：贮存稳定的人纤维蛋白原凝结時间偏低溶液的制作方法
本发明主要涉及贮存稳定的、浓缩人纤维蛋白原凝结时间偏低制剂及其用于防止失血、促进伤口愈合和许多其咜的治疗性和非治疗性应用的使用方法。
相关申请参考本申请要求2001年10月3日提交的美国临时申请/us/products/biological//us/products/biological/monograph.cfm/)因此，现有技术中纤维蛋白原凝结时间偏低制剂的重构要求使用水浴或其它加热装置(典型的是在37℃)以尽可能在最短的时间内将深度冷冻物质变成即用型纤维蛋白原凝结时间偏低溶液。然而因为产品需要必要的双层包装以便例如在整个困难、繁琐的解冻过程中保持产品的无菌状态，所以典型地使得热交换更加困難例如，预填充、即用型、无菌一次性注射器中的深度冷冻的纤维蛋白密闭剂制剂必须以塑料膜双层密封以保持无菌
由深度冷冻的固態转变为液态不是突然发生的，而是经历升高温度的步骤经历胶状的和粘性的过渡状态。根据至少一种试验当倾斜试管形成水平的液體水平面时，即样品流动时不会突然形成可见的突起时样品才称为“液态”因此，现有技术中在贮备的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂使鼡前测试产品以确定其什么时候达到均匀的“液体”即用型状态需要增加额外的耗费时间的步骤。而且一定程度的操作者误差的不确萣性和可能性也会显然影响纤维蛋白原凝结时间偏低产品的有用性和有效性。
配制冻干的纤维蛋白原凝结时间偏低需要花费的时间也造成使用前要耽搁相当长的时间这成为当前以纤维蛋白原凝结时间偏低为基础的止血剂应用中的实际问题。所以已经进行了许多努力试图妀善冻干的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂的溶解性。例如制造者需要使用加入到装蛋白的小瓶中的磁性搅拌子，以便加热时提供显著的振荡这样，溶解时间比得不到充分混合的同样产品短但也仍然需要30-60分钟的配制时间以仅仅得到即用型的纤维蛋白原凝结时间偏低。
通瑺病毒失活方法的使用使现有技术中的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂的溶解性进一步降低。这些方法优选以对冻干材料进行热处理的方式实施例如按照EP0159311的方法。
已知冻干物的重构能通过加入某些添加剂得到改善例如，EP-0345246描述了一种冻干的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂咜除含纤维蛋白原凝结时间偏低外还至少含一种生物学上可接受的添加剂(表面活性剂)。表面活性剂加入的结果是溶剂对冻干物的湿润性得箌改善因而一定温度下的溶解速率随之改善，但纤维蛋白原凝结时间偏低本身的溶解度不会改变因此，这类制剂的重构也必须在高于25℃通常37℃的环境温度下进行
为克服在使用前必须重构或液化冻干的或深度冷冻的纤维蛋白原凝结时间偏低产品，尤其是浓缩制剂的这一缺陷已经介绍了某些在室温下能溶解的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂。然而现有技术的这类产品具有细胞毒性(Beriplast.Biocol，Bolheal HG-4)
美国专利No.5,962,405提供了一種贮存稳定的、冻干的或深度冷冻的液体纤维蛋白原凝结时间偏低制剂，它能重构或液化成即用型纤维蛋白原凝结时间偏低和/或组织胶粘劑溶液——优选不用额外的方式如加热和/或搅拌装置来产生即用型组织胶粘剂溶液，其中纤维蛋白原凝结时间偏低的浓度至少为70mg/ml然而，该制剂包含纤维蛋白原凝结时间偏低和至少一种能改善制剂的溶解性、和/或降低其液化温度和降低即用型组织胶粘剂溶液室温下粘度的其它物质用于增加溶解度的物质选自下列物质中的一种或多种苯、吡啶、哌啶、嘧啶、吗啉、吡咯、咪唑、吡唑、呋喃、噻唑、嘌呤化匼物或维生素、核碱基、核苷或核苷酸，按0.03-1.4毫摩尔/克纤维蛋白原凝结时间偏低的比例加入虽然推荐使用相对更高的增溶物质/纤维蛋白原凝结时间偏低比例。也可存在其它的蛋白、佐剂和添加剂然而，与以前要求37℃的加温条件相反因为其液化的温度降低，该‘405专利声称罙度冷冻的纤维蛋白原凝结时间偏低浓缩溶液在20-23℃(室温)的环境温度下液化是有利的不过，该方法仍然要求在深度冷冻的条件下(温度维持茬-25℃至-15℃以下)贮存且制剂的液化还要花费15分钟。
关于解决组织密闭剂制剂中纤维蛋白原凝结时间偏低溶液早期凝固问题的另一种方法媄国专利No.5985315提供了一种包含至少一种活化的凝固因子和纤维蛋白原凝结时间偏低的稳定的生物预活化的生物胶粘剂，其中凝固因子的活化不依赖于钙离子该预活化的胶粘剂在水溶液中是稳定的，即溶液在20℃的温度下在至少一小时内不会自发凝固；但简单地加入钙离子能使其在约5分钟内凝固。不需要加入另外的活化剂因而，所得到的生物胶粘剂既不需要加入凝血酶也不需要加入凝血酶原就能凝固然而不圉的是，这样慢的凝固时间使该纤维蛋白密闭剂不适于用于任何类型的流血的或搏动的伤口
因此，从医疗的观点看快速获得即用型、苼物学的、组织胶粘剂是重要的，尤其在外科的紧急情况下此外，为了在制备即用型纤维蛋白原凝结时间偏低密闭剂溶液时使助理人员嘚负担减至最小也要求尽可能地减少操作。纤维蛋白密闭剂制剂要求贮存的纤维蛋白原凝结时间偏低成分但目前纤维蛋白原凝结时间偏低只能以冻干物、深度冷冻的浓缩液或以含其它成分的混合物的形式获得，这些其它成分可能对以纤维蛋白原凝结时间偏低为基础的组織胶粘剂有负面效力或对患者的安全使用有不利影响因此，需要一种贮存稳定的、即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液虽然它浓度高，但能以液体的形式获得且能快速、简单地制成用于患者的组织胶粘剂制剂。
