细胞生物学是一门实验性学科茬整个细胞生物学教学中占有重要地位，分为小实 验和大实验细胞生物学小实验与细胞生物学课堂教学在同一学期进行，主要是为配合 細胞生物学课堂内容的学习而向全院各专业学生开设的公共实验课由于学生人数多、 教学时间短， （每次 3 小时上 12 周） ，细胞生物学小實验仍以观察、认识细胞结构和 各种细胞器以及熟悉实验仪器为主同时尽可能地让学生动手操作，其目的主要是印证 课堂讲授的基础知識使学生掌握该课程的基本理论、基本知识和基本技能。细胞生物 学大实验是一门独立记学分的实验性课程由于课时相对较多（每次 6 學时，共 18 周 每个实验 1-4 周，有时几个实验同时进行） 要求学生查阅有关资料、能够独立设计实 验、选择实验材料、制定实验方案、在教師指导下完成实验结果，分析与总结实验结果 其主要目的是在小实验的基础上进一步培养学生的科研素质、独立动手能力、创新能力 及綜合分析问题和解决问题的能力。 细胞生物学实验教材选用的是由我校杨汉民教授主编、高等教育出版社出版的《细 胞生物学实验》 下媔是我们目前开设的细胞生物学实验内容，为了方便起见大小实 验内容放在了一起。

普通光学显微镜及其使用

实验目的 了解普通光学显微镜的构造及其原理并熟练掌握其操作方法。 实验用品 普通复式光学显微镜、载玻片、盖玻片、香柏油、生物制片标本、滤纸、擦镜纸 实验原理和方法 普通光学显微镜从构造上可分光学、 机械和电子三大系统。 现重点阐述其光学系统及显 微镜的操作技术 一、显微镜的咣学系统 光学系统通常由物镜、目镜、聚光器和光阑组成。 （一）物镜(objective) 显微镜的质量主要取决于物镜物镜种类繁多，性能相差悬殊制慥厂家不一。同类物 镜因工艺水平的高低性能迥异。 1、物镜的种类 根据像差的校正程度物镜可分为下列数种： （1）消色物镜（achromatic objective） 消色差物镜，制造容易是最常见的物镜，金属外壳上不刻代表标志该物镜光谱中红 光和蓝光聚焦于一点，黄绿光则聚焦于另一点并纠正叻黄绿光的球差。其最佳清晰范围是 510～630nm 之间 （2）复消色差物镜（apochromatic objective） 消色差物镜是用特殊的光学玻璃制成，纠正了可见光的红、绿、蓝三種光的色差使之 聚焦于一点，质量优良最佳清晰范围是 400～720nm，容纳了全部可见光谱残留有像场 弯曲， 使平面物体形成类似球形弯曲面嘚影像 结果使视野中心和边缘的曩像不能同时准焦。 复消色差物镜的金属外壳刻有“APO”字样，供作识别 （3）萤石物镜（fluorite objective） 亦称半复消色差物镜（semi-apochromatic objective） 。构成物镜的光学透镜全部或 大部分由萤石透镜取代，故名萤石物镜色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间，故 又可称半复消色差物镜最佳清晰范围在波长 430～680nm 的光谱区，包括了绝大部分的可 见光谱物镜的金属外壳，刻有“FL”字样（图 1-1 左） 上述三种物质都残留程度不同的场曲，使得视场内不同部分的影像不能同时准焦，镜 检时尽管可采用分区聚焦、渐次观察的方法，可是顯微摄影却无法把分散于全视场的样品 清晰地摄入一帧图片之中 （4）平场物镜（Plan objective）

平场物镜，除具有共它物镜的优点外还校正了场曲。在相等的放大率下所成影像要 比一般物镜的影像为大。平场物镜有多种类别外壳上刻有不同的字样以资区别： “PL” （平 场消色差物鏡）“PL.FL” ， （平场萤石物“FLAN” （平场消色差物镜）和“PL.APO” （平场复消 色差物镜）等其中以“PL.APO”为最佳。 （图 1-1 右） 各种类型的平场物镜，都要与精制的平场目镜配合使用 物镜使用时，按前透镜与被检标本盖片之间的介质情况又可分下列两类： （1）干燥系（dry sysntem）物镜 镜检時，物镜与盖片间不添加任何液体。如 4?10?，20?和 40?物镜都属干燥系 使用时不加用任何浸液，只以空气为介质其折射率为 1，所以干燥系物鏡的数值孔径小 分辨率亦低。 （2）浸没系（immersionm system）物镜 物镜在使用时前透镜与盖片之间浸满液体，依充添的浸液的不同主要可分为油浸系 （oil immersion）和水浸系(water immersion)等类别。最常用的浸没液为香柏油（ceder oil） 其折射率为 1.515，与玻片的折射率相近且不易干涸。使用水浸物镜时可加水其 折射率为 1.33。 油浸物镜外壳上刻有： “oil”“oel”“imm”和“HI”等字样水浸物镜刻有“W”与 、 、 “Water”字样；油、水浸两用物镜则刻上“oil+w”字样； （圖 1-1 右） ；甘油浸没物镜刻有 “Gly”或“Glyz”字样。 2、物镜壳上的标志 物镜的金属外壳上 刻有多种符号和数字分别代表物镜性能、 规格、 类别囷使用条件等。 （1）物镜的种类 APO（复消色差物镜） （4）标准机械筒长 显微镜的机械筒长当今主要有两种标准，即 160mm 和 170mm用数字刻在镜壳上，如 160,170,?表示机械筒长为无限大为某些特种显微镜的筒长。机械筒长是指从镜筒的目镜 管上缘至物镜螺旋肩的距离以 mm 表示。 （5）需用盖片凊况 根据物镜的种类不同镜检时在被检标本（或样品）上加或不加盖玻片。凡需加用盖玻 片的物镜在外壳上刻有需盖玻片的厚度（mm） ，如 0.17该值常与机械筒长写在一起如 160/0.17。 160/0 或 160/：筒长 160mm盖片厚度为 0，即不需加用盖玻片（绝对不用盖玻片！ ） 160/―：筒长 160mm，盖片有无皆可 ?/0 或?/―：筒长为无限大，盖玻片厚度为零或有无皆可 （6）物镜与被检样品间的介质情况 干燥系物镜无符号 油浸物镜： oil、 和 Hi 等， oel 并在油镜末端刻一黑环 以示油浸。 水浸物镜： 或 Water W 等甘油浸物镜：Glyz 和 Glye 等。 （二）目镜（eyepiece, ocular） 目前作为影像和肉眼间的放大镜将物镜放大的影像做第二佽放大。同时目镜作为物 镜的补尝，把物镜残留下的像差给予进一步校正以提高造像质量。目镜作为投影器把放 大的影像投射在摄影暗箱的焦平面上。 目镜通常由两片（组）正透镜组成上面的透镜叫接目或眼透镜（eye-lens） ，它决定 倍数和成像的成劣；下面的透镜叫会聚透镜（collective lens）或场镜（fieldpiece） 它 使视野边缘的成像光线向内折射， 进入眼透镜中 使物体的影像均匀明亮。 上下透镜的中点 或场镜下面没有用金属制造的光阑叫做视野光阑或场光阑（field stop） 。场镜或物镜在这 个光阑面造像在光阑上可装入各种目镜测微计、十字线玻片和指针等。由眼透镜射出的成

像光线基本上为平行光束亦在目镜之上约 10mm 处交叉，此交叉点称作出射光瞳 镜检观察，通过目镜所窥视的圆即目镜光闌所围绕的范围，称作视场（field view） 视场圆的直径叫做视场宽度多用毫米表示。视场宽度与显微镜总放大率成反比与物镜的 放大率亦成反仳。目镜的视场宽度依设计而不同在同一放大率下，宽视场目镜视场最大 补偿目镜次之，惠更斯目镜最小 目镜可分下列几种： 1. 惠更斯目镜（Huygeian eyepieces） 应用最广泛的目镜，眼透镜和场透镜皆由平凸单片透镜组成凸面常朝下，两片透镜之 间有一圆形光阑 场透镜把物镜射来的咣线会聚于光阑处， 眼透镜再把这一一年四季影像放 大以待观察。由于场透镜射来的是会聚光线眼透镜可以远较场镜为小。目镜的放夶率与 眼透镜的直径和目镜的筒长相关 透镜直径愈小， 筒长愈短 放大率愈大。 此镜已逐渐淘汰 2. 兰姆斯登目镜（Ramsden eyepieces） 亦由两片凸面相对嘚平凸透镜组成。眼透镜与场镜大小相仿目镜光阑位于场镜下方， 便于安放测微计与标线玻片此镜在新型显微镜中已很少使用。 3. 补偿目镜（compensating eyepieces） 构造复杂专为与复消色差物镜配合使用设计的。在目镜的设计上补偿物镜残留的横 向色差与之作到互补。眼透镜和场镜都用幾片透镜粘合而成因结构不同，焦平面位置有的 在两组透镜之内也有的在两组透镜之外。补偿目镜常标有“compens” “komp”和“c” 、 、 “k”字樣 4. 平场目镜（plan eyepiece） 从结构上也是一类补偿目镜，平场目镜纠正了像场弯曲视场平广，但补偿不了复消色 差物镜的场曲适于平场物镜使鼡。平场目镜日趋增多目镜的代表符号，因制造厂不同而 别如“PEN PLAN”“PLANOSCOPIC”“PLAN”“KPI”“GF”和“GW”等。 、 、 、 、 5. 摄影目镜（photographic eyepiece） 专供显微摄影使用的一种目镜其种类繁多，生产厂家皆有各自的专用摄影目镜有的 目镜为一发散光线的负透镜系统，焦点和出射光瞳在同一方都處于镜筒之中，有的目镜把 被检样品的影像投射到距离较远的照相机机身的胶片面上 显微摄影时， 物镜射出的成像光 束经摄影目镜将咣线发散出去，在胶片面上聚焦成像 摄影目镜专司摄影，不能用作镜检观察 当今世界各国不同厂家都相继推出各自的产品， 常见的 OPTON Leitz）Nikon 囷 OLYMPUS （ 、 系统显微镜各具特有的物镜和目镜系统。设计独特造型新颖，质量优良种类繁多，风 靡世界 为了提高显微镜的成像质量， 各厂家在物镜和目镜的制造上 采取配套设计， 互补配套 共同提高。在显微镜使用上只有采用同一工厂，相同系统的物镜和目镜配套使用方能获 得最佳光学效果。否则定会招致成像质量的降低。为扩大显微镜视场能在同一视场内看 到更多的被检样品，现今广泛使鼡广视场（wide field）目镜和超广视场（super wide field 或 ultra wide field）目镜以逐渐取代普通视场目镜。 目镜的出射点或眼点（eyepoint）是成像光束射离目镜的聚焦点镜检观察時，瞳孔必 须与出射点重合方能窥见像目镜出射点随目镜放大率的增加而降低，即靠近眼透镜镜检 时眼睛须贴近目镜。给予观察者带來诸多不便尤其不适于众多的眼镜配戴者。由于镜片的 阻截瞳孔远离射点，看不到影像；摘脱眼镜又因视力不佳难以进行观察。为此近些年， 各厂家相继制造出多规格的高出射点（high eyepoint）目镜出射点高，即出射点与眼透 镜的距离大镜检者可随意戴上眼镜进行镜检。洇之目镜的出射点，已成为目镜的性能指 标之一 （三）聚光器（condensers） 聚光器等聚光系统，使来自光源的光线放大并聚成光束，透过载爿照明样品射入物 镜。聚光器由聚光镜和孔径光阑（aperture diaphragm）构成聚光镜属正透镜系统，由一 至数片透镜组成具会聚作用，把照明光线会聚放大射向被检样品，进入物镜 孔径光阑位于聚光镜下方，光阑的孔径可变以改变照光束的直径，调节进光量孔径 光阑的开度，即聚光器数值孔径左右显微镜的成像质量。物镜的有效数值孔径其中涵容 聚光器的数值孔径，即：

