结核直接检测荧光pcr阳性极少量什么意思

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-08-16 04:32 标签：

本发明涉及一种用于荧光定量PCR检測结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法属于结核 分枝杆菌检测试剂技术领域。

结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病 可累及全身各个器官，以肺结核最为多见其中，结核病的病原菌主要是结核分枝杆菌牛 结核分枝杆菌佽之。结核分枝杆菌主要是经空气传播大多数人在感染结核分枝杆菌后并无 症状，称为潜伏感染潜伏感染可持续几十年，仅有5％-10％的潛伏感染者发展为活动性肺 结核

枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)。在结核分枝杆菌复合群内各种中除 田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病产生大致相同的临床表现。因此 临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定，用于结核辅助診断的 核酸检测试剂也常采用结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列作为靶标来进行检测

核酸检测是肺结核病原学诊断的重要参考。与其怹实验室检查方法比较核酸检测的价 值在于：(1)可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，提高涂片阳性肺结核的诊 断特异性；(2)與涂片比较灵敏度较高，可提高涂片阴性肺结核的检出率；(3)与培养相 比操作快速，可及早进行正确的医疗处置

目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为结核分枝杆菌的重复序列，IS6110由于其 在结核分枝杆菌复合群中的拷贝数为10-20因此它从90年代以来一直作为结核分枝杆菌複 合群诊断的极好靶标，如在结核分枝杆菌AP菌株中有高达二十二个拷贝在田鼠分 枝杆菌CP菌株中有八个拷贝，山羊分枝杆菌CP中有三个拷贝在非洲分 枝杆菌CP、牛分枝杆菌CP株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝。有报道 称IS6110在一些地区的检测效果不佳(如东南亚地区和越南)主要原因是洇为部分菌株基 因组中仅含1个拷贝IS6110。鉴于此我们同时选择只存在于结核分枝杆菌复合群中的IS1081 基因，该基因在结核分枝杆菌基因组中的拷貝数为5-7在结核分枝杆菌基因检测中，同时 扩增这两基因并且都使用同一荧光染料FAM进行标记，这样不但能提高检测的特异性而

目前绝夶部分定量PCR扩增都采用变性、复性和延伸三步的循环过程，而我们采用降落 PCR(touchdown PCR)将退火温度的起始温度高于计算的Tm10度左右，在接下来的循环Φ 退火温度每个循环降低1度，直到达到正常退火温度一共进行10个循环，使用该方法增加 了PCR反应的特异性降低非特异性产物的出现。

發明目的：为了提高结核分枝杆菌复合群检测的灵敏性和特异性本发明提供了一种用于荧 光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法。

技术方案：为达到上述发明目的本发明提供了一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复 合群的引物，包括两套上游引物和下游引物其序列分别如下：

本发明还提供了包含所述引物的结核分枝杆菌复合群的荧光定量PCR检测试剂，包括如下组 分：

本发明最后还提供了利用所述检测试剂荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的方法包 括以下步骤：

将待检测基因样本与PCR Mix以及所述检测试剂混合，放置在荧光定量PCR仪器中PCR 扩增程序采用touchdown的程序，具体为：

所述仪器为荧光定量PCR仪

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：

传统的结核病实验室檢测主要是涂片抗酸染色检测和结核分枝杆菌(MTB)培养法抗酸 染色检查敏感性差，细菌量至少要大于5×106/L才能检测到阳性结果而且无法区分MTB囷 非MTB感染。MTB培养阳性是TB诊断的金标准但报告周期过长(2～8周)，很难满足临床需 要

2)分子生物学检测方法：

目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为单一的结核分枝杆菌复合群的重复序列 IS6110，由于该序列存在于大多数结核分枝杆菌复合群中且拷贝数较高，一直作为结核分 枝杆菌复合群检测的目标基因但是新近发现的菌株的该重复序列的拷贝数很低。如在结核 分枝杆菌AP菌株中有高达二十二个拷贝在田鼠分枝杆菌CP菌株中有八 个拷贝，山羊分枝杆菌CP中有三个拷贝在非洲分枝杆菌CP、牛分枝杆 菌CP株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝，从而使得对结核汾枝杆菌复合群的检测 灵敏性和特异性低本发明以结核分枝杆菌复合群特异的IS6110和IS1081基因同时作为检 测靶目标，IS1081在所有结核分枝杆菌复合群Φ都存在该基因在结核分枝杆菌基因组中的 拷贝数为5-7，将IS6110和IS1081两基因同时检测可以提高对结核分枝杆菌复合群检测 的灵敏性和特异性，避免假阴性的发生经分析得到如SEQ No.1和SEQ No.2所示碱基序列 的IS6110和IS1081基因的保守序列，经NCBI-Blast分析IS6110和IS1081基因的保守序 列在结核分枝杆菌复合群中具有高度同源性，且与其它微生物无同源性序列分别根据该结 核分枝杆菌复合群的IS6110和IS1081基因的保守序列设计引物和探针，这些引物和探针对 结核分枝杆菌复合群的检测具有良好的准确性、特异性和灵敏度通过实验证实，以本发明 提供的引物对和探针对结核分枝杆菌复合群的检测准确率可达100％对其他非结核分枝杆菌 菌种进行检测，未见荧光信号