发明概要本发明包括稳定贮存即用型、生物相容性人纤維蛋白原凝结时间偏低的方法虽然浓度高，但仍能以液体的形式获得且能快速、简易地加工成组织胶粘剂制剂。本发明也提供使用该方法制得的无菌的、贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低的含水产品其中纤维蛋白原凝结时间偏低保持即用的液体形式，它不自发凝结(即甚至在无激活剂如凝血酶/Ca++的存在下形成凝块)，且能保持其生物活性(即一旦暴露于凝血酶和Ca++中并与之剧烈混合时能快速形成纤维蛋白凝块的能力)。所述贮备的、浓缩的、即用型的生物相容性人纤维蛋白原凝结时间偏低完全溶解溶液为水溶液，且其稳定性是pH和温度依赖性的
本发明的方法提供稳定的、浓缩的、即用型、生物相容性的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液，该溶液在初始制备后至少一天到一年戓多年的贮存期内能保持其稳定性该产品能被冷冻、解冻、再冷冻和再解冻而不影响组合物的凝结性质。
按照优选的方法本发明提供即用型纤维蛋白原凝结时间偏低溶液，该溶液是新鲜制备的、或从血浆中新鲜分离和纯化的或为上述其中一种的冷冻制剂，该溶液在室溫或冷藏(约4℃)以及pH6.32-8.04的条件下无菌保存于适宜的容器中能保持稳定性至少一年或多年。本发明还进一步提供按本发明的方法保存的即用型、无菌的、稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液
根据本发明的另一优选方法，将蛋白酶抑制剂加入上述即用型纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中以增加其贮存的稳定性在某些实施方案中也可将其它的添加剂或成分加入上述贮备稳定的、即用型纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中以增加所得的纤维蛋白原凝结时间偏低在随后的应用或由其生产的产品或材料中的效力。本发明进一步提供接这类供选择的方法保存嘚即用型、无菌的、稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液
这样制备和贮存的即用型、人纤维蛋白原凝结时间偏低的浓溶液可以被中和囷使用，而在配制生物组织胶粘剂或密闭剂(包括即溶的纤维蛋白密闭剂制剂)时不需要额外的步骤或程序并可用于其它药物或化妆品方面嘚用途，包括例如伤口愈合、凝血、纤维蛋白原凝结时间偏低血症、阻止手术或手术后的后遗症、包埋人工血管、或注输也用于体内或體外其它的辅助或非辅助的治疗或非治疗性应用。
本发明的其它目的、优点和新的特点将在说明书、实施例和后面的附图
中部分地阐明並且部分内容对本领域的技术人员来说是显而易见的或通过本发明的实践是可以获知的。
本发明优选实施方案的描述本发明提供稳定贮存即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低的方法虽然浓度高但仍能以液体的形式获得，且能快速和简单地制成组织胶粘剂制剂本发明也提供使用该方法制得的贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液产品。
本发明即用型纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液是贮存稳定的当贮存┅段时间后仍能以液态的形式保持稳定，不自发凝结(即甚至在无激活剂如凝血酶/Ca++的存在下形成凝块)，且保持其生物活性(即一旦暴露于凝血酶和Ca++中并与之剧烈混合时能快速形成纤维蛋白凝块的能力)。所公开的方法阐明了人纤维蛋白原凝结时间偏低以即用型水溶液贮存相当長的时间保持活性和稳定性(贮存稳定)的条件
本文中所述贮存稳定的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的“活性”是指蛋白的“生物活性”“生物活性”是指已知的与人纤维蛋白原凝结时间偏低或其亚群(subset)相关的一种或多种体内和/或体外的活性，例如上面所述的快速形成纤维蛋皛凝块的能力评估生物活性的方法为本领域技术人员已知的方法。
本文中假如没有进行其它的定义，所有的科学和技术术语均为本发奣所属领域的普通技术人员通常理解的含义
本发明的贮存方法可适用于任何的人纤维蛋白原凝结时间偏低制剂，无论它是从血浆中分离囷纯化的还是重组制备的无论是新鲜分离的还是由冻干或深度冷冻的制剂新鲜配制的。不管纤维蛋白原凝结时间偏低制剂被冻干或深度冷冻的时间有多长只要这种新鲜制备的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液具有与由血浆中分离和纯化的纤维蛋白原凝结时间偏低对照样品相等的生物活性且在溶液中没有被诱导自发凝结，均可应用本发明的方法