? 聚光器数值孔径 2

聚光器数值孔径为 0.25～1.40 不等使用数值孔径超过 1.0 的油浸物镜时，聚光器也 应油浸在聚光镜的上透镜与载玻片之间要充满浸油。 聚光器种类颇多构造各异，咣学质量差虽甚大由最低级的单片透镜构成的低孔径聚 光器，到多片透镜组成的消色差/消球差聚光器（achromatic/aplanatic condenser）适于 不同的物镜和用途应妥善選用 聚光器有不等的焦距， 高倍物镜需用焦距较小的聚光器 低倍物镜需用焦距较大的聚光 器。如用低倍物镜没有与其相应的长焦距嘚聚光器时，可取下或旋出聚光器的上透镜以 提高焦距值，扩大视场例如，一般的聚光器焦距可能为 1.2mm 左右移开上透镜后，焦距 可增臸 5.5mm. 聚光器调中、准焦后孔径光阑的开孔要适度。开度过小使聚光器和物镜的数值孔径下 降影响影像的分辨率，还可能产生光的衍射降低成像质量。光孔过大造成光线充溢， 引起产生眩光 降低影像的清晰度和反差。 聚光器孔径光阑的开孔的最大限度是等同于物镜 的咣孔即以两者的数值孔径相等为度。 在镜检观察、显微摄影时为提高影像的清晰度和反差，聚光器的孔径光阑不能开大 开度过大时，聚光器会出现球差和色差因为透镜的边缘残存的像差较中心为大。 二、显微镜的照明 普通光学显微镜普遍采用中心亮视野透射照明法。 （一）照明光源 照明光源以钨丝灯和卤钨灯为多卤钨灯优于钨丝灯，为显微镜的主要光源 1. 钨丝灯（tunsten lamp） 老式显微镜的主要光源。它鈈同于一般照明灯泡具有灯泡体积小，电压低、钨丝团成 点状和照明强度大等特点常用电压 6～12V，功率 15～100W灯丝小而集中，似点状发 絀的光线易为聚光透镜集中成束而射入光路。 光强随电压的升高而加大； 光源的色温 （colour temperature）亦随电压的增高而升高色光为连续光谱。色温 3200～3400K 左右红橙光 多，蓝紫光较小灯光略显黄色。钨丝灯寿命短发光效率极低。 2. 卤钨灯（hologen lamp） 常见的多为溴钨灯钨丝似点状，灯壳为石渶玻璃灯泡的体积很小，似一节小手指 一般为 12V，50～100W色光为连续光谱，色温一般为 3200～3400K 左右溴钨灯的灯壳不 要直接触模，以避免污染点燃时，污染处易焦化污染物可用酒精擦去。装卸灯泡时要 垫以塑料包装袋或薄纸。 （二）科勒照明（Kohler illumination） 1893 年德国杰出的学者 August Kohler 提出科勒照明法其具体做法：在光源与聚光 器之间，加放一光源聚光镜（lamp condenser）和视场光阑（field diaphragm） 光源聚光 镜把光线集成光锥，使光源灯成像于聚咣器的孔径光阑平面处同时，聚光器又使视场光阑 成像在样品平面处由此，充分地利用了照明光源使点状的光源达到较大的照明，從而使 样品得到均匀的照明并防止了高温。这对显微镜摄影和镜检观察至关重要 科勒照明法是当今最佳照明法，视场照明均匀被摄粅体不受热，影像清晰新近的显 微镜，照明系统已按科勒法设计装置使用时稍加调整即达最佳照明状态。 视场的照明强度用升降电壓调节。 （三）光路及成像 显微镜的光路或光程（light path）即光源照明的通路光路成像遵循科勒照明法。 光路始于光源灯光源装在镜座后方嘚灯室（lamp housing）内。光源灯丝（S）发出 的色光由聚光透镜集光成束或光锥，经镜座中的视场光阑（L） 投向反光镜，呈现 45 折 射向上入射孔徑光阑，光源灯丝在此平面处第一次成像（S1） 透过聚光镜使光线放大、 聚集，透射、照明载物台的样品视场光阑在此平面处第一次成潒（L1） ，即在样品聚焦的 同时 可见清晰的、 缩小的视场光阑的影像。 成像光束继而进入物镜 在物镜的后焦面 （rear focal plane）的平面处，光源灯丝苐二次成像（S2） 成像光束经转折进入目镜，在目镜的 场光阑平面处视场光阑第二次成像（L2） 。最终成像光束从目镜眼透镜射出，在目镜的 出射光瞳处光源灯丝第三次成像（S3） 。视场光阑的第三次成像（L3）在人眼的视网膜上

在成像系统中，一个位置的改变会引起整个成像关系的改变，光源灯前后位置的稍许位移 将导致光源成像位置的变动 科勒照明法光路成像的关键，是光源的第一次像聚焦在聚光器的孔径光阑平面上，视 场光阑的第一次像要聚焦在被检样品平面处。整个光路成像系统是共轭关系互相制约， 一动皆变 三、顯微镜的能力 显微镜的能力是质量和性能的标志， 能力包括分辨率、 放大率、 焦点深度和视场宽度等 其中最重要的是分辨率。各种能力嘟有一定的限界既互相作用，又互相制约改善和提高 了某种能力，同时降低了某些能力只能顾其主要，兼及其它综合统筹。 （一）数片孔径（numerial aperture） 物镜的旭显微镜极为重要的参量 直接决定显微镜的光学能力。 它是物镜分辨本领的量 度 数片孔径（N. A.）是物镜和被检样品之间的介质的折射率(n)与物镜所接受的光锥顶角 （亦称孔径角）的一半 a（半孔径角）正弦的乘积。其公式如下： N. A.= n . Sina 显微镜准焦后物镜前透鏡最边缘斜光线与显微镜光轴所成交角 a,即物镜的半孔径角。 准焦的显微镜 在物镜前透镜与被检样品间的一定距离， 物镜只能收集从样品射出的全 部光线中一个有限光锥（两个 a） 于是角 a 或其正弦值，可用来度量物镜的集光能力这 对分辨力和影像亮度都是重要的。a 或 sina 值决萣于前透镜与盖玻片间介质折射系数使 用干燥系物镜时，介质是空气折射率为 1；使用水浸系物镜时，水的折射率为 1.33；使用 油浸物时 油的折射率为 1.515。 干燥物镜的 N. A.一般为 0.05～0.95； 水浸系物镜为 0.1～ 1.20；油浸系镜物为 0.83～1.40物镜的数值孔径愈大，显微镜的能力愈强数值孔径与 分辨率荿正比，与焦点深度成反比物镜的数值孔径，通常简写为 N. A.和 Num. Apert.等 N. A.值刻在物镜壳上，如 40/0.65 表示 40 倍的物镜数值孔径为 0.65。物镜的数值孔径 随前透镜直径的减少而增大 显微镜物镜的前透镜口径愈小， 数值孔径愈大 放大倍数愈高， 价格愈高 （二）分辨率（resolving power） 物镜分辨率是指分辨被检样品微细结构的能力。 通常以能清晰地分辨两个物体点的最短 距离来表示其公式如下： 0 . 61 ? ? R ? N . A. R：分辨率（两点的最短距离） ?：照明光线波长 N.A.：物镜数值孔径 分辨率以分辨两点的最短距离表示，R 值愈小分辨能力愈大。物镜的分辨率与照明光 线的波长成反比与物镜的数值孔径成正比。 照明光线波长愈短、物镜的数值孔径愈大显微镜的分辨率亦愈大。 照明的可见光波范围为 400～700nm在计算上，一般取波长的平均值 550nm 作为照明 的入射光波长 目前油浸物镜的最大数值孔径为 1.4，使用可见光中波长最短的 400nm 的紫色光照明 R 值近 0.2um。 该值为光学显微镜的所能清晰分辨两物点的最小距离 亦即分辨的最高能力。 两物点距离小 0.2um不能分辨，两点被看作一个点 物镜的分辨力即显微镜的分辨率， 目鏡与显微镜的分辨力无关 它只把物像第二次放大， 使眼睛便于观察 目镜只能将物镜已经分辨的影像进行放大， 无法观察到未被物镜分辨的细 水细节在光学成像的过程中，目镜不起初始造像作用仅作放大而已。 （三）放大率（magnification） 显微镜最后形成的物体放大影像对被檢的体的大小比例称为放大率，即像高比物高 放大倍数以长计算，而不是以面积或体积计算 某些显微镜为适应不同需要， 镜筒内装有倍数不同的附加透镜系统 在专用的显微摄影 装置中，附有摄影透镜（photographic lens） 显微摄影总放大率的计算，除目镜、物镜的

放大率外摄影透鏡的放大亦要计算在内。 显微镜的总放大率（Mt）应为： Mt=Mob?Me?Mph Mob：物镜放大率 Me：目镜放大率 Mph：摄影透镜放大率 一般镜检观察时摄影附加透镜的放夶倍率不计算在内，因它未参予造像显微镜辨别 微细结构的能力，不取决于总放大率而归于物镜的分辨率。显微镜的总放大率绝非愈高 愈好，有其适量范围：最低和最高界限适宜的总放大率是所用物镜数值孔径的 500～1000 倍。在此范围称作有效放大率例如，使用 40/0.65 物镜时应选配适宜的目镜倍数范围。 首先计算出有效放大倍率： 0.65?500～0.65?～650 再用物镜放大倍率除有效放大率 352?40～650?50=8～16 求得的数值是应选配的目镜放大倍率嘚范围即要选用 8?～16?的目镜。 总之总放大率超过物镜数值孔径的 1000 倍时，微细结构分辨不消为空的放大，低 于 500 倍时由于放大率过低肉眼难以分辨。 （四）焦点深度（depth of focus） 当显微镜对被检样品的某一点或平面准焦时影像的清晰范围，不局限于这一点或面 在春上下的一定距离或深度内也是清晰的。这段清晰的距离或深度就叫做焦点深度，简称 焦深焦深长表示清晰的上下范围或深度大，焦深短清晰的仩下限界短。 显微镜的焦深可变 它与物镜的数值孔径和总放大率相关。 焦深与物镜的数值孔径和总 放大率成反比收缩孔径，影像的焦罙加大提高物镜的数值孔径，清晰深度变小总放大 率提高，焦深变小总放大率降低，焦深加大使用同一物镜，配用不同倍率的目鏡其焦 深随目镜倍率加大而减少。 四、显微镜的使用 正确、合理地使用显微镜是做好镜检和显微摄影的前提。 （一）光路合轴调整 照奣光束应与显微镜的光轴合一使光源均匀地照明视场。镜检和摄影前光路要合轴 调整，使照明光束与显微镜的光轴于同一轴线上光蕗系统中的目镜、物镜和视场光阑位置 固定，勿需调整仅聚光器可调。因此光路的合轴实为聚光器和光源灯的调中。 1. 聚光器的调中 聚咣器的调中步骤如下（图 1-2） （1）转动聚光器升降旋钮把聚光器升至最高位置。 （2）接通光源灯的电源开关 （3）将制片标本放在载物台仩，用 4?或低倍数物镜对样品聚焦 （4）缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像 （5）微降聚光器，至视场光阑的图像清晰聚焦上 （6）用聚光器两个调中的螺杆推动聚光器，使缩小的视场光阑的图像调至视场中心。 （7）开放视场光阑使多角形的周边与视場边缘相接。 （8）反复缩放视场光阑确认光阑中心和边缘与视场完全重合。 （9）使聚光器回复顶点位置 在视场中，通过观察视场光阑影像的相对移动使聚光器调中，达到光轴合一 聚合器的调中，即光路的合轴是显微镜使用的“开始曲” ，每次必做并非一劳永逸， 使用聚光器常出偏移致使光轴歪扭。聚光器必须准确地对准中心使其光轴与显微镜光学 系统的光轴合一。调中要用两个调中螺杆调整使其移向中心位置。聚光器调中的同时亦 要准，使透过聚光器的光线恰好集中照射在被检样品处或拍摄的像场上。 2. 光源灯的调中 咣源灯的方位可调灯线的影像在光路中可见，灯丝的位置并非永居中央在使用中随 时注意调中。 为保证视场的照明强度和均一 必须進行灯丝的调中使投射的光束和光轴合一。 其调整方法如下：

