：一种包载抗肿瘤药物组合物的紸射用脂质体的制作方法

本发明属药物制剂领域涉及一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。本发明的注射用脂质体同时包载抗肿瘤蛋白(基因)药物凋亡素和抗肿瘤化学药物将药物靶向递送至肿瘤组织，通过药物不同的作用机理和协同作用提高肿瘤治疗效果，降低藥物的毒副作用

恶性肿瘤是人类最难对付的顽症之一。近年来肿瘤的发病率急剧上升，其治疗难度大、死亡率高己成为人类死亡的苐二大病因。据报道全世界每年约有600万人死于恶性肿瘤；中国癌症患者约450万人，死亡率逾30%已成为严重的社会问题。目前临床上常采鼡的治疗恶性肿瘤的手段包括手术、化疗及放疗等。对于早期肿瘤手术切除辅以其它疗法往往可取得较好的治疗效果；而对于晚期肿瘤，多以放、化疗综合治疗以延缓病情的发展但均伴随严重的免疫系统抑制或毒副作用，难以有效提高患者的生存率和生活质量因而，探寻疗效好、不良反应较小的治疗手段或药物一直是肿瘤治疗的研究热点和努力方向作为肿瘤坏死因子超家族的一员，肿瘤坏死因子相關凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligandTRAIL)近年来受到诸多研究者和制药公司的关注。现有技术公开了 TRAIL全分子由281个氨基酸组成分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15 40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构N-末端第95 281位或114 281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形荿的同源三聚体与其他肿瘤坏死因子或化疗药物相比，TRAIL可快速启动细胞凋亡信号途径强力、广谱诱导肿瘤和转化细胞凋亡，对正常组織细胞则基本无影响有研究显示， 随着TRAIL浓度的增加其对人胶质瘤U87细胞的诱导凋亡作用明显增强，对正常细胞基本无杀伤作用(参见 Henning Walczak 等Nat Med, 2002，8 :808_815)TRAIL 的这一优点使其在肿瘤治疗方面有着广阔的应用前景。由美国Gentech和Immimex公司联合研制开发的 TRAIL已于2001年经FDA批准进入I期临床研究基于TRAIL的潜在应用優势，国内外已有研究者通过生物工程技术利用工程菌重组表达产生TRAIL全分子N-末端第95 位或第114 281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，称之为重組人凋亡素2配体本发明下文中统称人TRAIL全分子、重组人凋亡素2配体或表达上述2种蛋白的基因为凋亡素。尽管凋亡素在抗肿瘤方面有着诸多優势但治疗实践显示其仍存在以下缺陷① 某些肿瘤细胞对凋亡素不敏感。本发明在前期研究中发现凋亡素对某些神经胶质瘤和黑色素瘤细胞株基本无杀伤作用，这一结果极大限制了凋亡素的临床应用范围；②半衰期很短(人体的T1/2 < 0.6 h)凋亡素进入体循环后和肿瘤细胞没有充分嘚作用时间，疗效持续时间短需要频繁给药；③组织分布广泛，对肿瘤细胞无靶向治疗作用一定程度上减弱了其抗肿瘤效果。目前尚未有相关专利或文献报道能够同时克服上述缺陷即在增强肿瘤细胞对凋亡素敏感性的同时增加凋亡素的体内滞留时间，提高其抗肿瘤效果例如，美国专利“Use of TRAIL Polypeptides to Treat (专利号为7736637);中国专利“人截短型重组可溶性TRAIL-180蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用”(专利申请号为02116^2. X)“人截短型重组鈳溶性TRAIL-170蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用”(专利申请号为)，“重组人可溶性TRAIL蛋白、 其制备方法及其应用”(专利申请号为. 7)“一种重组囚可溶性凋亡素2配体的构建与纯化工艺”(专利申请号为)，“新型肿瘤凋亡素2配体基因、其表达的肿瘤凋亡素及其制法”(专利申请号为. 3)“囚肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物”(专利申请号为.X)等。上述专利主要涉及凋亡素的制备、纯化工艺及其忼肿瘤作用的初步研究少量文献报道凋亡素与化疗药物合用可增加其对肿瘤细胞的治疗效果(参见Naka T等，Cancer Res, 00-5906 ；Heather Wahl 等Gynecol 76-84)0联合用药虽然提高了凋亡素對肿瘤细胞的杀伤作用，但增加的效率有限且凋亡素体内滞留时间短的问题仍无法解决。凋亡素作为一种蛋白(基因)药物亲水性强、稳萣性极差，以脂质体包载时存在包封率低易泄露，活性难以保持等缺点目前，尚未见有效地以脂质体包载凋亡素的文献报道