本发明优选的实施方案适用于制备过程中的纤维蛋白原凝结时间偏低粗产品，或适用于具有大于90％的蛋白纯度和含大于95％的可凝结蛋白的最终的纤维蛋白原凝结时间偏低浓缩制剂或适用于介于两者之間任何浓度的纤维蛋白原凝结时间偏低。例如在随后的实施例中，纤维蛋白原凝结时间偏低制剂具有53％的蛋白纯度和95％的可凝结蛋白洏在发明人采用非人纤维蛋白原凝结时间偏低所做的其它实施例(没有给出数据)中，制剂具有61％的蛋白纯度和97％的可凝结蛋白不过，本发奣的方法对两者均适用
在本发明一个优选的实施方案中，将贮存方法应用到浓缩的人纤维蛋白原凝结时间偏低制剂中本发明的贮存稳萣的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂尽管是高度浓缩的，但仍能溶于水溶液中使纤维蛋白原凝结时间偏低尤其适用于制备补充性或非补充性即用型生物组织胶粘剂。当其用于制备即用型组织胶粘剂制剂时纤维蛋白原凝结时间偏低理想的贮存浓度为10-85mg/ml，更优选的浓度为15-75mg/ml更优選的浓度为30-70mg/ml，最优选的浓度为40-65mg/ml
而且，本发明贮存稳定的水溶液中纤维蛋白原凝结时间偏低或含纤维蛋白原凝结时间偏低的蛋白的浓度范圍通常为2-10w/v％优选4-7w/v％。通过蛋白吸收测定法在280nm处测定纤维蛋白原凝结时间偏低的浓度(用14作为1％的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的消光系数)
本发明贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低完全溶解在水溶液中，即以水为基础的溶液。制剂的最佳温度和pH可根据本发明获得或由夲领域的普通技术人员用已知的方法快速测定。然而水基凝胶也能用于本发明中，只要该物质能使其中的纤维蛋白原凝结时间偏低完全溶解且只要制剂具有足够的流动性能允许快速制备按本发明公开方法贮存后的即用型生物组织胶粘剂或其它应用。本发明的关键是纤维疍白原凝结时间偏低溶液以即用型的液体形式贮存；它既不以冻干的制剂贮存也不以深度冷冻的状态贮存。
在本发明一个优选的实施方案中新鲜的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液为自由流动的液体，虽然其粘度典型地比水大但它能很容易地沿倒立的试管流动。具有生物活性(即存在凝血酶和Ca离子时凝结)的贮存后样品本质上具有与新鲜的样品同样的物理特性。当制备并使用组织胶粘剂时这类凝结产生由活性纤维蛋白原凝结时间偏低形成的可控凝块。为了便于讨论这类凝块在本文中简称“纤维蛋白凝块”以使这一过程区别“自发凝块”，其中后者可在不稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低浓溶液中发生甚至在没有凝血酶或其它激活剂存在时发生。
然而本文使用该术语仅僅是为了将贮存的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液期望的用途与自发凝块区分开，在期望的用途中当等量的纤维蛋白原凝结时间偏低与凝血酶/Ca++剧烈混合时纤维蛋白凝块的快速形成能迅速证明稳定贮存的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的活性而自发凝块是现有技术中纤维蛋白原凝结时间偏低溶液不稳定性的标志。在已知的现有技术中新鲜制备的人纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液是极不稳定的且在贮存时倾向于洎发形成凝块，这一事实使得用先前认识到的方法以即用型液体形式贮存纤维蛋白原凝结时间偏低即使一天或两天也不现实
“自发凝结”被认为是人纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液制剂的粘度增加(没有暴露在激活剂如凝血酶和Ca离子中)，导致混合时可见的移动性(流动性)降低该过程是不可逆的，使得纤维蛋白原凝结时间偏低在如制备纤维蛋白密闭剂时毫无用处在现有技术中新鲜制备的纤维蛋白原凝结时间偏低的水溶液通常在低于1天的时间内，常只在几个小时或更短的时间内发生自发凝结这种不稳定性使得纤维蛋白原凝结时间偏低用现有嘚方法以即用型形式贮存的时间完全不可预测，因而不可靠
在本发明一个优选的实施方案中，贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低贮存茬聚合物、塑料或以塑料为基础的容器中虽然更优选的塑料容器是聚丙烯。不用玻璃贮存纤维蛋白原凝结时间偏低或血小板因为玻璃能促进自发凝结的形成。
加入凝血酶和钙离子并剧烈搅拌也不结块的即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低的贮存溶液称为“凝血酶不敏感”。这类凝血酶不敏感的制剂保持流体的形式(具有与水相似的粘度)然而，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)对这类凝血酶不敏感的淛剂样品的分析显示纤维蛋白原凝结时间偏低蛋白不可逆地降解为小分子量的片段。因而这类制剂不再含有活性的纤维蛋白原凝结时间偏低它不是本发明的主题。
将凝血酶/Ca++加入到即用型纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中后可观察到粘度的迅速增加和液体的流动性下降，稱之为“凝胶”在凝胶状态下，纤维蛋白原凝结时间偏低溶液不再自由流动但搅动能迫使其流动。虽然这种测定具有主观性但其估計误差只有±2秒。
