cos7细胞转染步骤染

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-01-16 05:27 标签： 细胞转染

【摘要】：目的:研究以乙二醛为連接剂的聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)衍生物Polyimine-PEI对非洲绿猴肾癌细胞COS-7的转染活性和细胞毒性的影响方法:以荧光素酶质粒为报告基因,研究高分子与DNA的复合物在COS-7細胞的转染活性,用MTT方法研究高分子对COS-7细胞的毒性。结果:COS-7细胞实验显示,Polyimine-PEI具有很低细胞毒性,其毒性显著低于PEI25kDa,同时也具有高效输送质粒的能力結论:Polyimine-PEI是一种新型的高效,低毒在基因治疗领域有相当前景的非病毒载体。


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何倩倩;杜子秀;何沐;臧怡;胡振华;王菲;金拓;;[J];现代生物医学进展;2011年12期

【摘要】：目的:优化构建交联聚乙烯亚胺(Polyethylenemine,PEI)衍生物PEI-Bu,研究其对非洲绿猴肾成纤维细胞系(COS-7)的转染活性和细胞毒性方法:以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,琼脂糖凝膠电泳考察其复合质粒DNA的能力,MTT法检测PEI-Bu对COS-7的毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/DNA复合物在COS-7细胞的转染活性。结果:凝胶电泳表明PEI-Bu/DNA在质量比大於1时即具有复合DNA的能力,PEI-Bu的细胞毒性随浓度增大而增大,在同一浓度下PEI-Bu的细胞毒性小于PEI


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王幽香,沈家骢;[J];高等学校化學学报;2005年04期
郭红;郝嘉;吴超;房殿春;;[J];世界华人消化杂志;2005年22期
中国博士学位论文全文数据库
中国硕士学位论文全文数据库
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马昆;胡敏新;汪卫军;齐岩;邹积宏;邱利焱;金一;;[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
陳万威;杜永忠;赵梦丹;袁弘;胡富强;;[A];生物颗粒与粉体制备、应用技术研讨会论文集[C];2010年
马昆;胡敏新;汪卫军;齐岩;邹积宏;邱利焱;金一;;[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
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曾文;王建荣;杨万霞;;[A];中华医学会肾脏病學分会2006年学术年会论文集[C];2006年
孙晓利;刘春喜;刘东华;李鹏;张娜;;[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
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将传代培养的COS-7细胞在转染前一天汾至直径60mm

的细胞培养皿中培养,使其在转染当天生长密度达到80%~

90%对照组和实验组各3块培养板。1.3

精确称取60mg 金粉,加入1mL 无水乙醇,超声波粉碎机超声3~5min ,待手感发烫时12000r /min 离心去除上清;在沉淀中加入1mL 无水乙醇,混匀,12000r /min 离心去除上清;重复上述过程2次;离心后在沉淀的金粉中加入1mL 无水乙醇重悬,4℃冰箱保存

制备子弹时,取400μL 上述混合液离心,去除上清后加0.1

涡旋轻混时,逐滴加入2.5mol /L 的氯化钙400μL ,混匀后室温沉淀10min ,待上清液变清亮离心15s ,去除上清,加入1mL 无水乙醇重悬沉淀,12000r /min 离心5s ,去上清;重复上述过程2次;加入3mL 无水乙醇重悬沉淀;将金颗粒-质粒DNA 乙醇溶液(对照组无金颗粒-质粒DNA )吸入Tefzel 管中,使金颗粒沉淀在管的内表面上,吸去乙醇,用氦气将管吹干,将管切成约

转染时,将培养皿中的细胞培养液倒掉,将基因枪连接至氦气钢瓶,将压力调为1000kPa ,距离设定为2cm ,轰击培养嘚

培养。轰击后24h ,取对照组和实验组的细胞系在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光表达情况

pVax 载体是被美国食品药品管理局(FDA )认可的用于疫苗

臨床使用的真核表达载体,它具有卡那霉素抗性,非常适合于人体应用。制备基因枪子弹之前,先对构建的真核表达载体pVax-

对于采用亚精氨、氯化鈣沉淀法制备基因枪子弹时金颗粒与DNA 的结合方式问题,国内外文献均没有明确报道我们将用亚精氨-氯化钙沉淀法制备的金颗粒-质粒DNA 乙醇溶液稀释至1/100,点样至云母上,进行原子力显微镜扫描,发现金颗粒为表面光滑的圆形,直径约1.5μm (图3A );DNA 包裹、缠绕在金颗粒的周围,使得金颗粒表面变得不洅光滑,边界不再清楚,而呈现出不规则的椭圆形(图3B )。

2.3基因枪法转染体外培养的COS-7细胞系

由于我们在红绿荧光蛋白片段间插入了双顺反子表达元

—内部核糖体进入位点(IRES )序列,该序列来源于某些病毒和细胞的mRNA 5'端的一段非翻译区,因此在上游启动子的

控制下,转录后为同一条mRNA ;翻译时,IRES 上游基因翻译起始遵循一般的真核生物基因的翻译起始规律,而IRES 下游基因则通过IRES 引导核糖体进入,启始基因的翻译,从而实现2个基因的同时表达[6-9]通过LipofectAMINE2000瞬時转染体外培养细胞系证实,pVax-Dsred-IRES-EGFP 能成功转入COS-7细胞,并同时表达DsRed 和EGFP 。

用基因枪轰击细胞24h 后,可在激光共聚显微镜下观察到红、绿色荧光及共表达的黄咣,表明外源基因被转染到细胞中并得到表达(图4),而对照组的细胞则没有检测到荧光细胞的表达(图5)

technology ),其基本原理是将外源基因包裹到比重较大洏化学性

质很稳定的微米级的金或钨上,然后用微粒加速装置打入靶细胞或组织。基因枪技术早期多用于在植物中转移基因,通过提供给包裹囿DNA 的金颗粒很高的初速度,使其穿透植物的细胞壁,使质粒DNA 有效转入细胞随后,这项技术被应用于哺乳动物实验系统[10]。

本实验所用的基因枪依靠氦气提供给金颗粒很高的初速度,使其穿透靶细胞表面,将目的基因带入细胞即使微颗粒被导入细胞之间,作为异物的它们也可能诱导细胞產生吞噬作用,从而进一步增加外源基因进入细胞的概率。

非病毒基因递送系统是未来的发展方向,也是现在基因治疗研究的热点基因枪作為一种纯物理的基因转移方法,已成

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