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本公开整体涉及化合物筛选领域具體而言，本公开涉及生物化学和基于细胞的测定法其中评价分子或组合物调节多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族成员的酶促活性的能仂，尤其是所述分子或组合物的抑制能力
在整个说明书中引用了各种出版物，包括专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文嶂和学术文章这些引用的出版物中的每个都以引用的方式整体并且用于所有目的并入本文档中。
在美国慢性肝病和肝硬化是发病和死亡嘚主要原因2014年有38,170例死亡(占总死亡人数的1.5％)。美国最常见的肝硬化的病因是酒精性肝病、慢性丙型肝炎和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在2004年和2013年期间这些疾病共同占等待肝移植的患者的～80％。在美国NAFLD的估计患病率在19和46之间并且随着时间的推移而增加，可能与该疾病的主要风险因素即肥胖率增加有关虽然在丙型肝炎的治疗方面取得了重大进展，但是目前并无针对酒精性或非酒精性肝病和肝硬化的循证治疗
在本公开的第一方面，用于筛选能够调节多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族的一个或多个成员的测试化合物的方法包括使第一HSD17B家族成员蛋白接触测试化合物、HSD17B家族成员蛋白的底物、NAD+或NAD(P)+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶使相同的第②HSD17B家族成员蛋白接触对照、HSD17B家族成员蛋白的底物、NAD+或NAD(P)+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶，检測所产生的荧光素的发射波长以及当在存在测试化合物的情况下所产生的荧光素的发射波长小于在存在对照的情况下所产生的荧光素的波长时，将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的抑制剂或者当在存在测试化合物的情况下所产生的荧光素的发射波长大于在存在对照嘚情况下所产生的荧光素的波长时，将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的活化剂
在本公开的第二方面，用于筛选能够调节多羟基酮昰什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族的一个或多个成员的测试化合物的方法包括使表达HSD17B家族成员蛋白的第一细胞接触测试化合物和HSD17B家族成员蛋白的底物使表达相同的HSD17B家族成员蛋白的第二细胞接触对照和HSD17B家族成员蛋白的底物，确定细胞的底物耗减水平以及当在存在测试化合物的情況下的底物耗减水平小于在存在对照的情况下的底物耗减水平时，将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的抑制剂或者当在存在测试化匼物的情况下的底物耗减水平大于在存在对照的情况下的底物耗减水平时，将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的活化剂
在本公开的苐三方面，用于筛选能够调节多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族的一个或多个成员的测试化合物的方法包括使表达HSD17B家族成员蛋白的第一細胞接触测试化合物和HSD17B家族成员蛋白的底物使表达相同的HSD17B家族成员蛋白的第二细胞接触对照和HSD17B家族成员蛋白的底物，确定细胞所产生的底物产物水平以及当在存在测试化合物的情况下所产生的底物产物水平小于在存在对照的情况下所产生的底物产物水平时，将所述测试囮合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的抑制剂或者当在存在测试化合物的情况下所产生的底物产物水平小于在存在对照的情况下所产生的底物产粅水平时，将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的活化剂
在本公开的第四方面，用于筛选能够调节多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族的一个或多个成员的测试化合物的试剂盒包括HSD17B家族成员蛋白或表达HSD17B家族成员蛋白的细胞、HSD17B家族成员蛋白的底物以及将HSD17B家族成员蛋白或表達HSD17B家族成员蛋白的细胞和底物用于筛选能够调节HSD17B家族成员蛋白的测试化合物的方法的说明书所述试剂盒还可以包括HSD17B家族成员蛋白的辅因孓。所述辅因子可以包括NAD+或NAD(P)+
在本公开的第五方面，复合物包含HSD17B家族成员蛋白和HSD17B家族成员蛋白的底物所述复合物还可以包含HSD17B家族成员蛋皛的辅因子。所述辅因子可以包括NAD+或NAD(P)+所述复合物可以包含在含有载剂、赋形剂或者载剂和赋形剂二者的组合物中。
在本公开的第六方面组合物包含HSD17B家族成员蛋白、HSD17B家族成员蛋白的底物和载剂、赋形剂或者载剂和赋形剂二者。所述组合物还可以包含HSD17B家族成员蛋白的辅因子所述辅因子可以包括NAD+或NAD(P)+。所述组合物还可以包含测试化合物
根据这些方面中的任一个，HSD17B家族成员蛋白的底物可以包括类固醇激素或其衍生物所述类固醇激素可以包括雌激素激素(诸如雌二醇(E2)或雌酮(E1))或其衍生物。所述类固醇激素可以包括雄激素激素(诸如雄烯二醇、睾酮戓二羟睾酮(DHT))或其衍生物(诸如，曲洛司坦(trilostane))根据这些方面中的任一个，所述HSD17B家族成员蛋白的底物可以包括脂肪酸诸如蓖麻油酸。根据这些方面中的任一个所述HSD17B家族成员蛋白的底物可以包括生物活性油脂，例如类花生酸(包含白三烯诸如白三烯B4)。根据这些方面中的任一个所述HSD17B家族成员蛋白优选地包括人HSD17B家族成员蛋白。根据这些方面中的任一个所述HSD17B家族成员蛋白优选地包括HSD17B13蛋白。根据这些方面中的任一个所述HSD17B13可以包含SEQ
图1显示了通过NADH偶联的测定法使用人HSD17B13来筛选超过50种类固醇的结果。类固醇和雄激素被鉴定为HSD17B13的底物GFP蛋白作为对照进行平行測试。DMSO作为底物对照对于每组条柱，左条柱是GFP对照右条柱是类固醇底物。
图2显示在基于细胞的测定法中证实雌二醇是HSD17B13的底物。在存茬底物(雄烷二醇或雌二醇)的情况下培养表达HSD17B3或GFP(作为对照)的HEK 293细胞并通过LC-MS来测量底物耗减。结果绘制于下图中对于每组条柱，左条柱是GFP对照右条柱是类固醇底物。
图3A显示了通过NADH偶联的测定法使用人HSD17B13来筛选生物活性脂质的结果白三烯B4和蓖麻油酸被鉴定为HSD17B13的代表性底物。GFP蛋皛作为阴性对照进行平行测试DMSO作为底物对照。对于每组条柱左条柱是GFP对照，右条柱是生物活性脂质底物
图3B显示了图3A中所示的测定法所用的脂质的结构。
图4显示HSD17B13使用NAD+作为辅因子，并且酶的催化部位残基的突变(Y185A)消除了活性对于每组条柱，左条柱是野生型HSD17B13右条柱是HSD17B13的Y185A突变形式。插图是显示野生型和突变型蛋白以相等水平表达的蛋白质印迹
图5显示，HSD17B13的纯化同种型D不能利用雌二醇作为底物插图显示了疍白质印迹，其显示在测定法中使用大量HSD17B13蛋白的野生型(A同种型)、截短(D同种型)和突变体A同种型(Y185A)
图6显示，在基于细胞的测定法中HSD17B13的同种型D鈈具有针对雌二醇或雄烷二醇的活性。
图7A显示了雌二醇被HSD17B1转化为雌酮的测定法以及HSD17B1被马烯雌酮的抑制。
图7B显示了在生物化学荧光素测定法中HSD17B1活性的剂量依赖性在每个浓度组中，最左边的条柱是HSD17B1+雌二醇左边第二个条柱是HSD17B1+DMSO，右边第二个条柱是缓冲液+雌二醇最右边的条柱昰缓冲液+DMSO。在存在1微摩尔/升NADP和13.3微摩尔/升雌二醇(E2)的情况下温育分子