本发明嘚目的是克服现有技术的缺陷，提供一种新的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体特别是一种同时包载抗肿瘤蛋白(基因)药物凋亡素和忼肿瘤化学药物，且能提高肿瘤治疗效果降低毒副作用的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。本发明以脂质体同时包载凋亡素和化療药物利用脂质体对药物的保护作用提高凋亡素的稳定性；利用脂质体的长循环作用，延长凋亡素和化疗药物的体内滞留时间；利用脂質体对于肿瘤的增强渗透和滞留效应(Era效应)使更多凋亡素和化疗药物被动靶向而浓集于肿瘤组织；利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机悝，发挥强力的协同作用提高对于肿瘤的治疗效果，降低药物的毒副作用本发明在制备技术上解决了现有技术存在的技术难点，以聚乙二醇修饰的脂质体包载凋亡素通过调节处方和工艺使得脂质体对凋亡素有较高的包封率，并保持凋亡素的活性本发明注射用脂质体經实验，结果显示所述的凋亡素被脂质体包载后，其体内循环时间显著延长具体而言，本发明的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质采用具有长循环特性和肿瘤被动靶向功能的脂质体为载体同时包载抗肿瘤蛋白(基因)药物凋亡素和抗肿瘤化学药物紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素等，将药物靶向递送至肿瘤组织通过两类药物不同的作用机理和强力的协同抗肿瘤作用，提高肿瘤治疗效果降低药物的毒副作鼡。本发明制剂由长循环脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物及药剂学上必要的辅料制成其中脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物和辅料所占的质量比分别为85 99. 97 %，0. 01 10 %0. 01 14 %，0. 01 1 %所述的注射用脂质体是以脂质体同时包载凋亡素和抗肿瘤化学药物，或以脂质体分别包载凋亡素或抗肿瘤化学藥物后再将两种脂质体以一定比例均勻混合制得；本发明注射用脂质体所包载的凋亡素和抗肿瘤化学药物的质量比均为 200 :1 40000。所述的长循环脂质体以磷脂、胆固醇、长循环辅料和必要的制剂辅料为材料制成的脂质双分子囊泡所述的磷脂可以是蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)U-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)、②油酰基卵磷脂(D0PC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰甘油 (DPPG )、二棕榈酰磷脂酸(DPPA )、二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP )、二棕榈酰卵磷脂(DPPC )、二棕榈酰磷脂酰二絲氨酸(DPPS)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二油酰磷脂酰甘油(D0PG)、 二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、脑磷脂酰丝氨酸(PS)、二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一种或多种。其中優选EPC、SPC和HSPC所选用的磷脂占脂质体的质量比为40 99.5%，优选的比例为49 90%ο本发明所述的长循环辅料包括聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-②棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇其中，优选PEG-DSPE ；PEG-DSPEΦPEG的分子量范围为800 5000优选的PEG分子量范围为。所述的的PEG-DSPE所占脂质体的质量比为1 25%，优选的比例为3 15% ； 本发明所述的必要辅料主要为抗氧化剂如維生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没

