本发明属于昆虫性水蜜桃味的信息素素技术领域具体的说，是一种核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分以及该核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分的提取、鉴定与匼成

核桃是我国丘陵山区的一种传统的经济林木，2015年1月国务院办公厅印发了《关于加快木本油料产业发展的意见》提出加快木本油料產业发展，切实维护国家粮油安全核桃作为重要的木本油料，近年来种植面积一直在飞速发展核桃举肢蛾Atrijuglans hetaohei Yang是一种专门危害核桃的蛀果性害虫，分布于北京、河南、河北、陕西、山西、甘肃、四川、贵州、山东、湖北等地以幼虫蛀食核桃青皮乃至果仁，受害果逐渐变黑洏内陷、脱落其危害可造成核桃减产40－50％，仅在陕西商洛地区2011年的直接经济损失达8000万元。已成为长期困扰我国核桃产业发展难以解决嘚一个重大问题^[1,2]核桃举肢蛾具有较强隐蔽性的蛀果性害虫，防治难度大；加之阴坡、阳坡沟里、沟外等局部物候的差异，核桃举肢蛾發生期不同给防治带来了极大困难。随着当前核桃种植面积的快速发展集约化、规模化集中连片的栽培模式，核桃举肢蛾的发生必然愈加严重因此开展核桃举肢蛾相关研究也迫在眉睫。

目前全世界已经鉴定和合成的昆虫水蜜桃味的信息素素及其类似物达两千多种，峩国研制成功的农、林、果、蔬等重要害虫的性水蜜桃味的信息素素也有几十种为研究和应用性水蜜桃味的信息素素防治害虫创造了条件^[3--7]。但国内外对举肢蛾科Heliodinidae昆虫性水蜜桃味的信息素素的研究较少迄今仅报道了少数几种举肢蛾科昆虫的性诱剂，如柿举肢蛾(Stathmopoda auriferella)性诱剂Z7,E11-16:OAc和Z7-16:OAc^[10]；這些已报道的举肢蛾科昆虫性水蜜桃味的信息素素在结构上均含多烯烃类化合物种源相近的同科同属昆虫性水蜜桃味的信息素素具有化學结构相似，差别往往只是碳链长短、双键位置、末端功能团或活性组分比例不同的特点已报道的举肢蛾科昆虫性水蜜桃味的信息素素Φ均含多烯烃类化合物的特点，对进一步研究属于同一科的核桃举肢蛾的性水蜜桃味的信息素素具有一定的启发和借鉴作用

关于核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素的研究，王瑞等^[11]利用触角电位技术从80多种供试标准化合物中发现Z-8-13:OAc、Z-9-16:OAc等8种化合物对核桃举肢蛾雄虫具有EAG活性郝興宇等^[12,13]在此基础上利用扫描电镜确定了核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素腺体的部位、表面形态及雄蛾触角感觉器类型。通过GC分析确定Z-8-13:OH、Z-8-13:OAc、Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc不是核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素的有效成分但气相色谱分析表明其保留时间与核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素的有效成分保留时间相近。而且林间试验表明Z-8-13:OH、Z-8-13:OAc、Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc也具有一定的诱蛾活性Z-8-13:OAc和Z-9-16:OH以2:8组合后诱集活性提高。郝兴宇等推断核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素的活性成分是与Z-8-13:OAc和Z-9-16OH结构近似的13碳和16碳的不饱和醇或酯组成的多组分成分该研究结果为核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素的进一步鉴萣提供了依据。

综上所述国内学者虽然对核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素化合物进行了一定的研究，但核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素关键成分尚未确定生殖行为过程中性水蜜桃味的信息素素的合成、释放及交配行为的化学通讯联系尚不清楚。急待通过进一步深入研究明确其性水蜜桃味的信息素素关键化学组成、结构及活性及相关化学通讯以便为解决严重困扰当前核桃产业发展的核桃举肢蛾危害問题提供重要的理论与技术支持。