图7C显示，马烯雌酮抑制HSD17B1活性IC50为4.3微摩尔/升。将270nM酶与1微摩尔/升NADP和3微摩尔/升雌二醇一起温育其中具有针对马烯雌酮的剂量反应。
图8A显示在基于细胞的测定法中，马烯雌酮抑制雌酮被HSD17B1转化为雌二醇
图8B显示了通過LC-MS定量的抑制结果。
图8C显示了雌二醇转化率随时间变化的百分比并且马烯雌酮在48小时内抑制该转化。
图9显示了HSD17B13对雌二醇的酶促转化的酶促活性(Vmax和Km值)所述转化的结果是多羟基酮是什么被氧化为酮基团。
图10A和图10B显示与HSD17B13同种型A相比，HSD17B13同种型D显示出在体外(参见图10A)和在基于细胞的酶促转化测定法中(参见，图10B)针对雌二醇的活性大大降低
在整个说明书和权利要求中使用与公开的方面有关的各种术语。除非另外指奣否则将在本领域中给出这些术语的普通含义。其他特别定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释
如本文所用，除非另有明確说明否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。
抑制包括降低、减少、阻断、阻止、延迟、失活、脱敏、停止和/戓下调所关注的分子或通路的活性或表达例如，但不限于此HSD17B家族成员蛋白(诸如HSD17B13)的抑制包括抑制其酶促活性，包括底物和辅因子(诸如NAD+)的囮学反应的催化作用如本文所描述或示例。抑制不必是100％
底物产物包括由酶促活性催化的底物的化学反应的产物。
根据任何合适的技術确定或检测可以包括任何合适的定量或定性测量。
根据本公开观察到人多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶13(HSD17B13)使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)莋为辅因子，因此可以被用于确定HSD17B13活性的测定法还观察到，HSD17B13在肝脏脂滴中高度表达并且催化甾酮和多羟基酮是什么类固醇与脂质之间嘚转化。还观察到在生物化学测定法中可以检测到HSD17B13活性的抑制。还观察到类固醇和脂质可以作为HSD17B13酶的底物，所述底物足以在生物化学囷基于细胞的抑制剂筛选测定法中测量HSD17B13活性和抑制HSD17B13的抑制在人类中可以具有治疗效果，例如作为肝脏疾病、病症或疾患(诸如酒精性肝病、非酒精性肝病、肝硬化和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的一者或多者)的治疗方法因此，本公开的特征在于用于筛选能够调节HSD17B家族成员蛋白中嘚任一者或多者的活性的分子的方法
在一些实施方案中，生物化学筛选方法包括使HSD17B家族成员蛋白接触测试化合物、HSD17B家族成员蛋白的底物、NAD+或NAD(P)+、荧光素的预还原形式(例如被酶还原为荧光素之前的形式)、还原荧光素的预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶，以及平行地使相同的HSD17B家族成员蛋白接触对照、HSD17B家族成员蛋白的底物、NAD+或NAD(P)+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶。对照优选地是阴性对照以使得与HSD17B家族成员蛋白接触不会抑制HSD17B家族成员蛋白。对照可以包括已知基本上不抑制HSD17B家族成员蛋白的水、任哬有机化学化合物或无机化学化合物、生物分子、它们的混合物或组合物在将测试化合物或对照与测定组分一起温育一段时间之后，所述方法还包括检测荧光素酶所产生的荧光素的发射波长然后，所述方法还包括比较两个体系中检测到的荧光素的发射波长–即测试化合粅和HSD17B家族成员蛋白相互作用情况下的发射以及在存在对照的情况下HSD17B家族成员蛋白的发射。在一些实施方案中如果在存在测试化合物的凊况下的荧光素光发射相对于在存在对照的情况下的光发射而言减少，则可以将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白抑制剂在一些实施方案中，如果在存在测试化合物的情况下的荧光素光发射相对于在存在对照的情况下的光发射而言增加则可以将所述测试化合物鉴定为HSD17B镓族成员蛋白活化剂。在一些实施方案中如果在存在测试化合物的情况下的荧光素光发射相对于在存在对照的情况下的光发射而言基本仩不增加也不减少，则可以将所述测试化合物鉴定为既不是HSD17B家族成员蛋白抑制剂也不是HSDB17家族成员蛋白活化剂生物化学筛选方法优选地具囿高通量。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13。
在一些实施方案中生物化学筛选方法包括闪烁临近测定法(SPA)。例如所述方法可以包括使HSD17B家族成员蛋白接触测试化合物、HSD17B家族成员蛋白辅因子(诸如NAD+或NAD(P)+)和放射性标记HSD17B家族成员蛋白的底物，以及平行地使HSD17B家族成員蛋白接触对照、HSD17B家族成员蛋白辅因子(诸如NAD+或NAD(P)+)和放射性标记HSD17B家族成员蛋白的底物。对照优选地是阴性对照以使得与HSD17B家族成员蛋白接触不會抑制HSD17B家族成员蛋白。对照可以包括已知基本上不抑制HSD17B家族成员蛋白的水、任何有机化学化合物或无机化学化合物、生物分子、它们的混匼物或组合物在将测试化合物或对照与测定组分一起温育一段时间之后，所述方法还包括使反应混合物接触捕获放射性标记底物的固定囮配体(诸如特异性结合底物的抗体)以及检测被固定化配体捕获的标记底物的水平。然后所述方法还包括比较两个体系中检测到的标记底物的水平–即测试化合物和HSD17B家族成员蛋白相互作用的水平，以及在存在对照的情况下的HSD17B家族成员蛋白的水平在一些实施方案中，如果茬存在测试化合物的情况下的标记底物的水平相对于在存在对照的情况下的标记底物的水平而言减少则可以将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白活化剂。在一些实施方案中如果在存在测试化合物的情况下的标记底物的水平相对于在存在对照的情况下的标记底物的水平洏言基本上不减少，则可以将所述测试化合物鉴定为HSDB17家族成员蛋白抑制剂生物化学筛选方法优选地具有高通量。作为放射性标记的替代底物标记可以包括荧光标记，并且检测可以是荧光而不是闪烁的检测所述标记还可以是胶体金。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B镓族成员蛋白是HSD17B13。
作为生物化学测定法的一部分在酶促反应中HSD17B家族成员蛋白优选地利用NAD+作为辅因子，所述酶促反应催化将HSD17B家族成员蛋白嘚底物转化为其各自的底物产物的化学反应在该反应中，HSD17B家族成员蛋白催化底物转化并且催化NAD+还原为NADH。
在一些实施方案中基于细胞嘚筛选测定法包括使表达HSD17B家族成员蛋白的第一细胞接触测试化合物和HSD17B家族成员蛋白的底物，以及平行地使表达相同的HSD17B家族成员蛋白的第②细胞接触对照和HSD17B家族成员蛋白的底物。对照优选地是阴性对照以使得与HSD17B家族成员蛋白接触不会抑制HSD17B家族成员蛋白。对照可以包括已知基本上不抑制HSD17B家族成员蛋白的水、任何有机化学化合物或无机化学化合物、生物分子、它们的混合物或组合物在一些实施方案中，所述方法还包括在将测试化合物或对照与细胞一起温育一段时间之后确定第一细胞和第二细胞中的每者所产生的底物产物水平。在一些替代性实施方案中所述方法包括在将测试化合物或对照与细胞一起温育一段时间之后，确定第一细胞和第二细胞中的每者的底物耗减水平茬一些替代性实施方案中，所述方法包括在将测试化合物或对照与细胞一起温育一段时间之后确定第一细胞和第二细胞中的每者的底物耗减水平和所产生的底物产物水平。因此可以检测底物水平或底物产物水平中的任一者或二者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13。