将光源灯拧紧或插入灯座上固紧于灯室或镜座中。转动灯座或灯室上的垂矗水平调 节螺丝，使灯丝调中位于视场中心（图 1-3） ，灯丝的图像可于两处观察： （1）在视野光阑上面的滤色镜座上放一磨砂玻璃或乳白滤色镜，用以观察灯丝像的 位置至调中止。 （2）灯丝聚焦后从镜筒中取下目镜，在物镜的后焦面上可见到灯丝的清晰图像。 两法之中前法可取，简便易行 （二）物镜和目镜的选用与组合 物镜参与造像，目镜将影像二次放大并投射到焦平面上，选用优质的物鏡与目镜是至 关重要的 1. 优质接物镜 在诸多的物镜当中，以平场复消色差物镜为好其镜壳上的标志为：PL. APO，PL. FL 和 PL 亦可选用 2. 适宜的目镜 目镜紦物镜放大的影像第二次放大，并校正物镜残余下的像差以提高成像质量。目镜 作为投影器把放大的影像投射到照相机身的胶片面上。选用与物镜配套的目镜各厂家都 有专用的摄影目镜，不可任意滥用 观察镜检用目镜，不能用做摄影用 3. 物镜与目镜的组合 物镜和目鏡的种类繁多，怎样选用性更佳涉及两者的匹配或组合。要考虑下述几个问 题 （1）分辨率 物镜的分辨本领是决定物镜质量的关键。它取决于物镜的数值孔径两者呈正比。数值 孔径大分辨能力强。数值孔径与放大倍数相关放大倍数高，数值孔径亦大 物镜倍数 4? 10? 20? 40? 100 数值孔径 0.1 0.25 0.40 0.65 1.25 上列数字表明，随放大倍数的加大数值孔径相应提高，分辨力随之增大欲提高对样 品细节的分辨能力和清晰度， 必须使用高数值孔径的物镜 目镜应视影像的大小和视场宽度， 选用低倍的目镜为主 选用数值孔径不同的物镜， 尽管总放大率相等 其分辨距离相差甚殊。 （2）有效放大率 显微镜的有效放大率为所用物镜数值孔径为 500～1000 倍。高于所得放大叫做“空的 放大” 倍数低于 500 总放大倍数太小，物鏡分辨能力不能充分发挥本可辨认的细节，由 于倍数太小难以分辨。 （3）焦点深度和视场宽度 焦深大清晰的深度大，焦深小清晰嘚深度小。缺少足够的焦点深度难把众多的影 像清晰地映现在一个视场内。数值孔径小放大倍数低的物镜和目镜，焦深长只有选用數 值孔径小和放大倍数低的物镜和目镜， 加长焦点深度 才能把处于不同水平层次的样品影像 清晰地映入同一视场内。 视场宽度与显微镜嘚总放大率成反比 使用高倍物镜和目镜， 视场小难在同视场内容纳 更多的影像改用低倍的物镜或目镜，降低总放大率扩大视场，直箌包括了所需的样品影 像 综上所述， 选用物镜和目镜主要着眼于提高影像的分辨率和清晰度 兼顾焦点深度和视 场宽度，即选高数值孔徑的平场复消色差中、高倍油物镜并选用相应的低倍目镜或平场目 镜。焦深和视场不足时适当调换物镜，降低数值孔径或放大倍数 （三）光阑及其使用 显微镜有两种光阑：视场光阑和孔径光阑。视场光阑控制照明束限定视场大小。孔径 光阑通过光阑的放缩限定聚咣镜的孔径大小。两者皆为可变光阑（iris diaphragm） 正 确调节和使用光阑，是保证镜检和摄影质量的重要环节 1. 孔径光阑的调节使用 视场内的影像鈈同于一般景物。其最大的区别是影像反差小焦深浅，这可随孔径光阑 的缩小而提高孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物像的分辨率囷亮度降低影像反应和焦

点深度提高，使影像更加清晰所以，在不过多地降低分辨力的前提下把孔径光阑调到所 用物镜数值孔径的 70%～80%大小是较适宜的。例如物镜的数值孔长为 1.0，孔径光阑的数 值调到 0.7～0.8（图 1-4） 所以，缩小孔径光盖尽管丧失少许的分辨力，却提高了影像 反差焦点深度和清晰度。 孔径光阑的调节方法：当聚光器标有孔径的数值转动调节环对准所需的值即妥；如果 不具孔径光阑数值，在显微镜向标本聚焦后从镜筒中取下目镜，在物镜的后焦面可见孔径 光阑影像 光阑缩至最小时，见一亮点逐渐开大光阑，亮孔扩夶直至需要的程度。 当光阑缩小 视场亮度降低时，可适当提高电压增加照明强度 2. 视场光阑的调节 视场光阑位于镜座中，用以控制照奣光束的直径缩小视场光阑，光束直径小于孔径光 阑视场亮度不足，影像不清晰视场光阑开大，光束直径超出孔径光阑因光线过哆，造 成光线的乱反射影响影像的清晰度。视场光阑的适宜大小以光阑的内缘线外切孔径光阑 或孔径光阑外边内接视场光阑为度（图 1-5） 。总之孔径光阑的调节取决于所用物镜的数值 孔径当两者相等，分辨力最高孔径光阑适度小于物镜的数值孔径，影像反差和焦点深喥 增加视场光阑随孔径光阑而变，总是外切孔径光阑更换物镜，数值孔径改变孔径光阑 重新调整，视场光阑亦随之改变 （四）盖箥片的深度 镜检和显微摄影的样品，多放置在载玻片（slide glass）上样品上复加盖玻片 （coverglass） 。物镜对盖玻片的要求因制造厂家而不同，通常为 0.16～0.18mm标准盖 玻片厚度，国际上统一规定为 0.17mm物镜对标准盖玻片厚度的要求，刻在物镜的外壳上 数值孔径较小的物镜，成像质量很少受到蓋片厚度的影响其影响程度随倍率提高而增加。 油浸物镜对盖片厚度无特殊要求因为盖玻片，浸油和载玻片的折射率几乎相等不会洇盖 片厚度而产生有碍成像质量的情况。除非盖片厚度大于工作距离否则不考虑厚度。盖片过 厚在调焦时，由于物镜前透镜受阻不能准焦；如果盖片封固剂太厚，相当于加厚了盖片 的厚度在封固样品时，需调稀树胶复上一薄层或给盖片加压，使多余的封固外溢鉯减 薄厚度。盖片过薄厚度在 0.15mm 以下，物镜的成像质量也受影响因为物镜是按标准盖 片的厚度设计的。 （五）工作距离（working distance） 显微镜准焦後 物镜前透镜至被检样品上的盖玻片表面的距离为工作距离， 亦称自由工 作距离（free W. D.） 可简写成 W. D.。 工作距离依物镜种类不同而异通常尛于物镜焦距，物镜的放大倍率愈高数值孔径愈 大，焦距愈短工作距离就愈小。 思考题 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 作业 1. 2. 3.

物镜的种类各具何种特点 目镜在显微镜嘚成像上起何作用？ 聚光器的构成及其作用 科勒照明法及其实质？ 显微镜的各种能力之间有何相关 如何进行光路合轴调节？ 物镜和目鏡的选用及其组合的原则 光阑的开度怎样进行调节？ 聚光器与光源灯的合轴调中的独立操作 检验所用显微镜的照明系统是否属科勒照奣法。 试比较观察孔径光阑开大和缩小时视场内影像清晰度的变化。

I. 暗视场显微镜 实验目的 掌握暗视场显微镜的原理构造及其使用方法。 实验用品 普通复式光学显微镜暗视场聚光器，黑纸、剪子、圆规、直尺、铅笔、香柏油、载 玻片、盖玻片和镜检的制片样品等 实驗原理和方法 暗视场显微镜在构造上应用丁达尔现象（Tyndal phenomenon） ，装配了一类特殊聚光 器 ― 暗视场聚光器使入射光束，从聚光器斜向照明被检樣品由于照明光线与显微镜 光轴形成较大的角度通过物场，或因聚光器的特殊构造照明光线在聚光器顶透镜（或盖 片）的上表面发生铨反射，致使照明光线不能入射物镜这内但是，样品被照明并发出反 射和散射光镜检时，因不能直接观察到照明光线与光轴垂直的岼面视场暗黑，在深暗 的背景上能清晰地看到由散射光和反射光形成的明亮的物体影像 物像与背景造成极大的 反差。视场内的样品被斜射光线照明，可从样品各种结构表面散射和反射光线看到许 多细胞器的明亮轮廓，诸如细胞核、线粒体、液泡以及某些内含物等如果是正在分裂的 细胞，其各类纺锤丝和染色体亦可窥见 暗视场显微镜是利用样品的散射光和反射光进行观察， 所以只能看到物体的存在與运 动而不能辨清其微细结构 暗视场显微镜的检测能力， 取决于入射光的强度和视场的反差 后者又随微粒及其背 景的折射率差别的加夶而增加。 暗视场显微镜与普通光学显微镜的区别 主要在于聚光器的不同， 致使照明方法有别 确切地说，称暗视场显微镜为暗视场照奣更为贴切暗视场照明是斜向照明的一种，这种 照明法能提高对微小物体的分辨能力 对大小在 0.004um 以上的微小粒子， 尽管看不清楚 其结构亦可清晰地分辨其存在和运动。 暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜 使视场背景暗黑， 样品的照明 方法常用的暗视場照明有下列两种方法。 一、暗视场光挡（dark field stop） 暗视场光挡是用黑纸厚卡纸或金属片制成，光挡遮住照明光束中央部分的光线使 之不能進入物镜， 而取得暗视场照明的效果 照明光线从光挡周缘呈环形光束通过聚光镜 斜向照明被检样品，被照明的样品产生反射光和散射光進入物镜形成可见的明亮影像。 此法简便易行不要特殊设备与条件。只将中央光挡加放在聚光器下方滤镜托架上 即可。实验成功与否关键在于暗视场光挡的制作，其中尤以光挡的直径更为重要 （一）暗视场光挡的制作方法 暗视场光挡的制作， 可采用两种不同样式戓在一滤色镜中央贴一圆形黑纸制成 或用 厚卡纸或金属片剪成如图 2-1 所示的样式。其中心圆形部分与连云港纸的圆形直径相同 其制作如丅： 光挡直径决定照明光线中央光束的面积或阻断量， 直径不宜 直接影响暗视场照明效 果。光挡直径大阻光过多，使周缘可透光线减尐影响对样品的斜向照明使之在暗视野 中辨认不清，光挡直径太小阻光不够，进入聚光器的光线过多使部分光线经聚光器进 入物镜，形成明视场照明影响了暗视场效果。 暗视场光挡直径的大小取决于所用物镜的数值孔径值，当物镜对样品聚焦后光挡 直径应与物鏡后焦面的通光孔径相当， 即光挡在物镜后焦面所成影像的大小与物镜孔径一 致使光挡的影像恰好遮住物镜的通光孔径。 光挡直径的确萣 依聚光器孔径光阑的开度而定， 孔径光阑的大小为物镜的数值孔径 所左右光挡直径的确定方法，依聚光器的数值孔径值标示与否采用两种不同的方法。 1. 聚光器孔径光阑调节环上标有数值孔径值按下列方法确定暗视场光挡直径。 （1）察看所用物镜外壳上标示的数值孔径值例如，20?物镜数值孔径为 0.40标 示 20/0.40。 （2）转动聚光器孔径光阑调节环将与物镜数值孔径相等的聚光器数值孔径相对准 基线（点） 。唎如使用 20/0.40 物镜时，将聚光器孔径光阑调节环上标示的 0.40 的数值 孔径值对准基线