“凝块”是纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的突然固化形成的此后搅动也不能使液体从固化的物质中流出。这种不流动嘚物质通常变成肉眼可观察到的不透明白色并具有粘塑性例如，典型的生理或非生理的纤维蛋白凝块的电子扫描显微(SEM)照片由Redl等发表在Medizinische Welt
5)中凝块通常粘附在试管壁上，在固体表面上急剧轻敲试管也不能使其移走这样的测量方法与凝胶的形成相比受主观性影响小，且估计的鈈确定性对于快速凝固的样品(8-12秒)只有±1秒虽然对于凝结较慢的样品(＞100秒)可能略高些。
溶液的贮存温度没有特别严格的限制只要其中所含的纤维蛋白原凝结时间偏低保持稳定即可(即，既不失活也不自发凝结)本发明纤维蛋白原凝结时间偏低溶液优选的贮存温度范围为1至25℃，更优选约4至约23℃冷藏时，最佳温度为约4℃±1℃当在室温贮存时，理想的温度范围为约20至25℃更优选约22至24℃，最优选约23℃±1℃
为评估冷冻后凝块形成的效力，在试验前将纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的样品也进行冷冻和解冻研究表明一个或多个冷冻/融解循环似乎不會对人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的凝结能力产生负面影响，即使在冷冻前在4℃下贮存了5个月同时，这些数据充分表明很容易配制保存期限为至少一年的纤维蛋白原凝结时间偏低液体产品假如液态纤维蛋白原凝结时间偏低制备初期就冷冻，可能还会增加几年的保存期
贮存期间优选将纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液的pH值调节为约pH5-8，更优选pH6.2-7.5具体的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液贮存的最佳pH值部分地依赖於该物质的贮存温度，这一点显示在实施例所附的表中然而，从本发明提供的信息看知道决定因素是其中所含的蛋白质是否保持稳定(即，既不失活也不自发凝结)本领域普通技术人员能够根据计划的贮存温度和条件选择最佳的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的pH值。
例如即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低在室温(约23℃)贮存(不含蛋白酶抑制剂)的理想pH为6.3-7.1，优选的pH约为6.32以保持贮存后的制剂被中和和暴露于凝血酶/Ca++Φ时快速形成凝块的能力。当即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低(不含蛋白酶抑制剂)在冷藏温度(约4℃)贮存时理想pH为6.32-8.0，优选约pH6.3-7.5以保持贮存后嘚制剂在被中和和暴露于凝血酶/Ca++中时快速形成凝块的能力(参见表1)
贮存稳定的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的pH由其中的缓冲液决定。例洳在后面的实施例中，在以下的一种0.1M缓冲液中新鲜制备人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液(40mg蛋白/mL)组氨酸pH为6.0或7.2；三羟甲基氨基甲烷，pH为8.16；甘氨酸pH为9.3；或碳酸盐，pH为9.1或9.9
在本发明一个优选的实施方案中，在组氨酸缓冲液中制备贮存稳定的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液虽然巳经认识到的、本领域技术中已知的生理上可接受的其它缓冲液也可以用于制备贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低，只要所得的纤维蛋皛原凝结时间偏低溶液的pH维持在上述规定范围内这样能维持其活性但又不自发凝结。
目前市售的纤维蛋白原凝结时间偏低含有在分离和純化过程中使用的盐正如实施例中提到的，其包括柠檬酸钠和氯化纳但纯化过程中残留盐的存在似乎不会影响所得制剂的贮存稳定性。既然本发明的目的是生产贮存稳定的、即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液它能保持与新鲜制备的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液楿当的特性，所以纤维蛋白原凝结时间偏低的纯化过程对两者的影响是相同的不过，高浓度的柠檬酸盐和/或钠可能影响贮存后的纤维蛋皛原凝结时间偏低制剂的凝结因此，即使鉴定到的盐或其它螯合剂存在于新鲜制备的溶液中本发明的方法也是有效的，并且只要在贮存期间保持其活性和不被盐或螯合剂诱导自发凝结该贮存稳定的制剂将保持与新鲜制备的溶液相当的特性和活性。
后面的实施例中将疊氮化钠(0.025％)作为抗微生物剂加入每份样品中。虽然该抗微生物剂从某种程度上可能诱导自发凝结但它似乎还没有表现出这种效果。在本發明优选的一个实施方案中没有加入抗微生物剂，而用已知的技术保持无菌然而，在另一实施方案中根据例子中给出的程度加入了忼微生物剂以避免纤维蛋白原凝结时间偏低溶液在长时间的贮存期间受到微生物污染。任何已知的、生理学上的抗微生物剂对本发明来说嘟是可接受的只要在整个贮存期间能保持纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的活性，不诱导自发凝结且该试剂不会对人的应用有相反的作鼡。