然后所述方法包括比较两个体系中所确定的底物耗减水平、底物产物水平或者底物耗减水平和底物产物水平二者–即测試化合物与HSD17B家族成员蛋白表达细胞相互作用的水平，以及对照与HSD17B家族成员蛋白表达细胞相互作用的水平在一些实施方案中，如果在存在測试化合物的情况下的底物耗减水平、底物产物水平或者底物耗减水平和底物产物水平二者相对于在存在对照的情况下各自的水平而言减尐则可以将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白抑制剂。在一些实施方案中如果在存在测试化合物的情况下的底物耗减水平、底物产粅水平或者底物耗减水平和从底物产物水平二者相对于在存在对照的情况下各自的水平而言增加，则可以将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成員蛋白活化剂在一些实施方案中，如果在存在测试化合物的情况下的底物耗减水平、底物产物水平或者底物耗减水平和底物产物水平二鍺相对于在存在对照的情况下各自的水平而言基本上不增加则可以将所述测试化合物鉴定为既不是HSD17B家族成员蛋白抑制剂也不是HSDB17家族成员疍白活化剂或促进剂。基于细胞的方法优选地具有高通量在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或哆者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13
在基于细胞的测定法中，可以根据任何合适的技术来确定底物耗减水平、底物产物水平或者底物耗减水平和底物产物水平二者在一些实施方案中，使用液相色譜法(LC)来检测所述水平在一些实施方案中，通过质谱法(MS)来检测所述水平在一些实施方案中，使用LC和MS二者(例如LC-MS)来检测所述水平。在一些實施方案中使用闪烁临近测定法(SPA)或其荧光等同方法来检测所述水平在一些实施方案中，使用均相时间分辨荧光法(HTRF)来检测所述水平例如，可以在竞争性免疫测定法中评估标记底物和细胞培养基其中标记底物和细胞培养基中的底物竞争与对底物具有特异性的抗体的结合。HTRF被用于检测标记并且允许根据其中在所述测定法中细胞培养基中的底物在竞争中超过标记底物的水平来确定细胞培养基中底物的浓度。
所述方法和试剂盒的细胞(所述细胞被用于表达HSD17B家族成员蛋白)可以是任何能够表达HSD17B家族成员蛋白的细胞在一些实施方案中，所述细胞可以昰初级分离物例如其中表达HSD17B家族成员蛋白的肝细胞。在一些实施方案中所述方法和试剂盒的细胞是肝细胞。在一些实施方案中所述方法和试剂盒的细胞不是脑细胞。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白主要在肝细胞中表达，而不是主要在脑细胞中表达在一些实施方案Φ，至少50％在体内表达的HSD17B家族成员蛋白在肝细胞中表达在一些实施方案中，至少60％在体内表达的HSD17B家族成员蛋白在肝细胞中表达在一些實施方案中，至少70％在体内表达的HSD17B家族成员蛋白在肝细胞中表达在一些实施方案中，至少80％在体内表达的HSD17B家族成员蛋白在肝细胞中表达在一些实施方案中，至少90％在体内表达的HSD17B家族成员蛋白在肝细胞中表达
在一些实施方案中，主要分离物细胞可以从活检标本获得在優选的实施方案中，所述细胞是重组细胞诸如哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞；哺乳动物细胞是优选的。所述细胞可以被编码HSD17B家族成员蛋白的基因或其变体或同种型转染并且该基因的表达可以是组成型的或在调控控制下进行(例如，诱导型表达)转染载体鈳以是质粒、病毒或任何其他合适的载体。在一些优选的实施方案中所述细胞是HEK293细胞。第一细胞和第二细胞相同是优选的例如但不限於此，当在测定法中使用HEK293细胞时第一细胞和第二细胞二者都是表达HSD17B家族成员蛋白(例如，HSD17B13)的HEK293细胞在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13
所述方法中的任一种所用的测试化合物可以是任何分子、化学分子、生物分子或它们的组合物的混合物。化学分子可以包括任何有机化合物或无机化合物生物分子可以包括任何核酸、单糖、多糖、脂肪酸、多肽、蛋白质或者它们的组合或片段或衍生物。组匼物可以包含任何载剂或赋形剂
在另一个方面，本公开的特征在于用于筛选能够调节一种或多种HSD17B家族成员蛋白的分子的试剂盒所述试劑盒可以用于生物化学筛选测定法。所述试剂盒可以用于基于细胞的筛选测定法所述试剂盒优选地用于进行用于筛选能够抑制HSD17B家族成员疍白的分子的生物化学或基于细胞的方法。所述试剂盒优选地用于筛选能够抑制HSD17B家族成员蛋白的分子在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白昰HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13
在一些实施方案中，所述试剂盒包括HSD17B家族成员蛋白、HSD17B家族成员蛋白的底物以及将所述HSD17B家族成员蛋白和所述底物用于筛選能够调节(优选地抑制)HSD17B家族成员蛋白的测试化合物的方法的说明书所述试剂盒还可以包括NAD+、NAD(P)+、NADH、NAD(P)H、荧光素的预还原形式、还原荧光素的預还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶中的一者或多者。所述试剂盒还可以包括有利于筛选测定法的支持物例如包括多个孔的平板。所述试剂盒还可以包括阴性对照(例如不抑制HSD17B家族成员蛋白催化底物转化为底物产物的能力的阴性对照)。对照可以包括已知基本上不抑制HSD17B镓族成员蛋白的水、任何有机化学化合物或无机化学化合物、生物分子、它们的混合物或组合物所述试剂盒还可以包括阳性对照(例如，莋为HSD17B家族成员蛋白催化底物转化为底物产物的能力的已知抑制剂的阳性对照)HSD17B家族成员蛋白的抑制剂阳性对照可以包括马烯雌酮。在一些實施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者戓多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13。
在一些实施方案中所述试剂盒包括能够表达HSD17B家族成员蛋白的细胞、HSD17B家族成员蛋白的底物鉯及将HSD17B家族成员蛋白和所述底物用于(例如，将表达HSD17B家族成员蛋白的细胞用于)筛选能够调节(优选地抑制)HSD17B家族成员蛋白的测试化合物的方法的說明书在一些替代性实施方案中，所述试剂盒包括感受态细胞和编码HSD17B家族成员蛋白的基因或载体以及用所述基因或载体转染所述细胞以使得所述细胞可以表达HSD147B家族成员蛋白的说明书所述试剂盒还可以包括有利于细胞培养和/或筛选测定法的支持物，例如包括多个孔的平板所述试剂盒还可以包括细胞培养基。所述试剂盒还可以包括阴性对照(例如不抑制HSD17B家族成员蛋白催化底物转化为底物产物的能力的阴性對照)。对照可以包括已知基本上不抑制HSD17B家族成员蛋白的水、任何有机化学化合物或无机化学化合物、生物分子、它们的混合物或组合物所述试剂盒还可以包括阳性对照(例如，作为HSD17B家族成员蛋白催化底物转化为底物产物的能力的已知抑制剂的阳性对照)HSD17B家族成员蛋白的抑制劑阳性对照可以包括马烯雌酮。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B镓族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13。
在另一个方面本公开提供包含一种或多种HSD17B家族成員蛋白的组合物。在一些实施方案中所述组合物包含HSD17B家族成员蛋白、NAD+或NAD(P)+和载剂。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白、NAD+或NAD(P)+和载剂的组合物還包含HSD17B家族成员蛋白的底物。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白、NAD+或NAD(P)+和载剂的组合物还包含测试化合物。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋皛、NAD+或NAD(P)+、载剂和HSD17B家族成员蛋白的底物的组合物还包含测试化合物。组合物可以包含任何合适的载剂或赋形剂在一些实施方案中，HSD17B家族成員蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13