（3）从显微镜上卸下聚光器，用分线规（圆规）两脚尖端量出孔径光阑开孔的直径 （4）用直尺量出分线规两脚尖端的距离，即聚光器孔径光阑开孔直径此长度即为 暗视场光挡直径值。 （5）把汾线规两脚尖端的距离回缩 1/2以此作为半径，在黑纸上绘一圆 （6）用剪子剪下此圆，得一圆形黑纸此即光挡。 2. 聚光器不具数值孔径标喥采用下列方法制作光挡。 （1）转动聚光顺升降旋钮使聚光器达最高位置。 （2）用低倍镜对样品聚焦 （3）聚光器合轴调中，使其光惢与光轴合一 （4）将欲使用的物镜，旋入光路对样品聚焦。 （5）从目镜筒中取出目镜若为双筒目镜可任取其一。 （6）通过目镜筒向丅观察于物镜透镜中的后焦面处，可见聚光器孔径光阑的影像 往复旋转孔径光阑调节环或拨动节杆， 使可变的孔径光阑孔径开大或缩尛 变化中的光阑 影像在物镜中可辨。光阑完全闭合时物镜中心尚有一明亮小孔，随孔径光阑逐渐开放 亮孔由中心向周缘扩展。 当孔徑光阑的开孔或亮孔扩大到与物镜的最大孔径相当 即孔径 光阑开孔内缘与物镜孔径的内缘重合时， 当即停止 此时聚光器光阑孔径与物鏡孔径相当。 下列过程按前述方法中（3）～（6）项进行 （二）暗视场光挡加放的位置及其调整 剪下的不透光的暗视场光挡， 粘贴在滤色鏡中央部位并加放在聚光器下的滤色镜支架 上使光挡的中心准确地位于显微镜光轴的轴心部位。否则因暗视场光挡中心偏移，使 部分叺射光进入物镜之内破坏了暗视场的效果。如早发现偏移要另行粘贴直到位于光 心为止。 镜检观察时若视场中样品与背景的明暗反差不强时，除光挡的中心位置不正外尚 与光挡的直径大小有关， 可通过聚光器升降螺旋上下调节聚光器 使光挡影像恰好与物镜 的孔径楿当，使视场内的反差提高 二、暗视场聚光器(dark field condenser) 暗视场聚光器是为显微镜暗视场照明特制的专用聚光器。普通光学显微镜 只要卸下明视场聚光器更换规格适宜的暗视场聚光器，就成为暗视场照明的暗视场显 微镜了 （一）暗视场聚光器的种类 暗视场聚光器种类较多， 各厂镓都有处自通用或专用的配套产品 本实验仅重点介绍 两类聚光器：抛物面聚光器和心形聚光器。 1. 抛物面聚光器（paraboloid condenser） 构成聚光器的两部汾，聚光镜和光阑具 有特殊的构造聚光镜下通光的光阑，中央为较大的圆形的阻光的暗视场光挡外周为一 环状不可变的透光光阑，入射的照明光束呈环状聚光镜为一抛物面体，图像为抛物面 上下为与光轴垂直的两平面（图 2-2） 。入射的环状照明光束经聚光镜抛物面嘚反射， 使光线会聚于样品处并斜向照明样品。在聚光镜与载玻片间油浸且把聚光器升至最高 点时，入射光线将在盖片面上发生全反射照明光线不进入物镜之内造成暗视场效果。外 油浸时入射光线的全反射将发生在聚光镜的上表面，这将影响对样品的照明抛物面聚 光器因构造的不同入射光亦有不发生全反射的类型， 因聚光镜抛物面的特殊角度 使照明 光线在盖片表面斜向透射，不进入物镜样品被斜射光线照明，照明光线经全反射返回聚 光器或透过样品射向空间 被照明的样品发出反射光和散射光进入物镜， 呈现为明亮的物 体

2．心形聚光器（cardioid condenser） 。聚光镜由心形回转面和球面的透镜组成中 央反射面是球面， 两侧是心形面 聚光镜下方为遮光挡板， 入射光线从周緣环状光阑射入 入射光线经球面和心形面透镜的反射形成一空心的照明光锥， 光线经反射 会聚于聚光器 上面的被检样品处（图 2-3） 。光線照明样品后射向物镜之外，样品产生散射光和反射 光进入物镜结果造成暗视野的背景和明亮的被检样品其形态和运动清晰可见。 （②）暗视场聚光器的使用方法 暗视场聚光器是显微镜暗视场照明的专用附件 其连接部分的构成或外径与普通视场聚 光器相同，同一厂家嘚系列产品一般可通用、其使用方法如下: 1. 从聚光器座架上卸下明视场聚光器换装暗视场聚光器，安装到位并固紧 2. 把被检样品的玻璃片載物台上，需用油浸的暗视场聚光器要在聚光器上透镜与载 玻片间滴加香柏油，使之密接 3. 聚光器光轴的调中，聚光器的光轴要与显微鏡的光轴位于一同轴线上其方法是， 用低倍物镜对样品聚焦 随之用聚光器升降螺旋上下调节聚光器位置， 当在暗视场中清晰地 窥见器使视场中的光环或光点，调至视场中心位置 4.调节聚光器焦点。使之位于被检样品处转动聚光器升降螺旋，使视场中光环调成一 最小嘚圆形光点此刻即为聚光器的焦点恰于样品处。 5.更换需用的高倍物镜进行镜检观察

（三）使用暗视场聚光器的注意事项 1.聚光器与物镜嘚数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；

否则会因物镜孔径角大于暗视场聚光器所形成的照明光束中心暗区嘚角度,致使部分照明光 线射人物镜破坏或降低了暗视场的照明 2. 使用高数值孔径的油浸暗视场聚光器时，在聚光器与载片之间要滴加香柏油进行油 浸使两者密接、否则，照明光线于聚光器的上透镜表面进行全反射照明光线照射不到被检 样品呈现不出暗视场照明的效果 3.载爿厚度要适宜，照明光束经暗视场聚光器后产生空心照明光锥，即中心为暗区 而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上，很短的距离因此载玻片的适宜厚度应在 0.8 一 1.2mm。 4.载玻片和盖片应清洁无伤痕否则照明光线会于其处发生漫反射而影响暗视场的照 明。 5.照明光源的照明強度要高 因暗视场照明是通过反射光照亮被检样品若照明强度过弱 照明样品的反射光强度不够，会影响观察效果,目前多应用高功率的溴鎢灯作为照明光源以 提高其照明强度 思考题 1.为什么暗视场照明的视场黑暗，样品影像明亮 2.暗视场光挡的直径如何确定？为什么 3.使用暗视场照明时，为什么必须在聚光器与载玻片间进行油浸 4.如何进行暗视场聚光器的调中和聚焦？ 作业 1.测出一低倍物镜暗视场光挡的直径并剪出一圆形黑纸，粘在滤色镜的中心部位 2.绘一暗现场内的被检样品形态图。 II 相差显微镜 实验目的 掌握相差显微镜的原理构造及其使用方法。 实验用品 普通复式显微镜相差显微镜附件：相差物镜、转盘聚光器调中合轴望远镜和绿色滤色 镜、载片、盖片、滤纸、活体苼物样品等。 实验原理和方法 一、原理 在显微镜下镜检时视场中的样品只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度〕与周围 介质有变化時方能窥见被检样品。 活的样品多为无色透明照明光线通过这种物体时 透过或 反射光的波长和振幅都不发生改变， 所以用普通光学显微鏡难以辨清活体的结构 必须借助 于固定和染色等理化方法。 使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化即在颜色 和亮度上有所差异以供识别。 相差方法应用于生物学上的主要价值 在于它能对透明的活体进行直接观察， 无需采用 使细胞致死的固定和染色的方法染色结活体以有害的影响，甚至失真由此才使相差法显 得异常重要。 I 相差 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化並产生的差异、 相位是指在某 一时间上光的波动所达到的位置 一般由于被隔物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们嘚眼睛是很难 分辨出这种差别的只有在变相差为振幅差（明暗之差）之后才能被分辨。 当光波通过两种折射率不同的物质时如由空气┅水，或由空气一玻璃其波长、振幅 和相位皆有不同的变化、例如光波分别通过 1cm 厚的水和 1cm 厚的玻璃时,由于两者折射率 不同，通过它们的咣波在相位上产生一定的差异通过玻璃的光波相位落后，因为玻璃的密 度和折射率比水大所以光波的波长和频率都小于水。 相差决定於光波所通过介质的折射率之差及其厚度等于折射率与厚度的乘积之差 （即光 程之差）介质越厚或折射率越大光波减速也越大

相差显微鏡就是利用被检物的光程之差进行镜检的。 2.衍射与干涉 用肉眼看不到的相差 只要利用衍射和干涉现象。 把相差变为明暗的根相差就可能看到 （I）衍射 波在同一均匀媒质里传播是沿直线方向进行的 如果在它传播的方向卜遇到迎面挡住的 孔或障碍物不比它的波长大得多,这时波就会明显地绕到障碍物后面或孔的外面去（传播路 线发生了弯曲） ，这种现象叫波的衍射 光也有衍射。光通过大小同光的波长的相差鈈大的细小物体时也要发生衍射。 （2）干涉 在同一种媒质里传播的两列波如果它们的频率和波长相同，在两列波相交的区域里 由于疊加的结果，每一点的合振幅都是一定的并且出现振动加强和振动减弱，这就是波的 干涉 光也发生干涉。光波通过小颗粒的物体后产苼直射光（S）和衍射光（D） 衍射光的光 波振幅小相位滞后。在光学系统中这种直射光和衍射光相遇或光的叠加，振幅发生变化 光线戓明或暗，就是光的干涉现象 如果物体粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时， 由于光程 （折射率和厚度的 乘积）较大所以通过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是因为被检粒子的衍射光 相位比直射光相位大约推迟 1/4 波长的缘故 若是在直射光的通过点囷大部分的衍射光的通 过面放置吸收光的物质和推迟相位的物质时，就能分别改变直射光和衍射光的相位和振幅 如果把直射光相位推迟 1/4 波长，使之与衍射光保持同一相位合成波（P）等于直射 光与衍射光振幅之和，即 P=S+D振幅加大，亮度提高、相反地把衍射光相位推迟 1/4 波长 两者的相差变成 1／2 波长，合成波的振幅等于两波的振幅差即 P=S－D，这时亮度要减 弱、 变暗 光线的相位肉眼是看不到的， 但是利用衍射囷干涉的现象把相位差变成振幅差 （明 暗反差）就能用肉眼识别、图 2－5 表示直射光（S 细线）和衍射光（D 虚线）干涉的现象 D 的相位比 S 被推遲 1 波长、合成波（P 粗线）由 S 与 D 两者干涉而生成，形成被检物体的 像振幅与 S 相同相位稍推迟。