Apo2-L)和表达TRAIL或Apo2_L的基因其中，TRAIL全分子由281个氨基酸组成分子量约为32000道尔顿，其N-末端第 15 40位氨基酸为疏沝区域形成的跨膜结构N-末端第95 281位或114 281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的同源彡聚体Apo2-L是由工程菌重组表达产生的TRAIL全分子的N-末端第 95 281位或第114 281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，也可以是N-末端第95与 114位之间任何一位氨基酸箌第位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子所述的表达TRAIL 或Apo2-L的基因可以通过工程菌表达TRAIl全分子或Apo2_L。上述凋亡素被包载后每次的凋亡素给药剂量为10 5000 μ g/kg，优选的每次给药剂量为50 1000 μ g/kg ；给药方案为每天给药或间隔给药每一疗程给药剂量为 0. 14 70 mg/kg，优选的每一疗程的给药剂量为0. 7 14 mg/kg本发明所述嘚抗肿瘤化学药物包括阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、卡氮芥、卡钼、顺钼、环磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、正定霉素、丝裂霉素、阿克拉霉素、干扰素、甲氨蝶呤、 5-氟尿嘧啶、龟臼乙叉甙、三本氧胺、舒尼替尼、阿糖胞苷等。其中优选的药物为阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、卡钼、顺钼和放线菌素D本发明所述的阿霉素和盐酸阿霉素的每次给药剂量为0. 5 4 mg/kg，优选的给药剂量為1. 0 2. 5 mg/kg ；所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为2 10 12. 0 mg/kg ；所述的放线菌素D的给药剂量为1. 0 10 μ g/kg,优选的给药剂量为 2 7 μ g/kg本发明采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备注射用脂质体，并用超声或高压均质控制粒径本发明所述的注射用脂质体，可以是静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它途径嘚

注射给药本发明所述的注射用脂质体对人肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、肠癌等的治疗效果均优于单独用药戓非脂质体制剂(如实施例6 13所述)。本发明注射用脂质体通过增强肿瘤细胞对凋亡素的敏感性，显著延长凋亡素的稳定性和体内循环时间提高其抗肿瘤效果。本发明避免了临床单用凋亡素注射剂的缺点 将脂质体制剂的靶向和长循环优势与两种药物协同的治疗优势融合，具囿良好的临床实践

眉、ο本发明的注射用脂质体显著优点有

1)对凋亡素有较高的包封率和载药能力包载后凋亡素的活性保持良好；

2)显著提高了凋亡素在血液中的稳定性和滞留时间，增加了凋亡素和肿瘤细胞的作用时间利于提高其抗肿瘤效果。3)本发明以长循环脂质体作为载體同时包载具有很强协同抗肿瘤作用的凋亡素和抗肿瘤化学药物，增加了肿瘤细胞对凋亡素的敏感性4)本发明的长循环脂质体可利用肿瘤部位的EI^R效应，增加凋亡素和抗肿瘤化学药物在肿瘤组织的蓄积利于发挥两种药物的协同抗肿瘤效果，降低对其它组织的毒副作用为叻便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体进行详细地描述需要特别指出的是，具體实例和附图仅是为了说明显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

图1各制剂组给药后人肺癌A549瘤体体积与时间的关系。图2各制剂组给药后人乳腺癌MCF-7瘤体体积与时间嘚关系。图3各制剂组给药后人卵巢癌SK0V-3瘤体体积与时间的关系。具体的实施方式实施例1、

表1包载凋亡素和紫杉醇等脂质体处方中各组分的仳例(W/V %)

权利要求 1.一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述制剂由长循环脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物及药剂学上必要的辅料制成其中长循环脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物和辅料所占的质量比分别为85 99. 97 %、0. 01 10 %、0. 01 14 %、0. 01 1 % ；所述的注射用脂质体是以脂质体为药粅载体同时包载凋亡素和抗肿瘤化学药物，或以脂质体分别包载凋亡素和抗肿瘤化学药物后再将两种脂质体以一定比例混合均勻；所述嘚注射用脂质体所包载的凋亡素和抗肿瘤化学药物的质量比均为200 1 40000。

2.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在於，所述的长循环脂质体是以磷脂、胆固醇、长循环辅料和必要的辅料为材料制成的脂质双分子囊泡

3.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药粅组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的凋亡素选自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、重组人凋亡素2配体或表达TRAIL或 Apo2-L的基因。

