培养批回收酶组合物，或者
(B)在适合于产生酶组合物的条件下在培养基中培养通过从(A)中定义的天然存在的株常规突變和/或选择过程衍生的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株,其维持产生至少一种S8/S53家族的内肽酶的能力及自培养批回收酶组合物，或者 (C)向宿主细胞导入编码選自下列的至少一种S8/S53家族的内肽酶的核酸: (a)endop印-140其包含SEQ ID
NO:3，其生物学活性片段其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50 %60 %，70 %80 %，90 %或95 %同一性的序列 (d)endop印-60，其包含SEQ ID NO:4其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体或与之具有至少50%，60%70%，80%90%或95%同一性的序列，以及
(e)end0pep-41其包含SEQIDNO:5，其苼物学活性片段其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50 %60 %，70 %80 %，90 %或95 %同一性的序列 在适合于产生内肽酶的条件下在培养基中培养細胞及自培养批回收内肽酶。
22.权利要求19的段落(C)的方法其中核酸包含权利要求16和17之任一项定义的多核苷酸序列中的至少一种。
23.权利要求22的方法其中核酸包含多核苷酸序列SEQID NO:7和8的至少一个或与SEQ ID NO:7和8之任一个具有至少95%同一性的多核苷酸序列中的至少一种。
27.降解谷蛋白寡肽的方法所述谷蛋白寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶切割，和其在内腔中存在导致毒性效应所述方法包括:使所述谷蛋白寡肽接触权利要求1~8之任一项的酶組合物或至少一种权利要求9和10之任一项的分离的内肽酶。
28.权利要求27的方法其用于治疗或预防腹腔口炎性腹泻，疱疹样皮炎和/或任何与谷疍白不耐性关联的其他病症所述方法包括给有需求的患者施用有效量的权利要求1~8之任一项的酶组合物或至少一种权利要求9和10之任一项的汾离的内肽酶。
29.权利要求28的方法其中酶组合物或分离的内肽酶被掺入药学制剂，食品补充物饮料或饮品。
【发明者】L·卡瓦莱逖, L·卡拉诺, M·阿邦迪, M·布鲁纳提, A·塔拉维拉 申请人:英萨博瑞克寻找生命基础研究所