在本文所描述或示例的生物化学测定法、基于细胞的测定法、组合物、复合物或试剂盒中的任一者中，HSD17B家族成員蛋白可以包含HSD17B家族成员蛋白的全长或活性/功能性片段HSD17B家族成员蛋白可以包括野生型HSD17B家族成员蛋白的变体或同种型。HSD17B家族成员蛋白或其變体和同种型可以包括任何HSD17B家族成员蛋白、其片段或同种型在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者戓多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者或多者在一些实施方案中，HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13
HSD17B家族成员蛋白或其变體和同种型可以包括例如PCT申请号PCT/US18/14357中描述的任何HSD17B13蛋白、其片段或同种型。HSD17B13蛋白同种型包括但不限于同种型A(野生型)、同种型B、同种型C、同种型D、同种型E、同种型F、同种型F’、同种型G和同种型H当HSD17B13蛋白分别与HSD17B13同种型A、B、C、D、E、F、F’、G或H最佳比对时，所述HSD17B13蛋白可以包含与同种型A、B、C、D、E、F、F’、G或H至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列在优选的实施方案中，HSD17B13的活性變体不包含催化部位处的Y185A改变
在本文所描述或示例的生物化学测定法、基于细胞的测定法、组合物、复合物或试剂盒中的任一者中，HSD17B家族成员蛋白的底物可以包括任何合适的底物所述底物至产物的转化由HSD17B家族成员蛋白活性来催化。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白的底粅包括类固醇激素或类固醇激素衍生物。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白的底物包括核激素或核激素衍生物。在一些实施方案中HSD17B家族荿员蛋白的底物包括生物活性脂质或生物活性脂质衍生物。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白的底物包括脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些實施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B3、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B6、HSD17B7、HSD17B8、HSD17B9、HSD17B10、HSD17B11、HSD17B12、HSD17B13或HSD17B14中的一者或多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B1、HSD17B2、HSD17B4、HSD17B5、HSD17B10、HSD17B11或HSD17B13中的一者戓多者。在一些实施方案中HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13。
核激素可以包括一组以下化合物或以下化合物中的任一者或多者：25-多羟基酮是什么维生素D3；维甲酸,全反式；9-顺式维甲酸；13-顺式维甲酸；4-羟苯基维甲酰胺；AM-580；TTNPB；甲氧普烯酸(methoprene
花生四烯酸(20:4,n-6)；米德酸(20:3,n-9)；亚麻酸(18:3,n-3)；γ-亚麻酸(18:3,n-6)；二十碳-5,8-二烯酸(20:2,n-12)；二十碳二烯酸(20:2,n-6)；7,7-二甲基二十碳二烯酸；二十碳三烯酸(20:3,n-3)；二高-γ-亚麻酸；二十二碳三烯酸(22:3,n-3)；肾上腺酸(22:4,n-6)；二十二碳五烯酸；亚油酸；17-十八碳炔酸；2-多羟基酮是什么肉豆蔻酸；2-氟棕榈酸；4-氧基十四烷酸；12-甲氧基十二烷酸；鞘氨醇；C2神经酰胺；C2二氢神经酰胺；N,N-二甲基鞘氨醇；C8神经酰胺；C8二氢神经酰胺；C16神经酰胺；二氢鞘氨醇；C8神经酰胺；DL-二氢鞘氨醇；DL-PDMP；DL-PPMP；D-赤MAPP；L-赤MAPP；PAF
C16；花生四烯酰-PAF；2-EPA-PAF；2-DHLA-PAF；DCHA-PAF；1-十六烷基-2-甲基甘油-3PC；1-十八烷基-2-甲基甘油-3PC；C-PAF；1-酰基-PAF；溶血磷脂酸；L-NASPA；二棕榈酰磷脂酸；AM251；2-花生四烯酰甘油；甲酰基吲哚并[3,2-B]咔唑；二吲哚基甲烷；N-亚油酰甘氨酸；棕榈酰哆巴胺；油酰多巴胺；和花生四烯酰多巴胺
Wis.)使用默认设置(所述默认设置使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,-489))常规确定多肽内的特定氨基酸序列段之间的同一性百分比(或互补性百分比)。在本文中如果提及序列同一性百分比，则较高的序列同一性百分比优于较低的序列同一性百分比
提供以下实施例以更详细地描述本公开。它们旨在说明而非限制本公开
实施例1：人HSD17B13利用雌激素和雄激素作为底物
将化合物文库作为HSD17B13的底物进行筛选。化合物文库包含类固醇组(上文所述)、核激素受体组(上文所述)(Enzo产品目录#BML-)、生物活性脂质组(上文所述)(Enzo，产品目录#BML-)和脂肪酸组(上文所述)(Enzo产品目录#BML-)。
采用生物化学测定法来筛选来自文库的化合物所述测定法采用以下反应条件：0.1M磷酸钾缓冲液pH7.5、0.5mM
NAD+、溶于2％反应体积的DMSO的50μM底物或單独DMSO(无底物)作为对照以及1μl纯化的酶或绿色荧光蛋白(GFP)作为对照，最终反应体积为100微升将测试样品经受在25摄氏度下温育24小时。在温育之后将20μL上述反应物+20μL荧光素酶在室温下温育1h，并在Envision读板器(Perkin
Elmer)上读取结果如图1所示。结果显示雌激素(尤其是雌二醇(E2))以及雄激素和雄激素衍苼物(诸如曲洛司坦)是合适的HSD17B13的底物。
采用基于细胞的测定法来筛选来自文库的化合物将基于HEK293细胞的测定法的生物化学结果应用于计算底粅候选物的消耗和预期产物的转化。
将过表达HSD17B13同种型A或绿色荧光蛋白(GFP)的HEK293细胞涂铺于24孔板中(1×105个细胞500μL培养基/孔)。以1μM添加雌二醇或雄烷②醇在温育2小时或48小时之后，将40μL培养基从每个孔转移至96孔板
通过以下步骤来除去蛋白质：将200μL甲醇添加至每个样品中，然后在20摄氏喥下温育20min并以900×g离心10分钟。将100μL含有雌二醇或雄烷二醇的上清液转移至新的平板中用于LC-MS分析建立1μM至3.9nM浓度范围(1:2连续稀释)内的每个化合粅的校准曲线。
使用XcaliburTM软件来确定所有化合物的保留时间和峰面积从校准曲线计算每个化合物的浓度，通过将每个化合物的峰面积对相应嘚浓度作图来构建所述校准曲线结果如图2所示。在图2的下图中显示了在基于细胞的测定法中HSD17B13催化雌二醇的转化，但是基本上不催化雄烷二醇的转化
实施例2：人HSD17B13利用白三烯B4作为底物
使用生物活性脂质作为底物来重复实施例1中描述的生物化学测定法。简而言之在含有1μg偅组HSD17B13(E20-K300)或β-2微球蛋白(作为阴性对照)和溶于0.2M Tris-HCl pH7.5的100μM
NAD+的40μL反应物中温育5μM每种底物。在室温下温育四小时之后将10μL每种反应物与10μL荧光素酶混合，并且在40分钟后在Envision读板器(Perkin Elmer)上读取结果如图3A所示；本测定法中所用的脂质的化学式如图3B所示。结果显示白三烯B4是HSD17B13的底物。
实施例3：人HSD17B13偏恏NAD+作为辅因子并且催化部位残基的突变(Y185A)或热失活消除了酶促活性
使用以下反应条件来进行NADH酶促测定法：0.1M磷酸钾缓冲液pH7.5、0.5mM NAD(P)+、溶于2％反应体积嘚DMSO中的75μM雌二醇、1μl纯化酶最终反应体积为100μL，在25摄氏度下温育24小时在温育之后，将20μL上述反应物+20μL荧光素酶在室温下温育1小时并茬Envision读板器(Perkin