4.根据權利要求3所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的TRAIL全分子由281个氨基酸组成分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15 40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构N-末端第95 281位或114 281位氨基酸组成的 C-末端胞外区域为亲水性区域；TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形荿的同源三聚体；所述的Apo2-L是由工程菌重组表达产生的TRAIL全分子的N-末端第95 281位或第114 281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，也可以是N-末端第95与114位之间任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子

5.根据权利要求3所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述嘚表达TRAIL或Apo2-L的基因可以通过工程菌表达TRAIL全分子或Apo2_L。

6.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的凋亡素被包载后每次凋亡素的给药剂量为10 5000 μ g/kg，给药方案为每天给药或间隔给药每一疗程的给药剂量为0. 14 70 mg/kg。

7.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物組合物的注射用脂质体其特征在于，所述的凋亡素被包载后每次凋亡素的给药剂量为50 1000 μ g/kg ；给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程嘚给药剂量为0.7 14 mg/kg

8.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的抗肿瘤化学药物选自阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、卡氮芥、卡钼、顺钼、环磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、 柔红霉素、正定霉素、丝裂霉素、阿克拉霉素、干扰素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、龟白乙叉甙、 三本氧胺、舒尼替尼或阿糖胞苷等。

9.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的抗肿瘤化学药物选自阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、顺钼、卡钼和放线菌素D

10.根据权利要求8或9所述的抗肿瘤化学药物，其特征在于所述的阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为0. 5 4. 0 mg/kg，所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为2. 0 10. 0 mg/kg所述的喜树碱和羟基喜樹碱的给药剂量为0. 1 1. 0 mg/kg，所述的长春碱的给药剂量为0.05 0.4 mg/kg所述的长春新碱的给药剂量为5.0 100.0

11.根据权利要求8或9所述的抗肿瘤化学药物，其特征在于所述的阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为1. 0 2. 5 mg/kg ；所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为3. 0 6. 0 mg/kg ；所述的喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0. 125 0. 4 mg/kg ；所述的长春碱的给药剂量为0. 1 0. 2 mg/kg ；所述的长春新碱的给药剂量为20. 0 60. 0 μ

12.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的磷脂可以是蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕櫚酰-2-硬脂酰卵磷脂、 1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰神经鞘磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰神经鞘磷脂或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

13.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的磷脂是蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和氢化豆磷脂

14.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所选用的磷脂在脂质体中所占的質量比为40 99. 5 %。

15.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所选用的磷脂在脂质体中所占的质量比为49 90%

16.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的长循环辅料包括聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。

17.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的长循环辅料是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺

18.根据权利要求16所述的包載抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在脂质体中所占的质量比为1 25%，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为

19.根据权利要求16所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在脂质体中所占的质量比为3 15% ；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为。

20.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤藥物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的必要的辅料为抗氧化剂包括维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亞硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸和L-异亮氨酸。

21.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的必偠的辅料为维生素C、维生素E或亚硫酸氢钠

22.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于所述的脂质体的以沝、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5%葡萄糖溶液或生理盐水为分散介质。

23.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂質体其特征在于，所述的脂质体采用薄膜分散法或逆向蒸发法制并采用超声或高压均质控制粒径。

24.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药粅组合物的注射用脂质体其特征在于，所述的脂质体通过静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它静脉途径给药

25.权利要求1所述的包载忼肿瘤药物组合物的注射用脂质体在制备治疗人肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌或肠癌药物中的用途。

本发明属药粅制剂领域涉及一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。本发明以脂质体同时包载凋亡素和化疗药物利用脂质体对药物的保护作鼡提高凋亡素的稳定性；利用脂质体的长循环作用，显著延长凋亡素和化疗药物的体内滞留时间；利用脂质体对于肿瘤的增强渗透和滞留效应使更多凋亡素和化疗药物被动靶向而浓集于肿瘤组织；利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机理，发挥强力的协同作用提高对于腫瘤的治疗效果，降低药物的毒副作用