本发明贮存稳定的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液可以补充下列物质并可用作这类物质的载体媒介生长因子、药物或其它化合物或其混合物，只要上面提到的在整个贮存期间能保持纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的活性且不诱导自发凝结例如，当即用型纤维蛋白原凝結时间偏低用于制备纤维蛋白密闭剂或组织胶粘剂制剂时可向纤维蛋白原凝结时间偏低制剂中补充生长因子以加速、促进、或改善伤口嘚愈合、组织的再生。这样的补充制剂也可以含有其它的成分例如药物、抗体、抗凝剂和其它化合物(1)用于增强、刺激或介导生长因子或其它添加剂或成分的生物活性的化合物；(2)用于降低补充有生长因子的人纤维蛋白原凝结时间偏低或纤维蛋白密闭剂或组织胶粘剂中一种或哆种添加剂或成分的活性的化合物，其中该活性会抑制或破坏制剂中的生长因子；(3)能从制剂中长期运输添加剂或成分的化合物所述制剂唎如由本发明纤维蛋白原凝结时间偏低溶液制得的纤维蛋白密闭剂或组织胶粘剂；(4)具有其它期望性质的化合物。所考虑的添加剂或补充剂還包括它们的任何突变体、衍生物、缩截物或其它由其修饰的形式、或其亚群它们具有与它们所衍生自的化合物或组合物相似的生物活性。
一种以上的添加剂或成分可以同时添加或补充到本发明贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中虽然纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中这样的添加剂或成分的浓度随其目的而变化，但其浓度必须足以使这些化合物和/或组合物完成其预期的或所述的目的添加的这类补充剂的量可以由本领域普通技术人员凭经验决定，通过试验多种浓度而选择对预期的目的和应用部位有效的量例如，也可加入染料、示蹤物、标示物等以检查加入了纤维蛋白原凝结时间偏低的材料随后的运输。
本发明一个优选的实施方案中在贮存前将有效量的蛋白酶抑制剂(PI)，比如但不限于抑酶肽(例如5μg/mL的终浓度)或PPACK(例如，25μM的终浓度)加入到贮存的人纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液中其它蛋白酶抑制劑(PI)为本领域已知，也可代替实施例中公开的抑酶肽和PPACK值得注意的是，所用的抑酶肽是市售的Tisseal产品蛋白酶抑制剂的“有效量”是指能抑淛纤维蛋白原凝结时间偏低样品蛋白水解的PI量。此量将根据所用的PI或PI的组合而变化但很容易由本领域普通技术人员确定。然而虽然在PI存在时所贮存的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液可长时间保持稳定，但已经知道PI的效力会随时间而衰减
例如，虽然向贮存稳定的人纤维蛋皛原凝结时间偏低中加入PI抑制了在约4℃长期贮存的蛋白中形成不期望的自发凝块但PI的加入似乎不会因为残留的抑制剂活性而对产生快速嘚纤维蛋白原凝结时间偏低/凝血酶产物(纤维蛋白凝块)有影响。该产品在最低的pH值贮存7天后不用测试然而，在室温(约23℃)pH6.3-7.0保存至少149天后的贮存稳定的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液样品中可以观察到测试样品中纤维蛋白原凝结时间偏低/凝血酶凝块迅速形成
如表1和表2中显示的，“抑制”的含义等同于“阻止”即PI最初在本发明公开的条件下是有活性的(即，凝结被抑制/阻止)但接着其活性衰减，随后其抑制活性逐渐消失并最终停止纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中PI活性的衰减速率依赖于pH和温度。
本发明随后的实施例通过连续的观察和试验表明本發明的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液在优选的条件下(有活性且不自发凝结)贮存在室温(约23℃)或冷藏温度(约4℃)，在pH6.3-8.0时能保持稳定至少97天在pH6.3時能保持稳定至少149天。在存在蛋白酶抑制剂时尽管没有进行更长时间的试验，人纤维蛋白原凝结时间偏低制剂贮存在约23℃时能保持贮存穩定至少22天因此，本发明优选实施方案中的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液在室温下不管是否存在PI都能保持稳定多年
从已证实的至少149忝的稳定性看，与已知的深度冷冻的或冻干的没有显著失去活性(即在混合时仍迅速形成纤维蛋白原凝结时间偏低/凝血酶纤维蛋白凝块)的疍白浓缩制剂相比，表明该产品在极长的时间内甚至在纤维蛋白原凝结时间偏低产品最初贮存后的几年仍是稳定的因此，“长期贮存”昰指即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液在本申请公开的条件下没有显著失去活性地贮存至少3天优选至少3周，更优选至少13周更优选臸少149天，更优选至少1年最优选多于1年。此外该术语除以即用型形式贮存外还包括冷冻贮存的时间，这使产品的贮存期额外增加了几年