3. 相板的作用 为了达到相差效应在相差显微镜嘚物镜中 装有由光学玻璃制成的相板 （Phase Plate） 。 在圆形相的平面上有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸或凹的圆环。其结构如图 2-5．楿板分两部分: (1)共轭面（conjugate area）通常为环状是通过直射光的部分。其环是凸起的也 可能是凹陷的。 （2）补偿面（Ccomplemetary area）共轭面内外两侧部分,是通過衍射光的部分 在相板的共轭面或补偿面上,涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光缆通过时使 光波的相位或振幅改变从而达到不哃的目的与观察效果利用相板把光波相让推迟，振幅改 变、 相板的作用 除推迟直射光和衍射光的相位之外， 还有吸收光 从而使亮度改變的作用、 物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以相板也安装在透镜中间。

相板的种类比较多对光的吸收率高低不同，所以产生不同的反差效果从反差上大致 可分下列两类（图 2－6） （1）明反差（bright contrast）或负反差（negative contrast）是指在相差显微镜 的现场中，物像煷度大于背景亮度的现象在被检物体的折射率大于媒质时，直射光被相板 的共轭面 （因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质） 嶊迟 1/4 波长同时吸收 80％～ 90％振幅变小致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射光没有变化由于直射 光推迟 1／4 波长，两者（直射光与衍射光）有完全相同的相位合成波 P 等于直射光 S 与 衍射光 D 之和，即 P=S＋D故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成的即物像等于 P。 所以比只有直射光照射的背景亮得多 （2）暗反差（dark contrast）或正反差（positive contrast)是指在相差显微镜的视 场中，背景亮度大于物像亮度的现象与明反差相反，把通过补偿面（因为在相板的补偿面 上涂有改变光波相位的物质）的衍射光推迟 1／4 波长使衍射光与直射光的相位相差 1／ 2 波长，哃时直射光在共轭面（上涂吸光物质）被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的 结果使合成波（P=S－D）振幅变小，被检物像的影像比背顯著变暗 根据上述原理所制成的显微镜便是相差显微镜， 聚光镜下面设有环状光阑 物镜后焦面 装有相板。

4. 相差显微镜的光路与成像 相差显微镜的照明光束 由转盘聚焦器环状光阑的环状孔射人聚光镜， 透射载物台上的 被检样品经样品后,入射光除透射的直线光外，同时產生衍射光衍射光的振幅较小，相 位滞后、直射光和衍射光进入物镜前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透过相板， 并相互干涉造像、样品的影像由直射光（S）和衍射光（D）经干涉后的合成波（P）造成

即 P=S+D；背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的楿位差异不同造成不同的 反差效果或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类别而定、成像光束由物镜射入目镜， 在目镜的视场光阑处洅次放大并由出射光瞳射出目镜（图 2－7） 。

二、装置 相差显微镜不同于普通光学显微镜在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜、具有 环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。 l. 相差镜（Phase contrast objective） 相差物镜是显微镜特有的重要装置 在相差物镜内的后焦面上裝有种类不同的相板 （图 2－8） 。相板由于前述的作用造成视场中被检样品影像与背景不同的叫暗反差，各具不同 的效果、因物镜内相板種类或构成 10?、20?、40?和 100?数种因此，相差物镜种类颇多 一套可多达 20 余种。 相差物镜多为消色差物镜成平场消色差物镜（PL）

2.转盘聚光器（turret condenser） 位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑（annulardiaphragm） 构成、环状光阑位于聚光镜之外，是一种特殊的光阑装置由大小不哃的环状通光孔构成， 不同规格的通光孔――环状光阑装配在一个可旋转的转盘上按需要调转使用（图 2-9） 。 环状光阑的环宽与直径各不楿同与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配,不可滥用。转 盘前端朝向使用者一面有标示窗（孔） 转盘上的不同部位标 0、1、2、3 和 4 或 0、10、20、 40 和 100 字样，通过标示窗显现 “0”表示非相差的明视场的普通光阑。1 或者说 0、2 或 20、 或 40 和 4 或 100 表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志 3 通过手动转入标示窗内之数字，表示该数字所代表的环状光阑已进入光路

3.合轴调中望远镜（centering telescope） 合轴调中望远镜简稱 CT，又名合轴调中目镜、它是眼透镜可行升降调节，具有较长 焦距的一种望远目镜、镜简较长其直径与观察目镜相同。它的功用仅作為环状光阑的环孔 （亮环）与相差物吻合或重叠以保证直射光和衍射光各行其路。使成像光线的相位差转变 为可见的振幅差、但是镜体嘚光路中前述两环的影像较小,一般目镜难以辨清不能进行调 焦与合轴的操作非借助合轴调中望远镜不可。 4．绿色滤色镜（green filter） 相差物镜的種类从色差消除情况来分，多属消色差物镜（achromatic objective）或 pL 物镜 消色差物镜的最佳清晰范围的光谱区为 510 一 630nm。 欲提高相差显微镜的性能最 好以波長范围小的单色光照明、即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明所以，使同 相差物镜时 在光路上加用透时光线波长为 500～600nm 左右的綠色滤色镜,使照明光线中的 红光和蓝光被吸收。由透过绿光、可提高物镜的分辨能力、该滤色镜兼有吸热的作用以利 活体观察。 三、操莋 相差显微镜的使用较较之普通显微镜检术要复杂些。但亦易于掌握按下列过程进行 操作。 1、相差装置的安装 如前所述相差显微镜區别于普通光学显微镜的装置主要有相差物镜、转盘聚光器、合 轴调中望远镜和绿色滤色镜四种部件、 使用时将这些部件调换安装在同型號的普通光学显微 镜上，即成为相差显微镜 (1)相差物镜的调换安装 从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜与普通目镜配套使用。 (2)轉盘聚光器的调换安装 旋转聚光器升降螺旋把普通明视场聚光器至最低位，旋松固紧螺丝卸下聚光器把转 盘聚光器安放到相应位置上， 旋紧固紧螺丝 转动聚光器升降螺旋， 使聚光器升至最高位置 转盘聚光器的标示孔，朝向操作者此时，转盘聚光器上面的聚光镜部汾进入光路；下面的 环状光阑转盘可视需要转动使用把与物镜匹配的环孔旋入光路，使之处于转盘聚光镜下 （3）把绿色滤色镜放入镜座的滤色镜架上。

2、聚光器调中 转盘聚光器调换安装后要进行合轴调中，使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一其 步骤如下: (1)把转盘聚咣器的环状光阑调至“0”位，明视场照明用的普通可变光阑进入光路 (2)旋转聚光器升降把旋聚光器升至最高位。 (3)接通照明光源、使视场明煷 (4)把被检样品放到载物合上，用低倍（4X）物镜聚焦 (5)缩小镜座上的视场光阑开孔，至最小 (6)从目镜观察在暗视场中可见一缩小的、明亮嘚、多角形的视场光阑图像。 (7)转动转盘聚光器的两个调中螺杆,推动聚光器把视场中的明亮的多角形的视场光阑 图像调至视场中央。 （8）開放视场光阑至视场同大视两者周边是否完全重合；否则，复用调中螺杆使聚 光器精确调中。 3.相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中 相差物镜的后焦面装有相板按物镜放大率与反差效果的不同相板圆环（共轭面）的大 小与结构亦不同。转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的不同大小的明亮环孔，与不同 放大率的物镜相应、使用时严格匹配当物镜更换时，环状光阑亦作相应的更换或调整 在视场中觀察所见，环状光阑为一明亮的圆环而相板的圆环为一暗环。互相匹配的明 环与暗环大小一致在使用时两者要合轴，互相重叠两环嘚重叠，须通过合轴调节方能取 得其方法如下： (1)相差物镜与环状光阑的匹配： 正确地匹配取决于所用物镜放大率。 例如 当使用 40? 相差物鏡时，环状光阑转向 ph3 或 40 位使相应地环状光阑进入光路。 (2)把 CT 放入目镜筒：从目镜筒取出一个目镜换入调中合轴望远镜(CT)。CT 为一眼 透镜也昰可行升降调节的望远目镜，专为观察视场中明环与暗环图像之用因为用一般目 镜看不见两环的清晰图像。CT 在使用前眼透镜应处于最低位即 CT 为最短小的状态。 (3)明环与暗环的聚焦：一手固定位于目镜筒中的 CT 镜筒使其场透镜位置不能上移， 另一手逆时针转动 CT 上部可调的眼透镜部分转动的同时，通过 CT 向现场中观察即边旋 转边观察。初始两环可能为模糊的图像，继续转动 CT 目镜可调部分至清晰地窥见明环與 暗环为止 (4)明环与暗环的调中重叠：相板的暗环是固定不动的，处于光路之中暗环的中心， 即显微镜光轴的中心环状光阑的亮环可調节移动．转盘聚光器环状光闹的位置，因聚光器 的可调其中心位置往往偏离光轴轴心，需调整使其归中．环状光阑的调中装置或部件， 因厂家或型号的不同而有别如 OLYMPUS BH2―PC 型相差显微镜，环状光阑调中装置为位于 转盘聚光器两侧的两个伸缩自如的调中螺杆，用以操纵妀换环状光阑的方位达到调中； 而 Nikon FIVOPHOT 型显微镜的相差装置，其环状光阑的调中部件为位于转盘聚光器表面 可向任一方向滑动的环状钮。調中时手指调中装置，移动明环使之与暗环合一。在两环 调中过程始终在通过 CT 的观察下进行。 在调节过程中 如亮环比暗环小， 并位于暗环内侧时 应降低聚光器位置， 使亮环放大 若亮环大于暗环时，应提升聚光器使亮环缩小。如聚光器已升至最顶点还不能完全偅合 可能是载玻片过厚之故。 (5)回装观察目镜：待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后从目镜筒中取 出 CT，放回观察用的接目鏡以便镜检观察。 四、相差物镜的选择 相差物镜有不同倍率、 不同反差类别和反差程度之分 相差物镜的反差类别和反差程度 以及放大倍数，皆用英文字母和数字标示在物镜壳外例如； 20?PH＝20 倍，正反差反差程度高。 40?PM＝40 倍正反差，反差程度中等 100?PL＝100 倍，正反差反差程喥低。 40?NH=40 倍负反差，反差程度高 40?NM＝40 倍，负反差反差程度中等． 100?NL＝100 倍，负反差反差程度低．

100?DH＝100 倍，暗反差反差程度高。 40?DM=40 倍暗反差，反差程度中等 20?DL=20 倍，暗反差反差程度低。 10?BH＝10 倍明反差，反差程度高 2O?BM＝20 倍，明反差反差程度中等。 40?BL=40 倍明反差，反差程度低 相差镜检时，依被检样品的种类、结构和反差程度的不同而确定应选用相差物镜的种 类。这里不存在死硬的规定可依观察者的习惯和爱恏而变。一般来说相差物镜的应用范 围如表 2―1． 就某一具体被检物体来说，适于明反差或适于暗反差难以定论。通常是用哪一种相差 粅镜都能得到清晰的像只是有的物镜更好些而已，因此可任意选择有的样品只适于某一 种相差物镜。 暗反差物镜对习惯于明视场镜检鍺很适宜 当与染色标本进行比较或进行测定 以及加强半透明物体的反差时， 多用暗反差； 而计算数量或观察物体运动以及研究极小的样 品时多使用明反差。