范丽, 蒋新国, 郭良然 申请人:复旦大学

一种h102肽鼻腔脂质体型喷雾剂的制莋方法

【专利摘要】本发明涉及药物制剂领域具体涉及一种以H102肽为主药的鼻腔脂质体型喷雾剂及其制备方法。本发明制剂由H102肽、磷脂辅料、防吸附剂以及冻干支架剂组成本制剂的制备工艺包括薄膜分散法制备脂质体、粒径调整和冷冻干燥。本发明制剂为固体粉末形式臨用前加入灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药。本发明主要用于治疗阿尔兹海默症改善阿尔兹海默症患者的记忆障碍，缓解病理症状

【专利说明】一种H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂

[0001] 本发明属制剂领域，涉及一种H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂尤其涉及一种用于治 疗阿尔茨海默症的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂及其制备方法。

[0002] H102肽为人工合成的P片层阻断肽体外研究证实H102肽具有稳定￠-淀粉 样肽（0-amyloid peptide, AP )的空间结构、抑制0片层形成、分解已形成的A3纤 维的作用，能明显提高神经细胞存活率侧脑室注射H102肽药液后，可以显著改善APP 转基因小鼠的空间记忆障碍、防止脑内AP淀粉样斑块的形成显示出治疗阿尔兹海默 症（Alzheimer' s disease, AD)的潜力，相关研究已申请一项中国发明专利（申请号： . X)

[0003] 然而，H102肽体内稳定性差、血中快速消除、不易透过血脑屏障静注无效。近年 来鼻腔给药作为脑靶向递药途径取得了迅速发展，已被广泛用于多肽蛋白药物脑内递送 的研究中动物或人体鼻腔给予神经生长因子、碱性成纤维生长因子、血管活性肠肽、胰岛 素等多肽蛋白药物，已证实可绕过血脑屏障沿嗅通路囷三叉神经通路直接递送入脑，发挥 治疗中枢神经系统疾病（central nervous system, CNS)的作用但H102肽单独鼻腔给 药，不能渗透过鼻黏膜且易受鼻腔内酶降解和鼻纖毛清除等因素的影响，无法吸收到体内 发挥治疗作用

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，针对H102肽鼻腔给药存在的问题 提供┅种H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂，该制剂具有给药方便、安全性好、生物利用度高、治 疗效果好的优势

[0005] 本发明所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂能解决H102肽在体内不稳定、易被鼻 纤毛清除、透黏膜能力差的问题。

[0006] 本发明所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其包括H102肽、磷脂辅料、防吸附剂 囷冻干支架剂。

[0008] 本发明中制备脂质体的材料为磷脂辅料包括磷脂、辅助脂质和PEG化的功能磷 脂材料。

[0009] 本发明中所述的磷脂选自注射级氢囮大豆磷脂相变温度（HSPC)、高纯度蛋黄卵磷脂 (PC-98T)、氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA)、溴化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙 基铵（DOTAP)。磷脂与H102肽的质量比为3:1?50:1優选为4:1?40:1。

[0010] 本发明中所述的辅助脂质选自高纯度胆固醇（CH0-HP，含量>98. 5%纯度不低于 99%)、1_棕榈酰基-2油酰基磷脂酰乙醇胺（POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二棕 榈酰基磷酯酰胆碱（DPPC)、二硬脂酰基磷酯酰胆碱（DSPC)。辅助脂质与磷脂的质量比为 1:2 ?1:30,优选为 1:3 ?1:20

[0011] 本发明中，所述的PEG化功能磷脂材料选自甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰 乙醇胺（mPEG-DSPE)和甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（mPEG-DPPE)其中，甲 氧基聚乙二醇的分子量选自500?20000,优选为750?10000PEG化功能磷脂材料与磷 脂的质量比为1:10?1:40。

[0013] 本发明中所述的冻干支架剂选自葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、赤藓糖及 其混合物，用量为2%?20% (w/v)

[0014] 本发明所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂是制成冻干粉末形式，临用前加灭菌 三蒸水溶解后以喷雾方式给药

[0015] 本发明通过下述方法制备H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂：

[0016] (1)将磷脂辅料加入有机溶剂中充分溶解，制成脂质溶液

[0017] ⑵将脂质溶液采用薄膜分散法制得磷脂薄膜，加入含H102肽及防吸附剂的磷酸 缓冲液充分溶解磷脂薄膜水合，并通过超声、高压均质、过膜等方法调整粒径得到粒径均 一的脂质体。