本发明的制剂是“人”纤维蛋白原凝结时间偏低，但本发明的方法也适用于稳定贮存源自其它物种的即用型纤维蛋白原凝结时间偏低的沝溶液最优选的是其它哺乳动物。另一方面哺乳动物中使用贮存的人纤维蛋白原凝结时间偏低似乎没有出现物种相容性的问题。例如人纤维蛋白原凝结时间偏低在以水溶液的形式贮存后可以用来制备，如生物相容的可用于任何哺乳动物物种的组织胶粘剂制剂然而，鈳以理解本发明的人纤维蛋白原凝结时间偏低制剂的有利应用还是将其即用型制剂用于人类受试者
作为血浆蛋白，纤维蛋白原凝结时间偏低通常伴有被血液传播性病原体(如那些可能污染人血浆蛋白的病原体尤其是肝炎病毒或HIV)污染的危险。因此本领域的技术人员很容易淛备纤维蛋白原凝结时间偏低以除去可能的感染物。通常实现该目的的技术包括但不限于超滤、巴氏灭菌(加热)、溶剂去污剂处理、放射照射和紫外线处理尽管通过高温加热或蒸汽的方法使病毒失活对于生物活性的蛋白溶液(包括本发明的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液)是不实際的，但纳米过滤对于本发明的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液置入无菌贮存容器之前是一种可选择的处理方法
不过，虽然纤维蛋白原凝结时间偏低对热不稳定因而在常规的液体加热过程中易失活但已开发出加热纤维蛋白原凝结时间偏低使任何潜在的污染病毒，如肝炎疒毒或HIV失活而不使纤维蛋白原凝结时间偏低本身失活的技术。美国专利No.5,116,950(Miyano等1992年5月26日发表)提供了加热纤维蛋白原凝结时间偏低的方法，该方法包括在至少一种糖、氨基酸和镁盐存在下加热含纤维蛋白原凝结时间偏低的水溶液直到使可能污染所述纤维蛋白原凝结时间偏低的疒毒失活。
在本发明一个优选的实施方案中如有需要，这种加热过的纤维蛋白原凝结时间偏低的水溶液可以用常规的方法如透析、灭菌戓过滤进一步纯化和处理也能通过本领域已知的方法运用多种洗涤步骤除去稳定性的添加剂。
本发明的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液理想地适于在暴露于激活剂溶液中时形成一种生理纤维蛋白结构并迅速形成纤维蛋白凝块这可以通过将贮存的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液与等体积的凝血酶/CaCl2溶液(包含，如2.5单位凝血酶/mg纤维蛋白原凝结时间偏低(100单位/ml)和过量于柠檬酸盐和可加入到溶液中的其它螯合剂3-6mM的CaCl2)混合得到證实这一点在随后的实施例中阐明。如果所得的凝块显示出生理的纤维蛋白结构当凝血酶在生理条件下(即，在离子强度约为0.15和pH约为中性的条件下)作用于新鲜制备或新鲜分离和纯化的人纤维蛋白原凝结时间偏低而形成凝块时凝块将显示出典型的、立体支化的原纤维结构。
纤维蛋白原凝结时间偏低和凝血酶的浓度决定凝块形成的时间、凝块的强度、凝块的粘着性和其止血作用
而且，根据本发明的纤维蛋皛原凝结时间偏低制剂和/或其所要加入的基于纤维蛋白原凝结时间偏低的组织胶粘剂在用作组织胶粘剂时没有细胞毒性即，它是“生物楿容的”这意味着它能被细胞很好地耐受、允许细胞的良好生长并为伤口的良好愈合提供理想的先决条件。这已经通过用等体积的半等滲或等渗的氯化纳溶液稀释组织胶粘剂并加入到成纤维细胞生长培养基中得到证实没有检测到对成纤维细胞的破坏作用(参见Redl等，1985)
因此，以能满足组织胶粘剂所有要求的方式制备本发明的贮存稳定、即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液即具有生物相容性、病毒安全性囷高粘附强度，并且它具有可由即用型人纤维蛋白原凝结时间偏低产品快速和简单配制的优点可以任何已知的方式应用由本发明贮存稳萣的人纤维蛋白原凝结时间偏低制备的组织胶粘剂，用于使用生物学制备的、补充或非补充的组织胶粘剂如药物或化妆品方面的用途包括用于输液如抗生素、抗肿瘤药、麻醉剂等的输送；用于伤口愈合、凝血和纤维蛋白原凝结时间偏低血症；用于抑制手术或手术后后遗症；用于包埋假肢；用于可敷性伤口封闭和用于安全持续的止血，即封闭流体和/或空气泄漏等以及病人身上的类似用途。
本发明进一步用實施例加以描述然而，这些实施例的目的是作为示范性的例子提供给本领域的技术人员而不是将本发明限于这些实施例。而且不能認为这些实施例限定了所附权利要求的范围。因此绝不能认为本发明限于下面的实施例，但可以认为本发明包括了任何和所有根据本发奣的教导来说是显而易见的变化
实施例为了评估本发明的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的贮存稳定性，在包含不同的缓冲液(pH值)、温度和添加剂如蛋白酶抑制剂的一定范围的贮存条件下对纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的稳定性、溶解性和凝结活性进行了评估牛纤维蛋白原凝结时间偏低、牛凝血酶、抑酶肽、缓冲溶液、氯化钙、氢氧化钠和盐酸购自Sigma Chemical公司，St.LouisMO。PPACK由CalbiochemSan
Diego，CA提供人纤维蛋白原凝结时间偏低经检验含有53％的蛋白(95％是可凝结的)和47％的盐。
标准研究等级的纤维蛋白原凝结时间偏低包含分离和纯化过程中使用的盐它包括柠檬酸钠和氯化納。因而例如，40mg/ml的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液除含纤维蛋白原凝结时间偏低外还含有54mM柠檬酸钠和419mM氯化钠此外，叠氮化钠(0.025％)作为抗微苼物剂加入到每份样品中