表 2―1 相差物镜应用范围 应 用 观察细胞或细胞核的内部结构 观察微小的物体如孢子、鞭毛和活的样品等 当样品反差较低时 当样品反差较高时

中 当样品反差为中等时 总之在相差镜检时，在诸多的相差物镜中选一物镜绝非易事。除参考上表所列应用 范围外最佳方法是通过各种类型的相差物镜进行实际镜检测定，找出最宜相差物镜 思考题 1．相差显微镜有哪些特有的附件?其构造如何? 2．明反差与暗反差相板的构成及其原理是什么? 3．相差显微镜的光路图是怎样的? 4．相差显微镜镜检时，为什么要用绿色滤色镜? 5．为什么相差显微鏡可以直接观察活体样品? 作业 1. 概述环状光阑的亮环与相板的暗环、合轴、调焦法 2．用明反差与暗反差物镜分别观察同一物体，请阐述其粅像的区别 Ⅲ．荧光显微镜 实验目的 掌握荧光显微镜的结构、原理及其荧光显微术。 实验用品 荧光显微镜或普通复式显微镜及荧光装置附件、荧光染料、载玻片、盖玻片、滤纸、被 检样品等 实验原理和方法 荧光显微镜是荧光显微术的基本装置。荧光显微术是利用一定波長的光(通常是波长短 的紫外光和蓝紫光)照射被检样品 激发荧光物质发出可见的荧光。 通过物镜和目镜的成像、 放大以供检视和拍摄。熒光显微镜具特殊光源提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光

物质发出荧光视场中所见的像，主要是样品的荧光映像 某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活吸收能量后呈激发态。其能量部分转 化为热量或用于光化学反应外． 相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来 这种波长长 于激发光的可见光称作荧光。 细胞内大部分物质经短光波照射后 可发出较弱的自发性荧光。 有些细胞成分與能发出 荧光的有机化合物一荧光染料结合 激发后呈现一定颜色的荧光， 借以对组织进行细胞化学 的观察和研究 一、荧光显微镜的基夲装置及其光路 荧光显微镜因制造厂家、型号的不同，结构各异但主要构件，基本相同 (一)光源 采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面发絀最大数量的紫外光和蓝光且光亮度大，光度 稳定汞灯的构件，中间为一球形石英玻璃管有两个钨电极，内充汞滴和少量氩氖混合氣 体汞灯装在牢固的灯室中．有调中、聚焦和集光装置。使用中严禁频繁启闭点亮后欲暂 停使用时， 不可切断电源 可用光阀阻断光蕗。 当汞灯熄灭后 不能立刻点亮， 5～10min 经 汞灯冷却后再通电点亮。 HBo 200W 汞灯的发射光谱为 200～600nm其中在 365nm 和 435nm 处有两个高峰。 (二)滤色镜系统 荧光显微术的滤色镜、按(用途或功能主要分为下列两类： 1．激发滤色镜(excttcr filter) 激发滤色镜的作用， 在厂为被检样品的荧光染料提供最佳波段的激发光 荧光染料均有 一定的吸收光谱(激发峰值)。利用滤色镜对光线选择吸收的能力选用其透射光谱，恰为荧 光染料的最大吸收光谱(激发高峰)嘚激发滤色镜 以便从汞灯发出的广谱光波中， 选择透过 最宜波段的光线供用 激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜(dichroicmirror)之间， 物镜之前 滤镜嘚型号不同， 数量较多可按不同需要选用。 2．阻断滤色镜(barrier filter) 阻断滤色镜位于物镜之上 二向色镜和目镜之间， 用以阻断或吸收光路中的激發光或某 些波长较短的光线以防伤害眼睛，使荧光透过选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长 于所需荧光的光线．外透过样品发出嘚荧光所以，阻断滤色镜的选用应视荧光染料的荧 光光谱而定，以能最大限度地透过荧光和阻断短波光 荧光显微镜中，除上述两类濾色镜外尚有重要的分色镜(chromatic beam splitter) 系统 一 二向色镜位于汞灯和汞激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的竖直光轴 的两轴垂直相文处。斜向安装于光路之中由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光 轴交角均呈 45? 兼有透射长波光线和反射短波光线的功能． 在荧光显微术中承当色光的 “分 流”作用。 (三)荧光显微镜的光路 荧光显微镜的光路因荧光激发的方式不同，可分两种： 1．透射荧光显微术光路 透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自 F 而上的透射样品 诱发的荧光从物镜前方进 入物镜。其具体光路如下： 汞灯发出的强光经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜 后光线转射向上进入视场光阑，暗视场聚光器进入样品，激发出的荧光射叺物镜经阻断 滤色镜进入目镜 2．反射荧光显微术的光路 反射荧光又称落射荧光，因激发光由物镜后部进入物镜向下落射样品，激发出熒光 荧光反射向上再进入物镜。其光路如图 2～10 汞灯发出高强的激发光，经集光透镜吸热玻璃，孔径光阑激发滤色镜，视场光阑 通过二向色镜，在此处一定波长以上的长波光线透过二向色镜脱离光路，一定波长一下的 短波光线反射向下进入物镜透过物镜射向样品，激发荧光物质发出可见的荧光荧光反射 向上再次进入物境， 复经二向色镜其中波长较短的光线反射至光源方向 荧光和长波光线透 射向上经阻断滤色镜进入目镜。

二、荧光显微术 荧光显微术按激发光对样品的激发方向或方式区分为透射式和反射(落射)式两类 实际 应用仩多用反射式。 反射式落射式荧光显微术是当前广泛使用的荧光激发方式 它比透射荧光激发方式具有 较多的优越性。 操作方法因荧光装置不同稍异 下面分别以 Nikon 和 OLYMPUS 两种荧光显微 镜装为例进行阐述。 (一)Nikon 荧光显微装置的反射荧光显微术 1．高压汞灯的调中 汞灯调中检验器似物镜狀使用时将其全部旋入物镜转换器，中部有一圆形屏能映现 汞灯的电弧像，用以观察调中按通电源，按压启动钮点亮汞灯。完全開放视场光阑和孔 径光阑转动汞灯室右侧的水平和垂直调中螺旋，通过调中器圆形屏观察至调中器内部被 充分照明上。旋转集光透镜調焦钮使汞灯电弧像聚焦，再用调中螺旋将电弧像驱于水平对 称位置(调中) 2、光吸收器的组装 反射式荧光装置无需聚光器． 由一底部封閉的圆筒状的光吸收器取代， 用以吸收射入的 光线防止四射。 组装方法：降下聚光器架将光吸收器插入楔形榫内，固紧、回升最高位 3、操作程序 （1)转动镜臂旋转台， 至相应的标志位 旋转台为一圆盘状结构， 上有 5 个定位标志： U、 V、B、G 和 O分别代表不同的荧光激发方法忣其不同的滤色镜系统组合。 (2)点亮汞灯接通电源，按压启动器按钮使汞灯点亮。 (3)将镜臂左侧的 DIA―EPI 转换钮调至 EPI 位 (4)确认汞灯点亮，照明系统正确灯位调中，电弧像聚焦准确 (5)用荧光染料染色的样品，放在载物台上： 用 lOX 物镜聚焦． (6)孔径光阉的调整使用：光阑位于镜臂中，用外露手杆操纵在汞灯调中，聚焦时光 阑应全开。荧光显微时孔径应缩小，使之小于视场 (7)视场光阑的调整使用：视场光阑位于孔径光阑之后，亦由外露手杆操纵视场光阑用 于限定样品表面的照明区域，其开度一般应与孔径光阑的开孔相当 (8)辅助激发滤色镜滑动閥的使用：滑动阀位于镜臂专用槽中．可拉出或推入。有三个档 位供不同使用全拉出位；供常规使用；中间位：用于 B 激发法，辅助滤色鏡进入光路；全 推入位；用作光阀阻断全光线。 (9)激发方法：共有四种激发方法uv(紫外)v(紫)B(蓝)和 G(绿)激发法，各适于不同 的荧光染色方法每種激发法与滤色镜的组合如表 2―2 所示． 表 2―2 反射式荧光激发法滤色镜组合 阻档滤色 激发滤色镜 二向色镜 镜 激发 染色类型 转台标志 方法 辅助濾 类型 类型 类型 色镜 UV V 自发荧光免疫 荧光法(FITC) 单胺类 (儿茶酚胺) 免疫荧光法 (FITC) 吖啶橙

孚尔根法 (二)OLYMPUS 显微镜 BH―Rn。―w 型反射荧光装置的荧光显微术 1-BH―RFL―w 型熒光垂直照明装置 该装置一端连接镜筒和物镜转换器之间二向色镜嵌入其中。上有阻断滤色镜嵌入槽 前方还有一紫外线防护罩。另一端与汞灯室相连中间有光阀、激发滤色镜嵌入槽、孔径光 阑和视场光阑等部件。它作为荧光显微术的重要附件使用时与复式显微镜组接。 (1)二向色镜

(2)滤色镜系统 ①激发滤色镜 位于激发光源和二向色镜之间 按不同激发法可将不同的激发滤镜放入滤色镜槽内， 使 一定波长范圍的短波光线透过作为激发光。 ②阻断滤色镜 位于物镜和目镜之间 用以吸收视场或光路中残存的激发光或短波长的光线， 荧光透通 2. 高压汞灯 采用 HBO 200w 汞灯，装于灯室中 3．荧光显微术 (1)装汞灯 ①切断电源，从插座 1：拔下电源线 ②开启灯室，将汞灯安装到灯架上 “十”极，朝向灯架底部固紧螺钉。 ③严防手指触摸灯管特别是中心球状部分，以免污染 ④汞灯装入灯室，封上灯室盖后方可按通电源。 (2)汞灯的点亮 ①确信各连接部分皆处于正常状态 ②接通启动器电源开关，按下起动钮汞灯点亮，经 2~3min电弧趋于稳定。 ③点亮后 15mm 内勿切斷电源。 ―旦汞灯熄灭在 5min 或稍长时间内，不许重新点 亮待汞灯冷却后，始能再次点亮 (3)汞灯的调中 ①开肩光阀。 ②开放孔径光阑和视場光阑主最大开度即“Min”→“Max” 。 ③旋转物镜转换器无物镜的空洞进入光路，旋下防尘盏光线射向镜台。 ④载物台上放一白纸让汞灯电弧像投在其上。 ⑤用灯室外的聚焦杆捍使电皿像在白纸上聚焦，并用调中螺钉调中汞灯。 （4）滤色镜系统的配合使用 该荧光顯微镜具激发滤色镜、阻断滤色镜和二向色镜等，三者的配合使用；应严格遵循 表 2―4 表 2-4 滤色镜系统配合 激发滤色镜 二向色镜 U（UG-1） U（DM-400+L-420）

G（綠） G（IF-545+BG-36） G（DM-530+O-590） R-610 *EY-455 激发滤色镜应嵌入荧光垂直照明装置的激发滤色镜座中。 （5）样品聚焦 ①经荧光染料染色的样品放在载物台上先用溴钨灯透射照明，用低倍物镜聚焦待寻 找到最佳影像后。 ②点亮汞灯嵌入系统滤色镜 ③使用 UVFl 40? (oil)和 UVFI 100?(oil)油浸物镜。应用无荧光浸油物镜的内装 可变咣阑应适当缩小，以增大影像反差和清晰度 ④在 UVFL 40?(dry)物镜内装有校正环，对较薄或较厚的盖片进行球面校正 (6)缩小光阑开度 视场光闸(F)和孔径咣阑(A)的开度，在观察样品时应朝“Min”向转动使其适当缩小。 (7)光阀的使用 在荧光观察暂短中止时可用光阀阻断光路，勿需熄火汞灯以免减短其用寿命。 思考题 1. 什么是荧光? 它是怎样发生的? 2．荧光显微术为什么要以汞灯当光源? 3．激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及其区别? 两者囿何关系? 怎洋选用? 4．二向色镜的作用原理是什么? 如何选用? 作业 1、用吖啶橙荧光染料进行细胞染色、鉴定其死活并绘出其染色反映图。 2．簡述汞灯调中、聚焦法 3. 慨述滤色镜系统的选用原则。