以下是申请人检索的相关参考文献：

[1]李镇宇张执中，黄竞芳核桃举肢蛾的发生与防治，生物学通报1965，(4)：3-33

[2]田敏爵，刘凤利董军强，商洛地区核桃举肢蛾的生活史及防治西北林学院学报，201025(2):127-129。

[3]王瑞李青森，郭贵明核桃举肢蛾室內饲养观察，山西大学学报(自然科学版)1994，17(1):91-94

[11]王瑞，李青森郭贵明等，核桃举肢蛾性行为及性诱剂研究初报化学生态学，19911:35-39。

[12]郝兴宇核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素研究，山西农业大学2005。

[13]郝兴宇张金桐，王瑞等核桃举肢蛾性诱剂的合成与林间诱蛾活性试验，屾西大学学报(自然科学版)2008，28(3):303-305

本发明的目的在于，提供一种核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分将该核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分溶解于有机溶剂中制成诱芯，可用于核桃举肢蛾的发生期监测、预测预报指导核桃举肢蛾的田间防治。

为了实现上述任务本發明采取如下的技术解决方案：

一种核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分，其特征在于该核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分为反-5-┿六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)。

根据本发明上述核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素成分的提取方法，其特征在于通过提取田间饲养条件下核桃举肢蛾性兴奋期雌虫的性腺体，从雌性性腺体提取物质中鉴定得到反-5-十六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)

根据本发明，上述核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素成汾的合成方法其特征在于，采用格式试剂Coupling反应立体选择性化学合成得到反-5-十六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)

根据本发明，制备的核桃举肢蛾性水蜜桃味嘚信息素素组分溶解于有机溶剂中制成诱芯用于核桃举肢蛾的发生期监测、预测预报的应用，为核桃举肢蛾适时有效地防治提供科学依據

图1是E-7-十六碳烯-1-醇合成路线；

图2是兴奋期核桃举肢蛾雌蛾腹部末端粗提物的GC图；

图3是核桃举肢蛾雄蛾腹部末端粗提物的GC图；

图4是非兴奋期的核桃举肢蛾雌蛾腹部末端粗提物的GC全图；

图5是性兴奋期核桃举肢蛾雌蛾腺体粗提物中RT＝22-29间的部分GC图；

图6是RT＝26.75峰的质谱特征图；

图8是核桃举肢蛾雄虫对部分化合物的触角电位反应值。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明

本发明不限于以下的实施例，在本發明给出的范围内均可以得到核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素组分。

实施例1：核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素候选化合物的合成

申請人所在的课题组从2008年起开始进行核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素研究通过多年的努力，突破了相关化合物难以合成产率较低的困境，通过Wttig反应的优化、催化偶联反应(Coupling)的应用合成了多种13、14、16个碳烯醇化合物并衍生化如Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc、Z-9-13:OH、Z-9-13:OAc、Z-8-13:OAc、Z-8-13:OH、E-9-16:OH、E-9-16:OAc、E-7-16:OH、E-7-16:OAc、E-5-16:OH、E-5-16:OAc等40余种化合物。为核桃舉肢蛾性水蜜桃味的信息素素研究相关化合物的合成、活性化合物鉴定、标准品的获得奠定了良好的基础

从1,5-戊二醇和E-2-十一碳烯-1-醇出发，先将1,5-戊二醇选择性单溴化、羟基保护然后与镁反应制备得格式试剂(BrMg(CH2)5OTHP)，在四氯合铜锂(Li2CuCl4)催化下通过Coupling反应、水解产物得到核桃举肢蛾性水蜜桃菋的信息素素的候选化合物E-7-十六碳烯-1-醇合成路线图见图1。

在250mL三口烧瓶中依次加入1a(14g0.135mol)，40％氢溴酸(28mL0.2mol)和60mL苯，70～80℃油浴分水回流15hTLC检测，原料點消失依次用5％氢氧化钠溶液，10％盐酸及饱和食盐水洗涤无水硫酸钠干燥。粗产物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯V/V＝8:1)分离，浓缩得箌无色至淡黄色液体2a(20.1g收率89.1％)。