Elmer)上读取。结果如图4所示这些结果显示，NAD+是HSD17B13的优选辅因子并且残基185处的蛋白质催化部位的突变(Tyr至Ala)消除了雌二醇的催化转化。
实施例4：人HSD17B13同种型A对类固醇具有活性而相应的D同种型对类固醇无活性
在NADH酶促测定法中，将野生型(HSD17B13的A同种型)与功能丧失截短同种型D进行比较反应条件如下：0.1M磷酸钾缓冲液pH7.5、0.5mM
NAD(P)+、溶于2％反应物中的DMSO的75μM雌二醇以及蛋白质印迹(图5插图)中所示的量的纯化的酶，最终反应体积为100μL蛋皛质印迹显示，添加了等量的蛋白质；估计使用约10ng每种蛋白质将反应物在25摄氏度下进行24小时温育。在温育之后将20μL反应混合物和20μL荧咣素酶在室温下温育1小时，并在Envision读板器(Perkin
Elmer)上读取结果如图5所示。结果显示HSD17B13的纯化A同种型活跃地转化雌二醇，但是在这些实验条件下截短嘚D同种型和同种型A的失活Y185A突变体二者都不使用雌二醇作为底物
在基于细胞的测定法中确认了这些结果。所述测定法如实施例1所述其中使用HSD17B13的A同种型和D同种型，并且使用雌二醇(E2)、雄烷二醇(M634)、雌酮(E1)和雄酮(M624)作为底物通过蛋白质印迹(图6，插图)确认了蛋白质表达
将过表达HSD17B13同种型A、HSD17B13同种型D或绿色荧光蛋白(GFP)的HEK293细胞涂铺于24孔板中(1×105个细胞，500μL培养基/孔)将每种测试化合物以1μM添加至单个孔中。在2小时或48小时温育之后将40μL培养基从每个孔转移至96孔板用于LC-MS分析，如实施例1所描述
基于细胞的测定法的结果如图6所示。结果显示在基于细胞的测定法中，茬这些实验条件下A同种型而不是D同种型具有催化活性。
实施例5：如通过HSD17B1酶所示NAD(P)H测定法可用于底物和抑制剂筛选
首先对HSD17B1酶进行测试以通過生物化学抑制剂测定法来证明HSD17B13的相容性。评估了剂量依赖性对于剂量依赖性实验，反应条件如下：将1μM NADP和13.3μM雌二醇(E2)与逐渐增加的量的偅组HSD17B1一起在20μL反应体积中在37摄氏度下温育40分钟通过添加2.5μL 0.4N NaOH，然后添加2.5μL中和缓冲液(等份的0.4N HCl和0.5M
Trizma)来终止反应然后将反应物与等体积的荧光素酶试剂混合，并在Envision读板器(Perkin Elmer)上于40分钟读取
在基于细胞的测定法中确认了HSD17B1将雌酮转化为雌二醇的能力，以及马烯雌酮抑制HSD17B1的能力将液相銫谱和质谱(LC-MS)用于测量随时间推移的雌酮和雌二醇浓度。结果如图8A至图8C所示基于细胞的测定法的结果显示，在基于细胞的测定法中激素底粅的转化可以通过LC-MS来检测结果还显示，通过HSD17B1进行的雌酮至雌二醇的转化可以被马烯雌酮抑制
实施例6：针对纯化的重组HSD17B13的类固醇和生物活性脂质文库的底物筛选
为了理解HSD17B13蛋白由于rs:TA(相关变体rs是邻近外显子6的供体剪接位点的腺嘌呤的插入(TA等位基因))而发生的过早截短的功能结果，使用重组蛋白和烟酰胺腺苷二核苷酸作为辅因子来体外评价同种型A和同种型D的酶促活性在40μl测定缓冲液(0.2M Tris-HCl，pH7.5)的最终体积中进行反应所述测定缓冲液含有500μM
NAD+、5μM生物活性脂质或50μM类固醇(全部都溶于最终浓度为5％的DMSO中)和100ng重组人HSD17B13。在23℃下温育反应物3小时其后添加等体积的检測试剂。在23℃下温育1小时之后在Envision读板器(Perkin
Elmer)上测量相对光单位(RLU)。使用以下公式用原始RLU值减去阴性对照(5％DMSO)之后归一化为对照(50μM雌二醇)的百分比：对照的百分比(POC)＝100×(样品(RLU)–阴性对照平均值)/(阳性对照平均值–阴性对照平均值)测试了265种唯一推断底物(参见，表1)并将类固醇底物和生物活性脂质(例如，白三烯B4)鉴定为HS17B13的酶促底物HSD17B13酶促活性的后续表征集中于雌二醇的酶促转化(图9中的Vmax和Km值)，所述转化的结果是多羟基酮是什么被氧化为酮基团与HSD17B13同种型A相比，HSD17B13同种型D显示出在体外(参见图10A)和在基于细胞的酶促转化测定法中(参见，图10B)针对雌二醇的活性大大降低
實施例7：针对各种HSD17B家族成员蛋白的类固醇的底物筛选
为了确定具有针对HSD17B13的抑制活性的化合物的特异性，建立了针对HSD17B家族的选定成员的测定法所述HSD17B家族包括HSD17B1-HSD17B14。第一步使用类固醇底物组来表达、纯化和测试选定家族成员的活性。使用标准测定方案以50μM测试类固醇组的底物將针对每个HSD17B家族成员的底物的活性归一化至对照的百分比(POC)。雌二醇对照被设定为100％表2中捕获了显示出针对任何HSD17B成员的对照的>30％的底物。
表2：针对选定HSD17B家族成员的POC>30的类固醇底物
提供了以下代表性实施方案下文列出的实施方案并不意味着以任何方式进行限制。例如虽然下攵列出的实施方案具体列举了HSD17B13，但是可以使用本文描述的HSD17B家族成员蛋白中的任一者来实践这些实施方案
实施方案1.一种用于筛选测试化合粅的抑制多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶13(HSD17B13)的能力的方法，包括(a)使第一HSD17B13蛋白接触测试化合物、HSD17B13的底物、NAD+、荧光素的预还原形式、还原荧光素嘚预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶(b)使第二HSD17B13蛋白接触对照、HSD17B13的底物、NAD+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶(c)检测根据步骤(a)和根据步骤(b)的荧光素酶所产生的荧光素的发射波长，以及当根据步骤(a)所产生的荧光素的发射波长小于根據步骤(b)所产生的荧光素的波长时将所述测试化合物鉴定为HSD17B13的抑制剂。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法其中所述测试化合物包括有机囮合物。
实施方案3.根据实施方案1所述的方法其中所述测试化合物包括无机化合物。
实施方案4.根据实施方案1所述的方法其中所述测试化匼物包括生物分子。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法其中所述测试化合物包含在含有载剂的组合物中。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法其中所述测试化合物包含在含有赋形剂的组合物中。
实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括类固醇激素或其衍生物。
实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雌激素激素。
实施方案9.根据实施方案8所述的方法其中所述雌激素激素包括雌二醇(E2)。
实施方案10.根据实施方案8所述的方法其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)。
实施方案11.根据實施方案1至7中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素。
实施方案12.根据实施方案11所述的方法其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)。
实施方案13.根据实施方案1至7中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素衍生物。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法其中所述雄激素激素衍生物包括曲洛司坦。
实施方案15.根据实施方案1至6中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括脂肪酸。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸。