凡显微镜都是被人们用来把肉眼不能识别清楚的微小物体放大成像． 观察放大的像鉯便 辨识物体微细结构 由于分辨能力的缘故， 亚显微及超微结构必须应用电子显微镜才能达到 观察的目的 自 1932 年德国柏林大学 E． Ruska 等人制慥的第一台实用电子显微镜问世。 到高性能多 功能电子显微镜商品化为细胞学研究开创了新阶段。尤其是 1953 年瑞典人制造成较完善 的超薄切片机和随之出现的各种电子染色方法 使超薄切片技术得到迅速发展， 从而推动了 电子显微镜技术在生物学领域中的广泛应用 目前生粅电子显微镜技术已由细胞水平发展到 分子水平和原广水平。 英国医学委员会分子生物学实验室的 A． Klug 博士将高分辨电子显微 镜技术应用于苼物大分子的结构测定上 由于他在核酸―蛋白质复合体的晶体结构研究方面 作出的卓越贡献，荣获了 1982 年诺贝尔化学奖电子显微镜已成為细胞生物学、分子生物 学和分子遗传学不可缺少的重要研究手段。 实验目的 了解电子显微镜的工作原理和结构 观摩超薄切片技术演示， 了解电镜图像反差来源的 基础；判断、识别电镜下动、植物细胞中的各种亚显微结构 实验用品 电子显微镜、超薄切片机、制刀机、动粅或植物细胞的超薄切片、各种细胞亚显微结构 照片。 实验原理和演示

电镜理论学习与上机观察 超薄切片及制刀演示， 参观电镜照片等彡部分内容分组交叉 进行为节约时间，收取实效建议每组 10 人以两组或三组，争取 2～3h 完成全部内容 一、电子显微镜工作原理和结构简介 显微镜的两大要素： 照明源和透镜， 两者缺一不可 光学显微镜是以可见光作为照明源， 采用玻璃透镜而电子显微镜是利用高压加速電子束为照明源，轴对称电磁场为透镜特称 电磁透镜。都是依赖透镜放大成像这一基本原理是相同的。由于照明源的不同光镜与电 鏡的成像机理有本质区别． 前者的成像过程尾样品对可见光的反射与吸收， 整个过程总是在 大气中电子显微镜则是在高真空系统中，快速电子来照射样品时入射电子要与样品物质 中的原子结构发生碰撞作用， 原子核与核外层电子都会对入射电子有碰撞引起的散射 导致 邢分电子的运动方向和能量变化。 样品中不同结构不同区域致密度不同 散射程度也不尽相 同，所以穿过样品的出射束是不均匀的电子束柬内电子密度各处互有差异，当其投射到荧 光屏上就会形成描绘结构信息的可见光强度反差图像因此电子显微镜的成像机理是散射。 運动电子在电磁场中 要改变运动轨迹， 磁场强度的变化可以控制电子运动方向偏转角 度的大小轴对称电磁增对电子束的偏转作用相当於玻璃透镜对可见光的作用，具有聚焦、 放大成像的功能形成轴对称电磁插的实体，是被磁屏蔽铁壳包裹起来的通电线圈线圈内 侧开┅狭窄口，狭口处装上对称性非常好的高导磁材料精加工制成的磁极通称为“极靴” 。 线圈上通过电流时就会在极靴间隙产生轴对称電磁场。 电磁透镜的焦距取决于如下因素； U f? ( S ? D ) 2 ( NI ) (1)无论励磁电流的方向如何安匝数(N／)2 总使得焦距 f 是正值，所以电磁透镜恒为 会聚适镜 (2)透镜极靴间隙 S 和内孔径 D 愈小，焦距 f 愈短则电磁透镜的放大倍率就愈大． (3)透镜轴向磁场强度 Hz NI，则 f (S 十 D) 所以电磁透镜的轴向 Hz 愈强，焦距 f 愈短只要調节励磁电流 I，即可以连续改变透镜的放大倍率操作简便。 (4)f?U,即表明电子束的加速电压 U 的波动会引起焦距的变化因此要力求加速电压十 汾稳定。 现代透射电镜整体包括：电子光学系统：真空系统；电气系统；水冷却循环系统和压缩 空气系统等 显微镜主体是电子光学系统，简称为镜筒考虑到机械稳定性，真空度易保性电镜镜 筒都制成直立式的，自下而上由一个个电磁透镜垒起来 镜筒的完整构造，包括以下四大部分 1．照明系统 电子枪――发射电子并加速电子束是以阴极、栅极和阳极三极管式组成。 第一聚光镜――控制电子束束斑直徑大小 第二聚光镜――控制电子束强度，改变照明的强弱程度 此系统的调节用于获得良好的照明束。 2．样品室 样品移动机械装置――迻动样品选择视场 测角台――侧插式进样气锁装置，并用于控制样品与电子束的倾斜角 3．成像放大系统 物镜――形成第一幅高分辨图潒的透镜，物镜电流的变化主要用来聚焦图像． 中间镜一控制图像的放大倍率调节中间镜电流可连续改变放大倍数。 投影镜――它将最終放大图像投射到观察室荧光屏 4. 观察记录系统 观察室――由铝玻璃窗围成的观察室内，装有将电子像转换成可见光反差的荧光屏 照相裝置――随时可把需要的图像拍照记录下来。 电镜正常运行时整个电子光学系统保证在高真空状态，32 察者依靠电气调节操作观 察： 二、汾辨率、放大倍数和反衬度的相应关系

衡量显微镜性能优劣程度最主要的指标是分辨本领 即能够清楚地辨别物体细微结构的 能力。 分辨夲领以能分清两点间的最小距离δ 来度量 愈小能分清的物体细节愈细微， δ 则分 辨本领就愈高人眼的分辨本领为 0.1 一 0.2mm，要观察比这个距離更小的细节需借助显 ? M ? 眼 ?仪 微镜，把细节放大到眼睛能够觉察的程度因此显微镜的放大倍数应为： 电子显微镜的分辨本领 ? 仪＝0.2mm， 人眼嘚分辨能力以 ? 眼=0.2mm 计 M=104 倍． 则 即 人眼要能够分辨清楚 0.2nm 的细微结构， 必须观察放大一百万倍的田像 这样得到的放大倍 数，称为有效放大倍数(M 囿效)比 M 有效更高的放大倍数不能提供更多的信息，不清楚的细节 仍不情楚是“空放大” 。 分辨本领是显微镜的最佳能力 并不意味所囿大干这个距离的红节都能分辨清楚， 往往 会相差很大实际能分辨的效果称为“分辨率” ，分辨率与显微镜的分辨本领的差矩不但和 仪器的工作状态有关更重要的还取决于样品性质。微细结构的形状以及结构与背景的反 差条件等。所以“分辨率”这个概念是用来表达實际放大图像质量的 “反衬度” 是描述结构细节与背景对比的强弱程度， 它直接影响人眼对细节的分辨效果 如果没有明显的反衬度，即使显微镜具有很高的分辨本领判断结构细节仍将发生困难，要 想获得一幅清晰的放大图像不但要求高分辨率，而且要有足够明显的反衬度 电子显微镜的照明源是高速运动的电子束， 其校长比可见光波长短十几万倍 所以受光 波限制的分辨率被电子显微镜大大提高，汾辨本领比光学显微镜高 1 000 倍 达 0.1 一 0.2nm，适用于观察显微结构 三、生物样品的反衬度 作为电镜照明源的电子束， 对于样品结构信息的传递过程 主要是由不带有信息的入射 电子与样品相互作用的散射过程。散射分弹性散射和非弹性散射在弹性散射过程中，入射 电子只改变运動方向而无能量的变化。在非弹性散射过程中入射电子不但要改变运动方 向．能量也随之有不同程度的损失。散射程度因样品“质量厚度”不同而差异所以出射电 子束包含能量不同和方向不同的各种电子， 已带有有关样品结构的信息 而造成荧光屏上的 图像反差。 生粅样品(组织和细胞)主要是由原子序数低的元素碳、氮、氧、氧组成结构电子密度 非常小，散射能力很差用于电镜观察的超薄切片样品，是把生物标本包埋在与它们的原子 组成相似的聚合树脂介质中 标本与树脂二者对电子韵散射作用都很差， 所以样品反衬度很 小．因此苼物样品的反衬度问题比较突出 改善生物样品的反衬度，大体有三个途径： 1. 电子染色处理：常用的染料有锇酸、醋酸双氧铀、柠檬酸铅等这些重金属盐类中 的重金属与组织、细胞的某些成分结合或被吸附以增加结构致密度而提高电子散射能力． 2.降低加速电压： 降低加速電压意味着减小入射电子束的电子能量， 由于电子束穿透力 减少而相应增强了样品的电子散射几率 3. 使用物镜光阀：电子束通过样品时，囿不同散射角度的散射电子利用物镜光阑把 大角度(不大于 0.1 弧度)的散射电子遮挡吸收， 只允许小角度的散射电子穿过小孔经光阑孔 而参与荿像而减少某些部位的电子密度提高图像的反差。 四、电镜样品制备技术和方法 在透射电镜生物样品的制备技术中 超薄切片技术是最偅要最基本的一种。 目前应用的 冷冻切片技术 电镜细胞化学技术、 电镜放射自显影技术等都是以超薄切片技术为基础。 “超 薄切片”是指施用越薄切片机切割样品保证厚度在 0.1nm 以下的切片，最好为 60nm 左右 这样的超薄片才能保证电子束透过样品传递结构信息。良好的超薄切爿应该是薄而均匀， 没有皱折、刀痕、震颤等缺陷尤其在制作过程的各个环节，要力求细胞微细保存良好无 人为假像，染色要适应避免沉淀与污染且具有良好的反衬度。 超薄切片的制作步骤包括： 1．取材：从生活状态的生物体中取得所需材料为尽可能保持原生活狀态的组织结构， 必须操作准确、迅速取样体积小、防损伤。 2．固定：迅速终结细胞活性的过程谓之固定因此取材后要立即进行固定處理。常用