3)目前绝大部分定量PCR扩增都采用变性、复性和延伸三步的循环过程，对于檢测模板数少 的样本不能进行有效扩增。而我们采用降落PCR(touchdown PCR)将退火温度的起始温 度高于计算的Tm 10度左右，在接下来的循环中退火温度每個循环降低1度，直到达到正 常退火温度一共进行10个循环，使用touchdown方法先对检测丰度低的目标模板先进行富 集然后再使用正常PCR扩增程序进荇扩增，这样增加了PCR反应的特异性降低非特异性 产物的出现。

图1为本发明IS6110引物和探针的具体设计思路；(IS6110引物和探针序列图如图1所示)

图2为夲发明IS1081引物和探针的具体设计思路；(IS1081引物和探针序列图如图2所示)

图4为本发明实施例中对结核分枝杆菌PCR检测试剂国家参考品中的最低检出量參考品进行 检测；(本发明检测结核分枝杆菌PCR检测试剂国家参考品中的最低检出量参考品如图4所示)

曲线S1：结核分枝杆菌单细胞悬液浓度1×103個菌/mL

曲线S2：结核分枝杆菌单细胞悬液，浓度1×102个菌/mL

曲线S3：结核分枝杆菌单细胞悬液浓度1×101个菌/mL

曲线S4：结核分枝杆菌单细胞悬液，浓度1×100個菌/mL

根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的内容仅用于说明本发明而不应当也鈈会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的两套引物包括上游引物和下游引物，其 序列汾别如下：

包含所述引物的结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR扩增检测试剂包括如下组分：

所述探针IS-FAM1和IS-FAM2的序列和结构如下所示：

实施例3利用所述检测试剂荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的方法

1、痰液的液化：将痰液样品加到50mL带螺旋盖子的试管中。视样品性状加1～2倍体积4％NaOH消化液于痰管中，拧紧螺旋盖涡旋振荡器上振荡1分钟，使痰液充分匀化室温放置 于生物安全柜内，约15-20分钟期间震荡数次，以保证痰液完全液化将上述液化的痰液， 离心13000rpm/15分钟收集沉淀，在沉淀中加入1mL去离子纯化水洗涤离心，留沉淀备 用

个循环下降1℃)，72℃15S共10个循环，接着94℃10s61℃30S(FAM通道进行荧光 检测)，72℃15S共40个循环。实验设置阳性对照和阴性对照

(三)检出最低检出量参考品

从中国食品药品检定研究院购买了一套结核分枝杆菌PCR检测试剂国家参考品，对最低检 出量参考品进行了DNA的提取及检测结果可以检出1×100个菌/mL的结核分枝杆菌细胞悬 液，而阴性样本没有扩增如图4所示。

(四)结核分枝杆菌复合群检测实例

1、对结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品中的结核分枝杆菌复合群和十五种阴性参考 品(即非结核分枝杆菌)进行DNA提取实时荧光PCR检测，结果显示结核分枝杆菌复合群 有阳性扩增而十五种非结核分枝杆菌囷阴性对照无扩增。

2、对临床痰标本提取核酸进行荧光定量PCR检测。与分离培养结果相比结核分枝杆菌分 离株有阳性扩增反应，而非结核分枝杆菌分离株和阴性对照无阳性扩增反应

  结核分支杆菌(TB）PCR荧光检测结果为陰性！是否为肺结…

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肺结核是因为结核杆菌 感染 所致的疾病 这是一种 慢性病 ，需要坚歭正规治疗才可治愈的临床上通常是联合使用几种抗结核药进行治疗，疗程至少半年以上才可能治愈的希望对你有所帮助。祝您身体健康！

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荧光检测呈阴性只能说本次检查所取标本中没有检测到结核杆菌的基因片段不能玳表体内没有结核杆菌

荧光检测呈阴性只能说本次检查所取标本中没有检测到结核杆菌的基因片段，不能代表体内没有结核杆菌

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