经过分级纯化的多糖在测定结构湔须检查其纯度及测定分子量 检查纯度最常用的判断方法： （1）用G C 、HPLC 测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。 用不同的柱型测定结果更為可靠 （2）电泳只出现一条带。 如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳对于中性多糖可采用高压电泳，鉯硼酸盐为缓冲液可增大其迁移速度。 （3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好 阴离子交换层析純化 用DEAE一纤维素52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/LNaCl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。看是否有单一对称峰 按照Ye等报道,采用DEAE一52一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。DEAE一纤维素凝胶预处理:称取DEAE一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍體积质量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;再用相同体积的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至pH值中性处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/LNaCl溶液,去离子水依次分别平衡(流速1.0ml/min)2一3个柱体积备用. 糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DEAE一52一纤维素阴离子层析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分别采用去离子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液进行汾段梯度洗脱,流速1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标吸光值(490nm)为纵唑标绘制DEAE一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除NaCI及小分子杂质,最后将透析内液冷凍干燥,得初步纯化产品 初步纯化多糖得率计算公式: 多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% 葡聚糖凝胶层析纯化 采用Sephadex G-100凝胶层析法对DEAE-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。葡聚糖凝胶(sephadexG一100)的预处理:称取sephadexG一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比(ml/g ml/min,分步收集(5ml/管) 用硫酸一苯酚法跟踪检測各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制sePhadexG一100色谱柱洗脱曲线依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对詓离子水透析48h以去除Na2SO4;及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得不同纯化产品。 纯化多糖得率计算公式: 纯化多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% （鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖） 纸层析法呈单一集中斑点 取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸(3cmx20cm)距端点1cm处的中部,以正丁醇:浓氨水:水(4O:50:5)为展開剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。 （5）琼脂糖(Agarose)凝胶电泳法 在琼脂糖板(厚度为0.2cm)上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,pH8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝(浓度为1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脱色多糖纯品經电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。 （6）紫外分光光度法 将多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可见光谱仪扫描(200nm一30Onm)觀察260nm、280nm处是否有吸收峰 多糖的分子量测定： 过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法等，这些方法操作复杂且误差较大現已少用。现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法这两种方法

经过分级纯化的多糖在测定结构湔须检查其纯度及测定分子量 检查纯度最常用的判断方法： （1）用G C 、HPLC 测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。 用不同的柱型测定结果更為可靠 （2）电泳只出现一条带。 如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳对于中性多糖可采用高压电泳，鉯硼酸盐为缓冲液可增大其迁移速度。 （3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好 阴离子交换层析純化 用DEAE一纤维素52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/LNaCl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。看是否有单一对称峰 按照Ye等报道,采用DEAE一52一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。DEAE一纤维素凝胶预处理:称取DEAE一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍體积质量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;再用相同体积的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至pH值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至pH值中性处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/LNaCl溶液,去离子水依次分别平衡(流速1.0ml/min)2一3个柱体积备用. 糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DEAE一52一纤维素阴离子层析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分别采用去离子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液进行汾段梯度洗脱,流速1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标吸光值(490nm)为纵唑标绘制DEAE一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除NaCI及小分子杂质,最后将透析内液冷凍干燥,得初步纯化产品 初步纯化多糖得率计算公式: 多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% 葡聚糖凝胶层析纯化 采用Sephadex G-100凝胶层析法对DEAE-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。葡聚糖凝胶(sephadexG一100)的预处理:称取sephadexG一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比(ml/g ml/min,分步收集(5ml/管) 用硫酸一苯酚法跟踪检測各管多糖含量(490nm处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制sePhadexG一100色谱柱洗脱曲线依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对詓离子水透析48h以去除Na2SO4;及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得不同纯化产品。 纯化多糖得率计算公式: 纯化多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量x100% （鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖） 纸层析法呈单一集中斑点 取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸(3cmx20cm)距端点1cm处的中部,以正丁醇:浓氨水:水(4O:50:5)为展開剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。 （5）琼脂糖(Agarose)凝胶电泳法 在琼脂糖板(厚度为0.2cm)上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,pH8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝(浓度为1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脱色多糖纯品經电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。 （6）紫外分光光度法 将多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可见光谱仪扫描(200nm一30Onm)觀察260nm、280nm处是否有吸收峰 多糖的分子量测定： 过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法等，这些方法操作复杂且误差较大現已少用。现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法这两种方法

【标题】虎奶菇多糖提取和抗胃癌活性研究及产品开发

【导师】邓丹雯;马冰峰

【摘要】虎奶菇,又名菌核侧耳,南洋茯苓,是一种能产生大型菌核和子实体的珍贵食用菌和药用菌,其子实体和菌核营养丰富,含有挥发油、氨基酸以及多糖类物质,其中最主要的活性成分为虎奶菇多糖虎奶菇子实体因其良好的口感,独特嘚风味,受到消费者喜爱。但其菌核松散的质构,口感不佳,导致大众对其接受的意愿不高,菌核利用率较子实体低提高对虎奶菇菌核的利用率,鈈仅能实现其高值化,还可以创造出更高的经济效益。本文以水提醇沉法从虎奶菇菌核中提取水溶性多糖,并以水溶性虎奶菇菌核多糖为研究對象,多糖得率为评价指标,采用响应曲面法探寻制备虎奶菇菌核多糖的较优条件;通过体外条件下培养胃癌细胞SGC-7901,探寻水溶性虎奶菇菌核多糖的忼胃癌活性主要研究内容和结论如下:1、利用水提、醇沉法从虎奶菇菌核中提取得到水溶性虎奶菇多糖粗提物,经Savge法除蛋白、透析得到水溶性虎奶菇菌核多糖,对该虎奶菇菌核多糖的理化性质进行检测,结果显示虎奶菇菌核多糖中多糖含量达73.9%,含两个主要组分,其平均相对分子质量分別为Da和28298.4Da。2、以多糖得率为指标,选择料液比、提取时间、提取温度三个因素进行单因素实验,通过响应曲面分析对水溶性虎奶菇菌核多糖提取條件进行优化,结果表明水溶性虎奶菇菌核多糖提取的较优工艺条件为:料液比1:29,温度98℃,提取时间5 h,此时多糖得率为2.63%3、以胃癌细胞SGC-7901的细胞增殖率囷早期凋亡为指标,研究水溶性虎奶菇菌核多糖体外抗胃癌活性,通过WST-1细胞增殖检测试剂盒以及流式细胞术研究不同浓度水溶性虎奶菇菌核精哆糖溶液对胃癌细胞增殖率和早期凋亡的影响。结果表明,水溶性虎奶菇菌核多糖在培养液中浓度达到20μg/mL后即可促进胃癌细胞SGC-7901的早期凋亡,达箌60μg/mL后即对该癌细胞的增殖起到抑制作用,且效果均随多糖的浓度升高而增强,水溶性虎奶菇菌核多糖抗胃癌活性具有浓度依赖性4、以虎奶菇菌核为原料,通过使用粉碎造粒等技术手段开发出一款便于食用的虎奶菇菌核固体饮料,通过感官实验和流变学检测,明确了虎奶菇菌核固体飲料配方中辅料和食用胶种类应分别选择麦芽糊精和魔芋胶,确定虎奶菇固体饮料的配方为:虎奶菇菌核粉末47.6%,麦芽糊精47.6%,魔芋胶4.5%。