方法是化学固定法固定液有锇酸、醛类、高锰酸钾等。 3．脱水：这一步骤是把组织细胞中的游离水去掉因为水分的存在会使组织结构在电 镜高真空状态下急骤收缩而遭破坏。 另外目前多用非水溶性包埋剂 细胞游离水会影响包埋 剂的浸透，所以脱水是重要步驟常规“梯度脱水法”按 30%?50％?70％?80％?95％ ?100%逐级加大脱水剂的浓度，逐步把水分置换出来脱水剂有乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇 等。 4. 包埋：用包埋剂取代脱水后的组织块中的脱水剂并制成适于超薄切片机易切割的 固体块。常用的包埋块才能切出高所量的连续切片常用的包埋剂囿进口的 Epon812，国产 的 618 等 5. 切片：目前国内多用的超薄切片机是瑞典 LKB 公司产的 LKB III、Ⅵ、V 型和 NOVa 型， 它们是利用样品臂金属杆热胀冷缩的微小长度变囮进行切片的 超薄切片的整个过程为 修块、制刀、切片、捞片等步骤。 6. 染色：将捞到支持钢闯―亡的切片进行电子染色单染法：只用┅种染液染色，大 多是用铅染色效果较好。有些情况为了避免铅的干扰则单独使用铀染色。双染法：先用 醋酸铀染色而后再用柠檬酸铅染色，这是目前普遍采用的方法染色效果较好。染完色的 超薄切片用蒸馏水反复冲洗，除去多余染色液待干燥后即可镜检。 考慮到时间问题 只能在制样室参观切片用的玻璃刀制作表演， 超薄切片机切片和捞片 的操作演示 五、样品的观察、识别和分析 1．学习侧插式样品支架的使用方法，按仪器操作说明书实际操作演示并将准备好的 超薄切片铜网放入支架上。 2．给电镜进样、自动高压获得照明假如电子光学系统已经对中调好状态，那末就用 样品移动杆选择观察视场 调节中间镜电流到适当的放大倍数， 配合调节第二聚光镜选擇合 适的亮度开始观察分析荧光屏上的结构图像。 3. 预先选择准备好的动物或植物样品切片供观察分析 例一、鼠小肠上皮细胞切片 首先茬低放大倍数下(5000 倍左右)对一个铜网孔的切片进行普查。可看到上皮细胞形 状规则排外整齐，细胞间接触紧密随着放大倍增高，可看到仩皮细胞的连接由微绒毛、 微原纤维向内伸延20000 倍的视场内可见上皮细胞的紧密连接，中间连接和桥粒构成的细 胞间的复合连接体 例二、鼠肝细胞超薄切片 观察内容：细胞核(双层核膜，核孔核仁)、粗面内质网(囊状膜上附着核糖体)、光面内 质网、高尔基复合体、线粒体、涪酶体等 例三，玉米叶的超薄切片 在低放大倍数(5 000 倍左右)下观察叶肉细胞，可见完整细胞并易找到叶绿体部位 将此部位移到视场中心，提高放大倍数到 30 000 倍就可看到维管束鞘中的叶绿体不重叠 排列的类囊体。 例四、豌豆根尖超薄切片 观察内容：细胞质问桥连接(胞间连丝)、附有核糖体的内质网、高尔基体、线粒体 4．电镜照片观看 根据本电镜实验室的特色，挑选―批动植物、微生物和病毒等方而的典型电镜照片让 同学学习各种细胞器的结构特征。 作业 1． 比较电子显微镜(EM)和光学显微镜(OM)的异同按要求填写下表： 显 内 容 微 镜 EM OM

照明源 波长 分辨本質 光路介质 透镜 聚焦方式 孔径角 放大倍率 反衬度 2. 区分细胞的显微结构与亚显微结构，写出各种细胞器的名称及结构特征

细胞的显微结构―光学显微镜下的细胞

实验目的 判断和识别光学显微镜下各种细胞器的形态、大小及数目。 实验原理 由于光学显微镜的最高分辨力为 0.2um而細胞器大部分在 0.1um 和 10um 之间，所以 光学显微镜下可见到一般细胞器的外部形态较大的细胞器如细胞核、 质体等还可见到其细微 结构 细胞器往往由特殊物质组成，因而可通过对特异物质的区别染色把各种结构区别开来 每种细胞器都有特殊的形态、大小、分布位置及数目，这也昰我们判断识别细胞大路的依 据。而每种细胞器在不同细胞不同发育时期和不同生理状态下的形态大小会有所不同。所 以细胞器的观察可用来判断细胞的生理状态和发育情况 我们在取材和观察上也要注意各种 细胞器在不同细胞中的特殊性。 实验用品 一、器材 显微镜、載玻片、盖玻片、刀片、注射针头、消毒棉花 二、试剂 Wright 染液： Wright 试剂 0.1g 甲醇 60ml 三、材料 1、切片（见实验方法中所列） 。 2、菠菜叶片 实验方法 紸意观察下列结构 1、细胞核及核仁 （1）不同细胞的核及核仁，蚕豆根尖切片兔肝切片（Unna 试剂染色） （2）多核及多核仁现象，蛙卵切片、鼠肝切片、肌肉切片（Unna 试剂染色） （3）核形态差异耳垂取血，待涂片干Wright 染液染 5 分钟，自来水冲洗后镜检 注意血红细胞无核及白细胞核形态的差异。 （4）异染色质：观察上片中鼓槌分布情况口腔粘膜涂片（地衣红染色） ，吖啶橙染色 的人血涂片（在荧光显微镜下观察） （5）染色体洋葱、蚕豆根尖压片、蟾蜍骨髓涂片、贻贝胚胎压片、玉米花粉母细胞压 片（Giemsa,地衣红或洋红染色） 。 2、中心体 蚰蜒精母细胞、马蛔虫受精卵、蝗虫精巢切片（巴西木素染色） 3、线粒体 洋葱根尖切片、蚕豆根尖切片、兔肝切片、蚰蜒孵母细胞切片（Rubins

或苏木精染色） 。 4、叶绿体 由菠菜叶片上肃下叶肉细胞层镜检，注意类囊体形态数目。 5、高尔基体 兔肝切片、牛神经切片、蚕豆根尖切片（硝酸银或四氧化锇染色） 作业 1、绘制细胞显微镜结构图，把你所见的各种细胞器绘制在一个细胞里注意细胞器外 形特点，大小分布位置数目。 2、查资料回答问题 （1）某些细胞多核及多核仁的原因 （2）异染色质特点及形成原因。

巨噬细胞吞噬现象的观察

实验目的 一、 通過对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察 加深理解细胞吞噬作用的过 程及其意义。 二、掌握小鼠腹腔注射给药和脊椎脱臼处死方法 实验原理 细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方式， 也是原始防御作用 随着动物界 的进化，在高等动物中则发展生荿大小两类吞噬细胞(即巨噬细胞和嗜中性粒细胞)，专司 吞噬作用成为非特异免疫功能的重要组成部分。 巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成 然后进入血液到达各组织内， 并进一步分化为各种巨 噬细胞当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞而巨噬细胞又有趨化性， 能响应招引因子的招引产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行在接触到病原体 或异物时，即伸出伪足将之包围并內吞入胞质，形成吞噬泡继而细胞质中的初级溶酶体 与吞噬泡发生融合， 形成吞噬溶酶体 通过其中水解酶等作用下， 将病原体杀死 消化分解， 最后将不能消化的残渣排出细胞外 实验用品 一、器材 显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、吸管、吸水紙。 二、试剂 1．0.85％生理盐水 0.85g 氯化钠溶于 100mi 蒸馏水中． 2．Alsever 溶液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠(Na9C6H5O7?2H2O) 0.89g 柠檬酸 C6H6O7?H2O) 0.05g 氯化钠 0.42g

加热后加入可溶性淀粉 6.0g 促使溶解， 再煮沸灭菌 4℃冰箱保存． 置 用时水浴融化， 加入适量 4％台盼蓝染液棍匀使呈蓝色。 三、材料 1．小白鼠 2．1%鸡红细胞悬液 自健康鸡翼静脉采血或從集市杀鸡处接血 1mi(防止污染)，放入盛有 4ml Alsever 溶液 瓶中混匀置 4℃冰箱保存备用(一周内使用)。使用前加入 0.85%生理盐水离心(l500r/min l0min) 洗涤二次再用生理盐水配成 l％浓度悬液。 实验方法 一、在实验前―天给小白鼠腹腔注射 6％淀粉肉汤(含台盼蓝)1ml。注射时先用右 手抓住鼠尾提起，放在实验台上用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置 于左手心中把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴与后肢前肢可用Φ指固定，即 可在腹部后 1／2 处的――侧注射进针勿过深，否则易损害肝及血管等造成出血致死． 二、实验时，每组取一只注射过淀粉禸汤的小白鼠．腹腔注射 1％鸡红细胞悬液 1ml 轻按小白鼠腹部，使悬液分散 三、20min 后，用脊脱臼法处死小鼠(右手抓住鼠尾用力向后拉，左掱拇指与食指同 时向下按住鼠头使脊髓与脑髓间断开致鼠死亡)。 四、将小鼠置于解剖盘中剪开腹部，把内脏推向一侧用不装针头的紸射器或吸管吸 取腹腔液。 五、每人取一张干净载玻片．滴―滴腹腔液盖上盖玻片，置显徽镜下观察 实验结果 调节集光器使显微镜视野中光线梢晴些． 在高倍镜下， 先分辨清鸡红细胞和巨噬细胞． 鸡 红细胞是一些淡黄色、椭圆形有核的细胞；而数量较多较大的圆形或鈈规则的细胞，其表 面具有许多似刺毛状的小突起(伪足)胞质中含有数量不等的蓝色颗粒(为吞入的含台盼蓝 的淀粉肉汤形成的吞噬泡)，即為巨噬细胞慢慢移动玻片标本，仔细观察巨噬细胞吞噬鸡 红细胞的过程可见有的鸡红细胞(1～多个)紧附于巨噬细胞表面；有的巨噬细胞巳将 l～ 数个红细胞部分吞入； 有的巨噬细胞已吞入 l 个或几个红细胞在胞质中刚形成椭圆形的吞噬 泡：有的巨噬细胞内的吞噬泡体积缩小，並呈圆形．这是已与初级溶解体发生融合泡内物 正在被消化分解。将自己所观察到的处在不同吞噬阶段的巨噬细胞形态动态地连贯起來， 想一想吞噬作用的全过程 作业 在高倍镜下绘出在不同吞噬阶段的巨噬细胞图各一个(如鸡红细胞附于巨噬细胞表面、 部分吞入红细胞、吞入形成吞噬泡和吞噬泡已开始消化分解等)，示吞噬作用的过程．

微管和中等纤维的免疫荧光观察

I 动物细胞微管的观察 实验目的 用间接免疫荧光法显示动物细胞微管 实验原理 微管(microtubule)是真核细胞所特有并普遍存在的结构，它是由管蛋白(? 和 ? 管蛋 白二聚体)和少量微管结合蛋白(MAPs)聚匼而成的管状纤维在不同类型的细胞中微管具有 相同的基本形态：管蛋白二聚体(dimcr)螺旋盘绕装配成微管的壁，13 个二聚体环绕一周 这是单管。 它们又可以进一步组装成二联管(在纤毛和鞭毛)或三联管(在基体和中心粒) 观 察微管可用电镜和免疫组织化学方法， 其中较常用的有间接免疫荧光技术 用抗管蛋白的免 疫血清(一级抗体， 例如兔抗管蛋白抗体)与细胞一起温育 该抗体将与胞质中的微管(抗原) 特异结合，然后洅加荧光束标记的抗球蛋白抗体(二级抗体例如异硫氰酸荧光索(FITC)标 记的羊抗兔抗体)共同温育，该二级抗体与一级抗体结合从而使微管间接地标上荧光索。

置荧光显微镜下用一定波长激发光照射 即由荧光所在显示出微管的形态和分布。 间接免疫 荧光法特异性和灵敏度高廣泛用于生物大分子或结构的定位和形态显示(图 6-1)。 实验用品 一、材料 1．培养在盖玻片的动物细胞 2．细胞涂片、组织块冰冻切片、石蜡切爿、塑料包埋切片、铺片(小血管、胃肠道、胆 管、心脏等可分层剥离铺片，用甲醛―明胶液粘片在载玻片上注意某些动物细胞微管不发 d，强而非特异性染色阴性为“最佳” 9．甘油―PBS(9：1)，pH 8.5～9.0 二、器材 荧光显微镜、冰箱、毛细吸管、放有湿纱布的铝盒．载玻片、35mm 小染色缸、振荡器、 指甲油。 实验方法 1．细胞培养在裁成小条的盖玻片上长到++一+++时取出，用 PEMP 缓冲液轻轻漂洗细 胞 2．0.5 Triton X―100／PEMP 溶液预温到 37℃，处理细胞 l.5-2minTriton X-100 是非离子型去污剂，可适当增加细胞膜的通透性使抗体容易进入细胞，同时 Triton X― 100 抽提掉若干杂蛋白使胞质背景清晰 3．PEMP 洗细胞二次。 4．用 3.7％甲醛―PEMD 溶液在室温下固定样品 30min 5. PBS 冼二次用滤纸吸干多余的液体