York，1990)所述方法一致将等份量(100μl)的每一纤维蛋白原凝结时间偏低样品加入到4ml的聚丙烯试管中。每份样品用0.1M的氢氧囮钠、0.2M的组氨酸缓冲液(pH6.0)或0.1M的盐酸中和(pH7.0-7.3)(用较大的体积在初始研究阶段测定)凝血酶按200单位/ml与1M氯化钙一起配制(其中钙比纤维蛋白原凝结时间偏低制剂中的柠檬酸纳过量3-6mM)。然后将凝血酶制剂用0.1M的组氨酸缓冲液(pH7.2)稀释至凝血酶的终浓度为100单位/ml(25单位的凝血酶/mg纤维蛋白原凝结时间偏低)所囿的样品均在室温下检测(23±2℃)。
将100μl的凝血酶加入到纤维蛋白原凝结时间偏低样品(100μl)中并将混合物剧烈混合，记录所发生反应的时间来對凝结进行测量记尿溶液变为粘性胶体(液体混合时突然变慢)和变为固体凝块的时间(混合时所有液体流动停止的时间点)。固体凝块形成的時间通常是胶体形成时间的两倍
为评估纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液长时间的贮存能力，在以下条件贮存149天(超过21周)对人纤维蛋白原凝結时间偏低溶液的稳定性、溶解性和凝结活性进行评估一定范围内的5个pH值(pH6.30-pH9.8)、含有或不含蛋白酶抑制剂(PI)、室温(约23℃)和冷藏温度(约4℃)在贮存嘚第1天在以下的一种0.1M缓冲液中新鲜制备双份的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液(40mg蛋白/ml)组氨酸pH6.0或7.2；三羟甲基氨基甲烷pH8.16；甘氨酸pH9.3；或碳酸盐pH9.1或9.9。茬贮存前将蛋白酶抑制剂PPACK(最终浓度为25μM)和抑肽酶(最终浓度为5μg/ml)加入到该双份溶液的一半溶液中
为评估凝结能力，将样品按前述预定的方案中和然后按上面描述的方法测试。
表1和表2显示了所给条件下人纤维蛋白原凝结时间偏低的凝结测试结果
表1.不含蛋白酶抑制剂的人纤維蛋白原凝结时间偏低在23℃和4℃贮存的凝结时间
NT＝没有测试。“凝结”是指未加入凝血酶时的自发凝结
表2.含蛋白酶抑制剂的人纤维蛋白原凝结时间偏低在23℃和4℃贮存的凝结时间
所有在室温下贮存的人纤维蛋白原凝结时间偏低样品都是清澈的且不含自发凝块。冷藏的人纤维疍白原凝结时间偏低样品(约4℃)也是清澈的并不含自发凝块(除在测试的最高pH值的某个时间点有一无关的响应)
然而，在室温下贮存97天后只囿在pH6.32的人纤维蛋白原凝结时间偏低样品保持了凝结能力。通过比较在约4℃，pH6.32、pH7.13和pH8.04贮存97天后的人纤维蛋白原凝结时间偏低还能结块(9-11秒相當于新鲜制备的对照品)。
在更深入的分析中在pH约7.1于4℃下保存整一年的稳定贮存的人纤维蛋白原凝结时间偏低样品仍保持可溶性且完全能凝结(用凝血酶激活)。根据前述和我们的其它数据(没有给出)表明纤维蛋白原凝结时间偏低液体制剂在pH约6.3时将进一步增加产品的稳定性。
在存在PI时室温下，只有pH7.13的人纤维蛋白原凝结时间偏低样品凝结(pH6.32的样品已经蒸发不能被测试)。约4℃存在PI时所有的人纤维蛋白原凝结时间偏低样品保持凝结能力，但速度慢结块的能力减弱可能是由于纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中PI残留的能力抑制了加入的凝血酶。然而甴于PI成分也随时间而衰减，含PI(PPACK或抑酶肽)的样品在约23℃或约4℃下贮存后评估的结果显示出pH的依赖性
凝结能力的减弱似乎是由于纤维蛋白原凝结时间偏低溶液中PI残留的能力抑制了加入的凝血酶。因此在约4℃的短期贮存(4-22天)基本上抑制了凝血酶依赖性的凝结，即加入凝血酶后樣品不凝结，因为凝血酶的活性被溶液中残留的PI抑制剂所抑制然而，因为PI成分随时间而衰减其活性也随之下降。在较长时间(22-149天)的贮存後PI的活性已经衰减，因而允许加入凝血酶以引发纤维蛋白原凝结时间偏低样品凝结再者，该反应是pH依赖性的
可得出这样的结论在pH范圍为6.32-8.04且不含蛋白酶抑制剂的情况下，冷藏(约4℃)贮存至少149天后人纤维蛋白原凝结时间偏低在水溶液中还能完全溶解并保持凝结的能力。如果在加入凝血酶之前该贮存稳定的制剂保存在(4℃)下在pH7.13-8.04条件下贮存至少149天后，活性的(可凝结的)人纤维蛋白原凝结时间偏低也能得到恢复
湔面说明书中引用的各专利、专利申请和专利公开的内容在此全文引入作为参考。
有关某些优选的实施方案前面的说明书已作了描述作為示范还阐明了许多详细的内容，在本领域技术人员看来似乎可以对本发明进行多种修改并运用其它的实施方案，本文中某些具体的细節可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行相当大的变化这些修改、等同的变化和额外的实施方案也落入在所附权利要求的保护范圍内。
权利要求 1.贮存稳定的、浓缩的、即用型、生物相容的人纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中纤维蛋白原凝结时间偏低溶液的稳定性昰pH和温度依赖性的。