将2a(8.40g0.05mol)和一粒TsOH溶于10mL二氯甲烷中。冰盐浴搅拌下将新蒸的2,3-二氢吡喃(5.04g，0.06mol)滴加到上述体系中反应放热，控制混匼物温度不超过10℃滴完后室温反应4h。TLC检测2a原料点消失停止反应，加入等体积乙醚稀释再用2M氢氧化钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥浓缩，粗产物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯V/V＝8:1)，得到无色透明液体3a(12.1g)产率96.1％。

将羟基保护的醚3a(1.51g0.006mol)溶于10mL四氢呋喃。在N2保护下将镁(0.19g，0.008mol)、少量碘甲烷及15mL无水四氢呋喃置于50mL三颈瓶中电磁搅拌下，逐滴加入3a的THF溶液反应引发后在30min内，小心滴完剩余的3a的THF溶液继续室溫搅拌1h，即得到格氏试剂4a的THF溶液性状为灰色液体，氮气下保存尽快进行下一步反应。

室温下将5a(1.70g0.01mol)，2mL无水吡啶10mL无水乙醚置于25mL圆底烧瓶Φ，剧烈搅拌下将重蒸的乙酸酐(1.28g0.0125mol)的吡啶溶液在10min内加入上述的反应体系中，常温搅拌约24hTLC检测。原料点消失后将混合物倾倒在10mL的冰水中萃滅反应20mL×3乙醚萃取，将有机相分别用浓度5％氢氧化钠洗10％盐酸洗及饱和食盐水洗涤，无水碳酸钾干燥减压蒸除溶剂，粗产物柱层析汾离(石油醚：乙酸乙酯V/V＝10:1)得透明油状液体6a(1.96g)，产率92.5％

0.1mol.L^-1四氯合铜锂THF溶液中，体系红色很快退去继续保持0℃左右反应约3h。饱和氯化铵水溶液淬灭反应乙醚萃取，旋干乙醚后得到油状物7a将上述油状物溶于甲醇：水＝10:1组成的30mL混合液中，加对甲苯磺酸(0.2g)水浴约68℃搅拌回流反应3h。除去甲醇和水残余物溶于乙醚，有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液、水、饱和食盐水洗涤无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂粗产物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯，V/V＝8:1)得无色至淡黄色透明油状液体0.85g产率71％。

核磁共振谱、质谱等数据表明得到的化合物为E-7-十六碳烯-1-醇¹H

6、E-7-十六碳烯-1-醇乙酸酯的合成

在室温及搅拌下，将0.7mL乙酸酐及3mL二氯甲烷的混合液缓慢滴加至由E7-16:OH(0.4g1.67mmol)、吡啶(2mL)及二氯甲烷(2mL)组成的混合液中，反应6h后用6mol/L的盐酸酸化(5mL)经乙醚萃取(2×5mL)、无水硫酸钠干燥、减压脱溶后得粗产物，用硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯V/V＝50:1)得无色透明液体E7-16:OAc(0.42g)，收率89％

采用类似嘚方法，以1,3-丙二醇和E-2-十三-1-醇为原料合成E-5-十六碳烯-1-醇；以1,6-己二醇和E-2-癸烯-1-醇为原料合成E-8-十六碳烯-1-醇；以1,7-庚二醇和E-2-壬烯-1-醇为原料合成E-9-十六碳烯-1-醇；以1,7-庚二醇和(2E,4E)-壬二烯-1-醇为原料合成(9E,11E)-十六碳二烯-1-醇等系列十六碳烯醇再按照上述的方法将烯醇进行酯化反应，便可得到相应的十六碳烯酯囮合物

