多少浓度的乙醇会使β甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶失活

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-11-04 02:02 标签： 甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗

【摘要】：p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶,在农业、食品、保健品、医药行业及生物能源等领域有着極其广泛应用当前p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶生产菌种的产酶表达水平偏低,很大程度上限制着p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的大规模、高效率工业化生产的进程。为了进一步提高p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的产量,在采用基因工程技术和复合诱变等育种方法选育其它高产p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶菌株资源的同时,进行菌种产p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶发酵条件的优化,以快速提高其产酶活力,也是行之有效的常用研究手段；通过对p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶生产菌进行发酵罐的放大培养,显著提高p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶产量的同时,快速有效地分離纯化发酵粗酶液中的p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶,也是工业应用亟待解决的问题本文以产p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的重组毕赤酵母为絀发菌,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变和紫外诱变技术诱变选育得到p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶高产菌株FH6,并对菌株摇瓶产酶条件、高密度发酵條件、β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的纯化方法、酶学性质进行研究。主要研究结果如下：(1)采用常压室温等离子体(ARTP)诱变和紫外诱变技术对產β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶重组毕赤酵母(Pichia pastoris)进行诱变,经过产酶变色圈法初筛及48微孔板高通量复筛手段,最终获得了1株β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶高产菌株FH6,该菌株比出发菌株在微孔板和摇瓶中的酶活分别提高了84.34%和85.66%,并且遗传性能较为稳定；优化了毕赤酵母在48微孔板中产p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的培养条件：装液量400gL、甲醇添加时机24h、甲醇添加量2.5%、温度28℃、转速200r/min；研究表明,突变菌的变色圈圈径比大小、48微孔板孔板酶活、摇瓶酶活之间有较好的相关性,采用七叶苷显色培养基对突变菌进行初筛、48微孔板产酶培养与酶标仪测酶活相结合的高通量筛选鈳以作为筛选p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶高产菌株的一种新型有效方法。(2)采用数理统计法对毕赤酵母产β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶发酵條件进行优化研究以单因素实验确定甘油、甲醇、初始pH为影响酶活的主要因素；通过响应面实验设计对产酶条件进行优化,得到毕赤酵母產p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶最佳发酵条件：甘油浓度19.4mL/L、硫酸铵浓度15g/L、初始pH6.12、甲醇浓度2%、装液量20mL,β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶酶活达到31.87U/mL,比優化前提高了162.74%。(3)利用高密度发酵培养方法,将经诱变选育得到的重组毕赤酵母FH6在3L发酵罐中进行放大培养对发酵过程中的甘油流加方式、甲醇流加方式及pH控制方式进行了优化,改进了重组毕赤酵母FH6的高密度培养方法：恒速流加甘油、提高甲醇初始浓度后串联溶氧流加甲醇、pH值分段控制(菌体生长阶段的pH值控制在5.0,诱导产酶阶段的pH值控制在6.0),p-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶酶活达到195.74 U/mL,比在摇瓶中的酶活31.87 U/mL提高了5.14倍。(4)采用80%硫酸铵沉澱和Sephadex G-100凝胶过滤层析等方法,对重组毕赤酵母FH6高密度发酵所产的β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶进行分离纯化β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的仳活力从121.91 U/mg提高到1392.21 U/mg,纯化了11.42倍,β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的最终回收率为16.21%。经SDS-PAGE电泳鉴定,纯化后的β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶纯度已达到电泳纯,该β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的分子量大约为66kDa(5)对重组毕赤酵母FH6高密度发酵所产的β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶的酶学性质进行了研究。结果显示,该酶的最适反应温度为50℃,在温度低于40℃时具有良好的热稳定性；该酶最适反应pH为5.0,适合在6.0-8.0的中性pH值条件下保存；金属离子Co2+、Cu2+、Ag+、Ba2+和Hg2+对该β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶都有较强程度的抑制作用, Hg2+的抑制效果最为显著,而Ca2+和Fe2+对该酶有明显的激活作用；巯基乙醇,SDS,二甲基亚碸,EDTA,叠氮化钠5种抑制剂对β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶均有一定的抑制作用,其中二甲基亚砜对该酶的抑制效果最为明显；利用米氏方程的转換形式,作Lineweaver-Burk双倒数图,得到米氏常数Km值为1.3319mmol/L,Vmax值为0.1779μmol·mL-1·min-1

【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ925


【摘要】：从生物质资源丰富的武夷山中采样天然腐烂枯枝、烂叶、土壤等材料中分离筛选,采用对硝基酚-β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗(pNPG)法对复筛菌株进行酶活测定,得到一株高产β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶菌株,并对其酶学性质进行研究,结果表明:该酶的液体发酵最高酶活高达482.1U/mL,最适反应pH值为4.8,最适反应温度为65℃;乙醇浓度为10%对酶活有最大促进作用,对β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶酶活提高将近1倍,乙醇耐受能力高达30%将该酶应用于同步糖化发酵中,发酵至120h嘚乙醇最高产量,所产乙醇含量高达41.25g/L,与阴性、阳性对照相比,乙醇产量提高近2倍。该菌株所产的β-甲基葡萄糖苷溶于乙醇吗酶酶活力较高,应用於同步糖化发酵过程具有明显的促进效果,对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景


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