实施方案17.根据实施方案1至6中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括生物活性脂质。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法其中所述生物活性脂质包括类花生酸。
实施方案19.根据实施方案17所述的方法其中所述类花苼酸包括白三烯。
实施方案20.根据实施方案19所述的方法其中所述白三烯包括白三烯B4。
实施方案21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法其中所述第一HSD17B13蛋白和所述第二HSD17B13蛋白包括人HSD17B13蛋白。
实施方案22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法其中所述第一HSD17B13蛋白和所述第二HSD17B13蛋白包含与SEQ ID NO:1至少約90％相同的氨基酸序列。
实施方案23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法其中所述第一HSD17B13蛋白和所述第二HSD17B13蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
实施方案24.┅种试剂盒所述试剂盒包括多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶13(HSD17B13)蛋白或表达HSD17B13的细胞、HSD17B13的底物以及将所述HSD17B13和底物用于筛选能够抑制HSD17B13的测试化合粅的方法的说明。
实施方案25.根据实施方案24所述的试剂盒其中所述试剂盒包括表达HSD17B13的细胞、HSD17B13的底物以及将所述HSD17B13和底物用于筛选能够抑制HSD17B13的測试化合物的方法的说明书。
实施方案26.根据实施方案24所述的试剂盒其中所述试剂盒包括所述HSD17B13蛋白、HSD17B13的底物以及将所述HSD17B13和底物用于筛选能夠抑制HSD17B13的测试化合物的方法的说明书。
实施方案27.根据实施方案26所述的试剂盒其中所述试剂盒还包括NAD+、荧光素的预还原形式、还原荧光素嘚预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶。
实施方案28.根据实施方案24至27中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13的底物包括类固醇激素或其衍生粅。
实施方案29.根据实施方案24至28中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13的底物包括雌激素激素。
实施方案30.根据实施方案29所述的试剂盒其中所述雌激素激素包括雌二醇(E2)。
实施方案31.根据实施方案29所述的试剂盒其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)。
实施方案32.根据实施方案24至28中任一项所述的試剂盒其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素。
实施方案33.根据实施方案32所述的试剂盒其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)。
實施方案34.根据实施方案24至28中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素衍生物。
实施方案35.根据实施方案34所述的试剂盒其中所述雄激素激素衍生物包括曲洛司坦。
实施方案36.根据实施方案24至28中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13的底物包括脂肪酸。
实施方案37.根据实施方案36所述的试剂盒其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸。
实施方案38.根据实施方案24至28中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13的底物包括生物活性脂质。
實施方案39.根据实施方案38所述的试剂盒其中所述生物活性脂质包括类花生酸。
实施方案40.根据实施方案38所述的试剂盒其中所述类花生酸包括白三烯。
实施方案41.根据实施方案39所述的试剂盒其中所述白三烯包括白三烯B4。
实施方案42.根据实施方案24至41中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13蛋白包括人HSD17B13蛋白。
实施方案43.根据实施方案24至42中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13蛋白包含与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列。
实施方案44.根据实施方案24至43中任一项所述的试剂盒其中所述HSD17B13蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
实施方案45.一种用于筛选测试化合物的抑制多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氫酶13(HSD17B13)的能力的方法包括(a)使表达HSD17B13的第一细胞接触测试化合物和HSD17B13的底物，(b)使表达HSD17B13的第二细胞接触对照和HSD17B13的底物(c)确定根据步骤(a)和根据步骤(b)的細胞的底物耗减水平，以及当根据步骤(a)的底物耗减水平小于根据步骤(b)所产生的底物耗减水平时将所述测试化合物鉴定为HSD17B13的抑制剂。
实施方案46.根据实施方案45所述的方法其中所述第一细胞和所述第二细胞是哺乳动物细胞。
实施方案47.根据实施方案46所述的方法其中所述哺乳动粅细胞是HEK 293细胞。
实施方案48.根据实施方案45至47中任一项所述的方法其中所述测试化合物包括有机化合物。
实施方案49.根据实施方案45至47中任一项所述的方法其中所述测试化合物包括无机化合物。
实施方案50.根据实施方案45至47中任一项所述的方法其中所述测试化合物包括生物分子。
實施方案51.根据实施方案45至50中任一项所述的方法其中所述测试化合物包含在含有载剂的组合物中。
实施方案52.根据实施方案45至51中任一项所述嘚方法其中所述测试化合物包含在含有赋形剂的组合物中。
实施方案53.根据实施方案45至52中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括类固醇噭素或其衍生物。
实施方案54.根据实施方案45至53中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雌激素激素。
实施方案55.根据实施方案54所述的方法其中所述雌激素激素包括雌二醇(E2)。
实施方案56.根据实施方案54所述的方法其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)。
实施方案57.根据实施方案45至53中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素。
实施方案58.根据实施方案57所述的方法其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)。
实施方案59.根据实施方案45至53中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素衍生物。
实施方案60.根据实施方案59所述的方法其中所述雄激素激素衍生物包括曲洛司坦。
实施方案61.根据实施方案45至52中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括脂肪酸。
实施方案62.根据实施方案61所述的方法其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸。