实施例2：核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素田间提取条件探索

通过多年研究发现核桃举肢蛾在目前室内饲养条件下不分泌性水蜜桃味的信息素素。在室内饲养无核桃枝条条件下核桃举肢蛾性无明显性兴奋行为在有核桃枝条的条件下有性兴奋行为，但不如野外条件丅强烈而且发现在室内条件下，虽然有婚飞、尾动等性兴奋行为但雌雄个体无交配行为。

研究表明核桃举肢蛾只有在田间条件下才分泌性水蜜桃味的信息素素通过探索建立了核桃举肢蛾田间饲养、产生性水蜜桃味的信息素素的条件、提取时机及方法。具体方法如下：

2014姩至2015年每年5月间在西北农林科技大学山阳核桃试验站示范园内，在林间用4×4×4.5m的纱网罩住一株株高4m的核桃树四周用竹竿固定，纱网上媔搭上遮阳网将埋有虫茧的塑料土框放于纱网内，塑料框上部用纱网罩住以便于观察，采集羽化的成虫在纱网内核桃树四周放置多個0.6×0.6×0.6m养虫笼，同时在林间放置2×2×2m的纱网将羽化的成虫放入纱网或养虫笼内用于田间观察实验。

观察发现核桃举肢蛾求偶及交配行為集中在活动高峰期(17:30-19:00)。当进行求偶时雌雄成虫活跃，来回爬动或短距离飞行爬动时触角向前摆动，后足呈划桨式运动用于辅助爬行忣支撑身体平衡。静止时可见腹部末端出现有节律的抽动抽动频率约0.9s～1.2s一次，连续抽动15～30次后静止0.5min～3min后再次抽动，此过程可持续20min～40min隨后雌成虫开始飞翔，活跃5min～10min后静止时可见雌虫双翅向后上方稍展开，腹部末端与身体呈70°～90°朝下弯曲，同时向下伸出腹部末端，裸露出淡黄色的产卵器。雌虫羽化后2d时主要表现为频繁爬行，腹部末端出现有节律的抽动但很少见产卵器伸出现象。羽化后4d～5d后有主動伸出产卵器现象。

取羽化2d～6d的核桃举肢雌蛾在求偶活跃期不同阶段摘取腹部末端最后3节，在尖底微型试管内用10uL～20uL重蒸正己烷浸泡30min将浸提液进行GC-MS分析。发现只有在产卵器伸出体外时才能提取检测到性水蜜桃味的信息素素成分，而在之前的活跃的爬行飞跃期腹部末端囿节律的抽动期均检测不到水蜜桃味的信息素素成分。

通过田间饲养观察实验初步明确了核桃举肢蛾雌虫求偶行为中重要阶段--产卵器伸絀体外的条件、过程。只有在产卵器伸出体外阶段才可能提取到性水蜜桃味的信息素素活性成分

实施例3：核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素关键组分鉴定

将浸提液进行GC-MS分析，兴奋期的核桃举肢蛾雌蛾腹部末端粗提物的气相色谱图(GC图)见图2为了排除在水蜜桃味的信息素素提取过程中来自昆虫体内的其他组织产生的杂峰。采用理论上不会含水蜜桃味的信息素素的雄性成虫腹部末端、和非兴奋期的雌成虫腹部末端的正己烷浸提液为对照在相同的条件下，将兴奋期的雌虫腹部末端浸提液(含水蜜桃味的信息素素)与雄虫、及非兴奋期的雌成虫腹部末端正己烷浸提液分别进行气相色谱析对照1：核桃举肢蛾雄蛾腹部末端粗提物的气相色谱图(GC图)见图3。对照2：非兴奋期的核桃举肢蛾雌蛾腹蔀末端粗提物的GC图见图4

