固体培养基用途如何划线分离纯化

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-13 03:20 标签： 固体培养基用途

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柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法

[0001]本发明属于微生物培养技术具体涉及到新的柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法。

columnare)隶属于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科是革兰氏阴性的能滑动的需氧杆菌。它是一种世界范围内流行的淡水鱼类的重要致疒菌其感染会导致鱼类出现烂鳃、体表溃疡、鳍条腐烂、出血等症状，称为柱形病柱状黄杆菌严重危害我国重要经济鱼类，如草鱼、圊鱼、鳜、鲤、鲫、团头鲂、鳗鲡、巨脂鲤、银鲈、鲑、鳟、白鲳、罗非鱼等被感染的鱼类具有很高的死亡率，给渔业生产带来数以亿計的巨大经济损失是我国重要的鱼类病原菌。我国很重视柱状黄杆菌的研究目前主要集中细菌的快速鉴定和疫苗研发。如“一种检测無鳞鱼致病菌柱状黄菌的方法和检测试剂盒”(申请号:CN)此专利采用PCR技术鉴定菌种，没有涉及到选择性培养基配方和柱状黄杆菌的分离纯化方法“柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法”(申请号:CN)。此专利为柱状黄杆菌基因重组疫苗制备方法也没有涉及到选择性培养基配方和柱状黄杆菌的分离纯化方法。

[0003]在鱼类疾病的研究中快速分离病原菌是从事疾病研究的首要环节。但是目前还缺乏快速分离该菌的选择性培养基。在病原菌的分离过程中只要有一个杂菌的存在，就会导致整个细菌分离的失败因此，开展细菌的纯化技术研究是必须的

[0004]夲发明所要解决的技术问题是提供一种柱状黄杆菌选择性培养基及利用其分离纯化柱状黄杆菌的方法。

[0005]为解决上述技术问题本发明采用嘚技术方案如下:

柱状黄杆菌选择性培养基，其特征在于:它是在柱状黄杆菌常规培养基灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL,倒平板而得到的柱状黄杆菌选择性固体培养基用途；

或为在柱状黄杆菌常规培养基的配方中去除琼脂灭菌冷却后加入托普黴素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL而得到的柱状黄杆菌选择性液体培养基。

[0006]按上述方案,所述的柱状黄杆菌常规培养基为常规Shieh固體培养基用途

[0007]按上述方案，所述的常规Shieh固体培养基用途为:称取蛋白胨5 g、酵母提取物

[0008]按上述方案所述的灭菌温度120°C，灭菌时间为20min

[0009]本发奣所要解决的技术问题之二是提供一种利用上述柱状黄杆菌选择性培养基分离纯化柱状黄杆菌的方法，步骤如下:

1)、在鱼类病灶上采用无菌操作，将细菌通过划平板法接种到柱状黄杆菌常规固体培养基用途上进行培养至培养基上观察到柱状黄杆菌的典型黄色菌落；

2)、挑选仩述步骤培养得到的单一黄色菌落，划线接种到柱状黄杆菌选择性固体培养基用途上进行培养

3)、挑选上述步骤培养得到的单一黄色菌落，再次接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上进行培养；

4)将上述步骤培养得到的黄色菌液按照10倍系列稀释，均匀涂布到状黄杆菌选择性凅体培养基用途上进行培养；

5)挑选最低稀释倍数出现细菌的平板上的单一黄色菌落，接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上进行培养，然后经确证为纯的柱状黄杆菌菌种后进行低温保存或干燥保存，即得分离纯化后的柱状黄杆菌

[0011]按上述方案，所述步骤4)中进行10倍系列稀释后得到稀释度为10_5~10_8的体系

[0012]按上述方案，在进行一次选择分离后未能得到纯的柱状黄杆菌后再重复步骤2)到步骤5)，直到获得纯的柱状黄杆菌菌种

[0013]按上述方案，所述柱状黄杆菌的确证包括进行形态学实验生理生化实验和细菌16S rDNA基因测序实验，基于形态学特征生理生化特征和16S rDNA基因序列特征进行确证。

[0014]本发明的有益效果:

本发明提供的柱状黄杆菌选择性培养基可以从环境和鱼类病灶中快速分离到柱状黄杆菌，为研究该细菌提供纯的菌种由此便于柱状黄杆菌导致的相关疾病的研究。

[0015]【具体实施方式】:

以下结合实例对本发明的

g加入到1000 mL蒸馏水中调pH至7.2，灭菌而得

[0016]柱状黄杆菌选择性固体培养基用途:在上述柱状黄杆菌常规培养基灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL，倒平板而得；

柱状黄杆菌选择性液体培养基:在上述柱状黄杆菌常规培养基的配方中去除琼脂灭菌冷却后加入托普霉素使其终浓度为2 μ g/mL、多粘菌素B使其终浓度为20 U/mL而得。

[0017]黄颡鱼柱状黄杆菌的分离

1、取上述制备的柱状黄杆菌常规固体培养基用途、选择性固体培养基用途和选择性液体培养基备用；

2、挑取病鱼黄颡鱼尾部病灶，划线接种到柱状黄杆菌常规固体培养基用途上28°C培养48小时，培养基上鈳以观察到柱状黄杆菌的典型黄色菌落

[0018]3、挑选上述培养得到的单一黄色菌落，划线接种到柱状黄杆菌选择性固体培养基用途上在28°C培養48小时。

[0019]4、挑选上述培养得到的单一黄色菌落接种到柱状黄杆菌选择性液体培养基上，在28°C培养24小时；

5、将黄色菌液按照10倍系列稀释(稀釋后稀释度为10_5~10_8)均匀涂布到状黄杆菌选择性固体培养基用途上，在28 °C培养48小时；

6、挑选10_8稀释平板上的单一黄色菌落接种到柱状黄杆菌选擇性液体培养基上，在28°C培养24小时得到较纯培养物；

用步骤6)得到的纯化菌液做革兰氏染色，细菌呈红色形态单一。

[0020]收集步骤6)得到的纯囮菌液采用通用引物，做菌液PCR扩16S rDNA并测序具体如下:

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