如果从大街上随便找两个人比较他们的DNA,它们的组成将有99.9%相同再打个比方,也就是说在DNA中的1000个堿基中,将有999个完全一致只有1个不同。这个不同的碱基位点就叫做SNPs。它让我们与众不同
二、SNPs的研究意义
具有已知性、可遗传性、可檢测性,用于疾病基因的定位、克隆和鉴定
研究SNPs 本身对机体的影响,尤其是疾病的易感性、个性化医疗
三、SNPs检测方法的分类
3、引物延伸:MALDI-Tof,dHPLC(变性高效液相色谱技术)
5、溶解曲线:HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)
1、测序方法------ 一般测序和焦磷酸测序
序列比对-- 引物设计-- DNA 提取-- PCR - 割胶純化-- 直接测序或装克隆测序
SNP 分析金标准,能发现已知SNP也能发现未知SNP。
每个样本的每个位点均需要经PCR 扩增跑胶,然后切胶纯化再测序。步骤多而分散成本较高,工作量大周期长,价格昂贵不适合大样本多位点检测。
2).对PCR 产物进行纯化(去除引物和dNTP)
4).延伸产物检測(放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等)
类似普通测序但10 个位点PCR 产物哃时引物延伸,通量增加
前处理等同普通测序:每个样品的每个位通过点都需要PCR预先扩增,跑胶割胶,DNA 纯化不同是10 个位点可以同时測序,提高了测序效率但对延伸引物要求极高,如每个引物有4-6 个碱基差异不能有互补区段,还要相同条件延伸除厂家已经验证的少數位点外,很难自己设计针对新位点的检测多个分散步骤,费钱费时易出错。
3、测序方法------费用成本组成:
? 基因组DNA提取费用
? 引物设計及合成费用
? PCR产物纯化费用
准确度高适合样本多、位点数量少的检测。
价格昂贵(探针合成费用高)仅检测已知SNP 位点,不能同时发現未知SNP
? 荧光探针合成费(昂贵)
高通量,适用于全基因组SNP 扫描适用于少样本、多(全)SNP 位点筛查;
准确度偏低,需要第二种方法验證;
只能识别已知SNP 位点;
不适宜多样本、少数SNP 位点的检测;
① 人类基因组DNA 的制备;
③ PCR 产物的纯化;
④ 等位基因特异性引物延伸反应;
⑤ 等位基因特异性引物延伸反应产物的纯化;
快捷、所需样标本量极少
前处理工艺复杂,包括一次PCR、一次特异引物延伸、两次纯化要求高,必须去除样品中的干扰性离子(钠钾),方能
适宜于已经优化的特定SNP 检测不适宜该服务商未做过的新SNP 检测。
流程:DNA 提取- PCR 扩增-变性后緩慢复性-检测以及分析
优点:快速、低成本、高灵敏
可判断有否突变不能确定SNP 的位置和类型,需用标准样品或结合测序验证
只能检测雜合突变是DHPLC 的主要不足之处。
在SNP 筛查的检测通量、灵敏度与成本等方面与最新的
HRM 技术相比都明显落后
dHPLC检测的成本构成:
高通量、简单、赽速、省钱、高灵敏度;
闭管检测,避免污染造成的假阳性;
可检测已知和未知SNP;<400bp扩增产物内SNP灵敏度和精确度100%。
与传统的扩增后需借助額外的仪器进行凝胶电泳的非均一性的突变检测(例如dHPLC)相比HRM提供了更高特异性和灵敏度的检测,同时允许了更高的样本检测通量大夶降低了成本。
? 荧光染料Evagreen费用(较低)
唯一真正实现高通量的SNP检测方法,人工成本最低;
唯一闭管操作步骤最少,可靠性极高
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