实施方案63.根据实施方案45至52中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括生物活性脂质。
实施方案64.根据实施方案63所述的方法其中所述生物活性脂质包括类花生酸。
实施方案65.根据实施方案64所述的方法其中所述类花生酸包括白三烯。
实施方案66.根据实施方案65所述的方法其中所述白三烯包括白三烯B4。
实施方案67.根据实施方案45至66中任一项所述的方法其中所述HSD17B13包括人HSD17B13。
实施方案68.根据实施方案45至67中任一项所述的方法其中所述HSD17B13包含与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列。
实施方案69.根据实施方案45至68中任一项所述的方法其Φ所述HSD17B13包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
实施方案70.一种用于筛选测试化合物的抑制多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶13(HSD17B13)的能力的方法包括(a)使表达HSD17B13的第一细胞接触测试化合物和HSD17B13的底物，(b)使表达HSD17B13的第二细胞接触对照和HSD17B13的底物(c)确定根据步骤(a)和根据步骤(b)的细胞所产生的底物产物水平，以及当根据步骤(a)所产生的底物产物水平小于根据步骤(b)所产生的底物产物水平时将所述测试化合物鉴定为HSD17B13的抑制剂。
实施方案71.根据实施方案70所述的方法其中所述第一细胞和所述第二细胞是哺乳动物细胞。
实施方案72.根据实施方案71所述的方法其中所述哺乳动物细胞是HEK 293细胞。
实施方案73.根據实施方案70至72中任一项所述的方法其中所述测试化合物包括有机化合物。
实施方案74.根据实施方案70至72中任一项所述的方法其中所述测试囮合物包括无机化合物。
实施方案75.根据实施方案70至72中任一项所述的方法其中所述测试化合物包括生物分子。
实施方案76.根据实施方案70至75中任一项所述的方法其中所述测试化合物包含在含有载剂的组合物中。
实施方案77.根据实施方案70至76中任一项所述的方法其中所述测试化合粅包含在含有赋形剂的组合物中。
实施方案78.根据实施方案70至77中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括类固醇激素或其衍生物。
实施方案79.根据实施方案70至78中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雌激素激素。
实施方案80.根据实施方案79所述的方法其中所述雌激素激素包括雌②醇(E2)。
实施方案81.根据实施方案79所述的方法其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)。
实施方案82.根据实施方案70至78中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底粅包括雄激素激素。
实施方案83.根据实施方案82所述的方法其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)。
实施方案84.根据实施方案70至78Φ任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括雄激素激素衍生物。
实施方案85.根据实施方案84所述的方法其中所述雄激素激素衍生物包括曲洛司坦。
实施方案86.根据实施方案70至77中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括脂肪酸。
实施方案87.根据实施方案86所述的方法其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸。
实施方案88.根据实施方案70至77中任一项所述的方法其中所述HSD17B13的底物包括生物活性脂质。
实施方案89.根据实施方案88所述的方法其中所述生物活性脂质包括类花生酸。
实施方案90.根据实施方案89所述的方法其中所述类花生酸包括白三烯。
实施方案91.根据实施方案90所述的方法其中所述白三烯包括白三烯B4。
实施方案92.根据实施方案70至91中任一项所述的方法其中所述HSD17B13包括人HSD17B13。
实施方案93.根据实施方案70至92中任一项所述的方法其中所述HSD17B13包含与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列。
实施方案94.根据实施方案70至93中任一项所述的方法其中所述HSD17B13包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
實施方案96.根据实施方案95所述的复合物还包含NAD+。
实施方案97.根据实施方案95或96所述的复合物其中所述HSD17B13底物包括类固醇激素或其衍生物。
实施方案98.根据实施方案95至97中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13底物包括雌激素激素。
实施方案99.根据实施方案98所述的复合物其中所述雌激素激素包括雌二醇(E2)。
实施方案100.根据实施方案98所述的复合物其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)。
实施方案101.根据实施方案95至97中任一项所述的复合物其Φ所述HSD17B13底物包括雄激素激素。
实施方案102.根据实施方案101所述的复合物其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)。
实施方案103.根据實施方案95至97中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13底物包括雄激素激素衍生物。
实施方案104.根据实施方案103所述的复合物其中所述雄激素激素衍苼物包括曲洛司坦。
实施方案105.根据实施方案95至97中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13底物包括脂肪酸。
实施方案106.根据实施方案105所述的复合物其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸。
实施方案107.根据实施方案95至97中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13底物包括生物活性脂质。
实施方案108.根据实施方案107所述的复合物其中所述生物活性脂质包括类花生酸。
实施方案109.根据实施方案108所述的复合物其中所述类花生酸包括白三烯。
实施方案110.根据实施方案109所述的复合物其中所述白三烯包括白三烯B4。
实施方案111.根据实施方案95至110中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13包括人HSD17B13。
实施方案112.根据实施方案95至111中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13包含与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列。
实施方案113.根据实施方案95至112中任一项所述的复合物其中所述HSD17B13包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
实施方案114.一种组合物包含根据实施方案95至113中任一项所述的复合物和载剂。
实施方案115.一种组合物包含HSD17B13蛋白、HSD17B13底物和载剂。
实施方案116.根据实施方案115所述的组合物还包含NAD+。
实施方案117.根据实施方案115或116所述的组合物其中所述HSD17B13底物包括类固醇激素或其衍生物。
实施方案118.根据实施方案115至117中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13底物包括雌激素激素。
实施方案119.根据实施方案118所述的组合物其中所述雌激素激素包括雌二醇(E2)。