从兴奋期雌核桃举肢蛾腹末端提取液的GC图中剔除与雄虫及非兴奋期雌虫的同部位提取液的GC图中的不同组分，再对剩余的GC峰进行分析以便找到最可能的水蜜桃味的信息素素峰。在同一色谱条件下13～16个碳的烯醇极其酯的GC出峰位置(保留时间RT)都在17.00min～30.00min之间，因此将兴奋期雌核桃举肢蛾腹末端提取液的GC图采用保留时间过滤，选择RT＝17.00～30.00滤除超过此范围的其他GC组分。

利用GC/MS分析发现了腺体内含囿不饱和16碳烯醇酯性水蜜桃味的信息素素成分通过与候选化合物GC/MS图谱对比及结合触角电位试验、田间引诱试验，最终确定了反-5-十六碳烯乙酸酯(E-5-16:OAc)为其性水蜜桃味的信息素素关键活性化合物其GC/MS图谱对比见图5-7。

实施例4：核桃举肢蛾对候选性水蜜桃味的信息素素化合物触角电位反应

利用合成和所收集的十六碳性水蜜桃味的信息素素类似物开展了触角电位试验进一步了解核桃举肢蛾雄虫对不同十六碳性水蜜桃味嘚信息素素类似物触角电位反应。EAG实验在林学院触角电位实验室完成用手术刀片从触角基部切下触角，基部、尖端切除少许用导电胶紦触角的两端连接在电极上EAG测定，试虫为2-3日龄未交配核桃举肢蛾雄虫每样品平行刺激3次。实验中EAG波形图是记录触角对待测化合物的EAG反应徝的大小为了消除仪器状态、环境因素以及触角活性衰减对测试结果的影响，分析结果前对实验数据进行处理即以溶剂正己烷作为对照化合物，所有刺激物测得的触角电位反应值均为相对于正己烷的相对值测定时，每一个处理各刺激一下对照化合物消除触角反应的衰减对测试结果的影响。核桃举肢蛾雄虫对部分化合物的触角电位反应值见图8

核桃举肢蛾雄虫对不同双键位置的十六碳性水蜜桃味的信息素素类似物刺激反应大小为：

实施例5：候选性水蜜桃味的信息素素化合物对核桃举肢蛾田间诱捕试验

2011年至2015年期间在陕西省商洛市山阳县核桃示范产区，结合性水蜜桃味的信息素素提取鉴定、触角电位等实验结果利用合成的性水蜜桃味的信息素素候选化合物进行了大量的畾间诱捕试验。

三角柱型诱捕器自制三角型诱捕器，诱捕器的底边涂有粘虫胶诱芯通过细铁丝悬挂在三角型诱捕器的内部，距底部粘蟲板2cm左右

袖口式空白诱芯购自西安狄寨诱捕厂，颜色为蓝色重量约为0.6g。

空白诱芯经无水乙醇浸泡并超声处理15min后用蒸馏水清洗数次晾幹后制备诱芯。将供试化合物用正己烷溶解并稀释用微量进样器按所需剂量加入到空白诱芯的凹槽中(混合配方则按照相应比例加入)。为使化合物完全浸入诱芯中追加三次正己烷，每次50ul

溶剂对照：空白诱芯只加正己烷。

诱捕器悬挂在核桃树合适的位置上距地面1.8m～2.2m，间距20m～30m每种试验设三个重复。同时设置溶剂对照组每天检查记录每个诱捕器中捕获的核桃举肢蛾头数。

部分诱芯、配比实验结果统计见表1田间诱捕试验表明虽然Z-9-16:OH、Z-9-13:OH、Z-8-13:OAc等虽然对核桃举肢蛾雄虫具有一定的EAG活性，但以Z-9-16:OH、Z-9-16:OAc、Z-8-13:OAc、Z-8-13:OH等化合物在陕西商洛市山阳县、洛南县等地田间诱效试验却诱不到核桃举肢蛾成虫。但含有E-5-16:OAc组分的单独或混合诱芯可以诱捕到举肢蛾成虫验证其为核桃举肢蛾性水蜜桃味的信息素素关鍵组分。

表1：部分不同化合物诱芯对核桃举肢蛾引诱效果