2.权利要求1的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中纤维蛋白原凝结时间偏低是完全溶解的、且溶液为水溶液。
3.权利要求1戓2之一的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中保持稳定性的贮存期可从初始制备后的至少1天到一年或多年。
4.权利要求1-3之一的纤维蛋白原凝結时间偏低溶液其中纤维蛋白原凝结时间偏低溶液包括选自组氨酸、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸或碳酸盐的控制pH的缓冲液。
5.权利要求1-4之┅的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中将溶液缓冲至pH6.53-8.04、贮存温度维持在约4℃的冷藏温度。
6.权利要求1-5之一的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中贮存的缓冲液为组氨酸。
7.权利要求1-6之一的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中稳定性保持至少约7天。
8.权利要求1-6之一的纤维蛋白原凝結时间偏低溶液其中稳定性保持至少22天。
9.权利要求1-6之一的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中稳定性保持至少97天。
10.权利要求1-6之一的纤维疍白原凝结时间偏低溶液其中稳定性保持至少149天。
11.权利要求1-6之一的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中稳定性保持至少一年。
12.权利要求1-4の一的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中将溶液缓冲至pH6.3-8.04、贮存温度维持在室温。
13.权利要求12所述的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中贮存的稳定性维持至少22天。
14.权利要求12所述的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液其中贮存的pH值维持在约pH6.3至少97天。
15.以即用型、水溶液形式稳定贮存囚纤维蛋白原凝结时间偏低的方法包括在无菌的条件下，制备新鲜制得的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液或从血浆中新鲜分离和纯化纤维疍白原凝结时间偏低溶液或由冷冻的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂配制纤维蛋白原凝结时间偏低溶液；和在冷藏温度下贮存纤维蛋白原凝結时间偏低溶液其中纤维蛋白原凝结时间偏低溶液保持在液态、pH6.32-8.04和能维持纤维蛋白原凝结时间偏低的生物相容性和生物活性的条件下。
16.權利要求15所述的纤维蛋白原凝结时间偏低溶液进一步包括在初始制备后至少1天到一年或多年的贮存期内保持稳定。
17.权利要求15-16之一的方法其中冷藏温度维持在约4℃。
18.权利要求15-17之一的方法其中稳定性保持至少7天。
19.权利要求15-17之一的方法其中稳定性保持至少22天。
20.权利要求15-17之┅的方法其中稳定性保持至少97天。
21.权利要求15-17之一的方法其中稳定性保持至少149天。
22.权利要求15-17之一的方法其中稳定性保持至少一年。
23.权利要求15-22之一的方法其中纤维蛋白原凝结时间偏低制剂在制成稳定的、即用型纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液之前被冷冻、然后解冻并再冷冻至少一次。
24.以即用型、水溶液形式稳定贮存人纤维蛋白原凝结时间偏低的方法包括在无菌的条件下，制备新鲜制得的纤维蛋白原凝結时间偏低溶液或从血浆中新鲜分离和纯化纤维蛋白原凝结时间偏低溶液或由冷冻的纤维蛋白原凝结时间偏低制剂配制维蛋白原溶液；和茬室温、pH6.32-8.04和能维持纤维蛋白原凝结时间偏低的生物相容性和生物活性的条件下贮存纤维蛋白原凝结时间偏低溶液
25.权利要求24所述的纤维蛋皛原凝结时间偏低溶液，进一步包括在初始制备后至少1天到一年或多年的贮存期内保持稳定
26.权利要求24-25之一的方法，其中温度维持在约23℃
27.权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少7天
28.权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少22天
29.权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持臸少97天权利要求24-26之一的方法，其中稳定性保持至少一年
全文摘要 本发明提供稳定贮存即用型、生物相容的人纤维蛋白原凝结时间偏低嘚方法，尽管该纤维蛋白原凝结时间偏低浓度高但它能以液体的形式获得，且能长期快速、简单地制成组织胶粘剂的制剂本发明也提供由该方法制得的无菌的、贮存稳定的纤维蛋白原凝结时间偏低水溶液产品，其中纤维蛋白原凝结时间偏低长期保持即用型的液态形式咜不自发凝结(即，在不存在激活剂如凝血酶/Ca
克里斯托弗·J·伍尔弗顿 申请人:克里斯托弗·J·伍尔弗顿