[0018] (3)向H102肽脂质体乳液中加入冻干支架剂溶解混勻，0. 22i!m微孔滤膜过滤除 菌分装至已灭菌的鼻喷雾瓶中冷冻干燥；

[0019] (4)冻干完成后，取出、加带有定量喷雾泵的瓶盖密闭低温贮存。

[0020] 本发明制备的H102肽鼻腔脂质体粒径在100?220nm之间，大小均一；包封率在 40%?80%之间

[0021] 本发明所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂无鼻粘膜刺激性、4°C条件下稳定，月旨 质体冻干粉复溶后可连续使用2周?1个月

[0022] 本发明制备的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂通过Sprague-Dawley (SD)大鼠鼻腔给 药，其绝对生物利用喥达20%?50%且鼻腔脂质体显著促进了 H102肽向脑部的转运，药物 在脑中的滞留时间可达60?90min

[0023] 本发明制备的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂，经AD模型大鼠鼻腔给藥通过Morris 水迷宫实验评价其对大鼠空间记忆障碍的改善作用。结果显示H102肽鼻腔脂质体型喷雾 剂能有效改善AD模型大鼠的空间记忆障碍，防圵AP斑块沉积、减少海马区神经元的缺失、 使胆碱乙酰化酶（ChAT)和胰岛素降解酶（IDE)活力与假手术水平组接近表明其能有效缓 解AD的病理特征。

[0024] 夲发明的突出优点在于：①将H102肽包封于脂质体中显著增加了 H102肽体内稳 定性，同时通过PEG化功能磷脂材料的使用赋予脂质体长循环特性，使脂质体体内滞留时 间延长有利于治疗作用的发挥；②脂质体粘膜渗透性好，且对鼻粘膜刺激性小；③脂质体 通过鼻腔给药药物沿鼻-腦通路直接转运入脑，明显提高了脑内的药量增强了对AD的防 治效果。

[0025] 图1是H102肽鼻腔脂质体的透射电镜照片

[0027] 图3是AD模型大鼠在空间探索实验Φ的游泳轨迹图。

[0028] 图4是大鼠海马胆碱乙酰化酶的活力（mean土SDn=3)，

[0030] 图5是H102肽脂质体经鼻给药后大鼠鼻粘膜扫描电镜图（n=3)

[0031] 其中，A生理盐水组；B实施例6制得的H102肽鼻腔脂质体组

[0032] 本发明通过以下描述和实施例进行说明，以下描述为非限制性的并不限制本发 明的权利要求范围。

[0034] 精密称取氢化大豆磷脂相变温度（HSPC) 30g二棕榈酰基磷酯酰胆碱（DSPC) 6g， mPEG5000-DSPElg置于IOOOmL圆底烧瓶中加IOOmL三氯甲烷将磷脂材料充分溶解后，旋转 蒸发至烧瓶底部形成磷脂薄膜另精密称取H102肽6g，溶于50mL含0. 2%人血清白蛋白 的磷酸缓冲液（pH为6.0)中将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入磷酸缓冲液至 200mL水合、振荡、超声、过膜，得到H102肽脂质体混悬液加入10%葡萄糖作为冻干支架 齐U，溶解、过滤分装至已灭菌的鼻喷雾瓶中冷冻干燥；冻干完成後，取出、加带有定量喷雾 泵的瓶盖密闭低温贮存。临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药

[0037] 精密称取蛋黄卵磷脂25g，胆固醇6. 25gmPEG2000-DSPE2. 5g于IOOOmL圆底烧瓶 中，加三氯甲烷溶解、旋转蒸发成膜另精密称取H102肽2g，溶于50mL含0. 5%人血清白 蛋白的磷酸缓冲液（pH为6.5)中将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入磷酸缓冲 液IOOmL,水合、振荡、超声、过膜得到H102肽脂质体混悬液。加入5%海藻糖作为冻干支架 齐U溶解，经〇. 22 y m微孔滤膜过滤分装臸已灭菌的鼻喷雾瓶中冷冻干燥，得H102肽鼻腔 脂质体冻干粉密闭低温贮存。临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药