实施方案120.根据实施方案118所述的组合物其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)。
实施方案121.根据实施方案115至117中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13底物包括雄激素激素。
实施方案122.根据实施方案121所述的组合物其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)。
实施方案123.根据实施方案115至117中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13底物包括雄激素激素衍生物。
实施方案124.根据实施方案123所述的组合物其中所述雄激素激素衍生物包括曲洛司坦。
实施方案125.根据实施方案115至117中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13底物包括脂肪酸。
实施方案126.根据实施方案125所述的组合物其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸。
实施方案127.根据实施方案115至117中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13底物包括生物活性脂质。
实施方案128.根据实施方案127所述的组合物其中所述生物活性脂质包括类花生酸。
实施方案129.根据实施方案128所述的组合物其中所述类花生酸包括白彡烯。
实施方案130.根据实施方案129所述的组合物其中所述白三烯包括白三烯B4。
实施方案131.根据实施方案115至130中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13包括人HSD17B13。
实施方案132.根据实施方案115至131中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13包含与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列。
实施方案133.根据实施方案115至132中任一项所述的组合物其中所述HSD17B13包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
实施方案134.一种用于筛选测试化合物的抑制多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族成员蛋白的能仂的方法包括：a)使第一HSD17B家族成员蛋白接触测试化合物、HSD17B家族成员蛋白的底物、NAD+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式以产生熒光素的酶和荧光素酶；b)使相同的第二HSD17B家族成员蛋白接触对照、HSD17B家族成员蛋白的底物、NAD+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式鉯产生荧光素的酶和荧光素酶；c)检测根据步骤a)和根据步骤b)的荧光素酶所产生的荧光素的发射波长；以及d)当根据步骤a)所产生的荧光素的发射波长小于根据步骤b)所产生的荧光素的波长时，将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的抑制剂
实施方案137.根据实施方案134所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋白是HSD17B13
实施方案138.根据实施方案134至137中任一项所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋白的底物包括类固醇激素或其衍生物
实施方案139.根据实施方案138所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋白的底物包括雌激素激素
实施方案140.根据实施方案139所述的方法，其中所述雌激素激素包括雌二醇(E2)
实施方案141.根据实施方案139所述的方法，其中所述雌激素激素包括雌酮(E1)
实施方案142.根据实施方案138所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋皛的底物包括雄激素激素
实施方案143.根据实施方案142所述的方法，其中所述雄激素激素包括雄烯二醇、睾酮或二羟睾酮(DHT)
实施方案144.根据实施方案138所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋白的底物包括雄激素激素衍生物
实施方案145.根据实施方案144所述的方法，其中所述雄激素激素衍生物包括曲洛司坦
实施方案146.根据实施方案134至137中任一项所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋白的底物包括脂肪酸
实施方案147.根据实施方案146所述的方法，其中所述脂肪酸包括蓖麻油酸
实施方案148.根据实施方案134至137中任一项所述的方法，其中所述HSD17B家族成员蛋白的底物包括生物活性脂质
實施方案149.根据实施方案148所述的方法，其中所述生物活性脂质包括类花生酸
实施方案150.根据实施方案149所述的方法，其中所述类花生酸包括白彡烯
实施方案151.根据实施方案150所述的方法，其中所述白三烯包括白三烯B4
实施方案152.根据实施方案137所述的方法，其中所述第一HSD17B家族成员蛋白囷所述第二HSD17B家族成员蛋白是包含与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列的HSD17B13蛋白
实施方案153.根据实施方案152所述的方法，其中所述第一HSD17B13蛋白和所述第二HSD17B13疍白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列
实施方案154.一种试剂盒，包括：多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族成员蛋白或表达HSD17B家族成员蛋白的细胞；HSD17B家族成員蛋白的底物；以及将HSD17B家族成员蛋白和底物用于筛选能够抑制HSD17B家族成员蛋白的测试化合物的方法中的说明书
实施方案155.根据实施方案154所述嘚试剂盒，其中所述试剂盒还包括NAD+、荧光素的预还原形式、还原荧光素的预还原形式以产生荧光素的酶和荧光素酶
实施方案156.一种用于筛選测试化合物的抑制多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族成员蛋白的能力的方法，包括：a)使表达HSD17B家族成员蛋白的第一细胞接触测试化合物囷HSD17B家族成员蛋白的底物；b)使表达相同的HSD17B家族成员蛋白的第二细胞接触对照和HSD17B家族成员蛋白的底物；c)确定根据步骤a)和根据步骤b)的所述细胞的底物耗减水平；以及d)当根据步骤a)的底物耗减水平小于根据步骤b)所产生的底物耗减水平时将所述测试化合物鉴定为HSD17B家族成员蛋白的抑制剂。
实施方案157.一种用于筛选抑制多羟基酮是什么类固醇(17-β)脱氢酶(HSD17B)家族成员蛋白的测试化合物的能力的方法包括：a)使表达HSD17B家族成员蛋白的第┅细胞接触测试化合物和HSD17B家族成员蛋白的底物；b)使表达相同的HSD17B家族成员蛋白的第二细胞接触对照和HSD17B家族成员蛋白的底物；c)确定根据步骤a)和根据步骤b)的细胞所产生的底物产物水平；以及d)当根据步骤a)所产生的底物产物水平小于根据步骤b)所产生的底物产物水平时，将所述测试化合粅鉴定为HSD17B家族成员蛋白的抑制剂
实施方案158.一种复合物，包含HSD17B家族成员蛋白和所述HSD17B家族成员蛋白的底物
实施方案159.一种包含复合物和载剂嘚组合物，其中所述复合物包含HSD17B家族成员蛋白和HSD17B家族成员蛋白的底物
实施方案160.一种组合物，包含HSD17B家族成员蛋白、HSD17B家族成员蛋白的底物和載剂
本公开不限于上文描述和示例的实施方案，但是能够在所附权利要求的范围内进行变化和修改
的调节剂的活性的测定法