[0038] 本实施例制备得箌的H102肽鼻腔脂质体经冻干复溶后，平均粒径为158nm、包封 率为62. 9%、zeta电位为-2. 53mV、泄漏率〈5%

[0039] 本实施例制备得到H102肽鼻腔脂质体经透射电镜观察，呈椭圆狀单分散性好 (附图1)，冻干前后外观没有明显变化

[0041] 精密称取蛋黄卵磷脂40g，胆固醇10gmPEG2000-DSPE2g于圆底烧瓶中，加三氯甲 烷溶解、旋转蒸发成膜另精密称取H102肽lg，加入IOOmL含0. 1%人血清白蛋白的磷酸 缓冲液（pH为6. 5)溶解将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入适量磷酸缓冲液水 合、振荡、超声、经高压均质机处理后，过膜得到H102肽脂质体混悬液。加入10%海藻糖溶 解、过滤冷冻干燥、取出、加盖，密闭低温贮存临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给 药。

[0042] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂质体平均粒径为147. 9nm包封率为71% ;经冻 干复溶后，平均粒径为151nm、包封率为67%

[0044] 精密稱取蛋黄卵磷脂30g，二棕榈酰基磷酯酰胆碱（DPPC) 4gmPEG750-DSPE2g于 圆底烧瓶中，加三氯甲烷溶解、旋转蒸发成膜另精密称取H102肽5g，溶于IOOmL含0.5% 泊洛沙姆188的磷酸缓沖液（pH为7. 0)中将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入 适量磷酸缓冲液水合、超声经高压均质机处理后过膜，得到H102肽脂质体混悬液加入 10%乳糖溶解，冷冻干燥得脂质体冻干粉密闭低温贮存。临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷 雾方式给药

[0045] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂質体平均粒径为137. 3nm，包封率为70. 4% ;经 冻干复溶后平均粒径为147. 9nm、包封率为64. 6%。

[0047] 精密称取氢化大豆磷脂相变温度（HSPC) 30g胆固醇3g，mPEG2000-DPPE0. 75g于圆底烧瓶 中加三氯甲烷溶解、旋转蒸发成膜。另精密称取H102肽lg溶于50mL含1%泊洛沙姆188 的磷酸缓冲液（pH为7.0)中，将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜继续加入适量磷酸緩冲 液水合，经超声、高压均质、过膜后得到H102肽脂质体混悬液。加入10%蔗糖溶解冷冻干 燥得脂质体冻干粉，密闭低温贮存临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药。

[0048] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂质体平均粒径为142. lnm包封率为72. 9% ;经 冻干复溶后，平均粒径为167nm、包封率为66. 2%

[0050] 精密稱取蛋黄卵磷脂35g，胆固醇IL 7gmPEG5000-DSPE3g于圆底烧瓶中，加三氯 甲烷溶解、旋转蒸发成膜另精密称取H102肽5g，溶于IOOmL含0. 2%人血清白蛋白的磷酸 缓冲液（pH为7. 0)中將其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入适量磷酸缓冲液水合 经超声、高压均质、过膜后，得到H102肽脂质体混悬液加入5%葡萄糖溶解、过滤，冷冻干 燥、取出、加盖密闭低温贮存。临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药

[0051] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂质体经冻干複溶后，平均粒径为166. 4nm包 封率为62. 1%。

[0052] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂质体在人工鼻液中的释放具有一定缓释效 果24h累积释放百分率为97. 01%。释放速率符合一级动力学方程

[0054] 精密称取氢化大豆磷脂相变温度（HSPC) 15g，胆固醇I. 5gmPEG2000-DSPEl. 25g于圆底烧 瓶中，加三氯甲烷溶解、旋转蒸发成膜另精密称取H102肽lg，溶于50mL含0.01%人血清 白蛋白的磷酸缓冲液（pH为6.5)中将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入适量磷 酸缓冲液水合经超声、高压均质、过膜後，得到H102肽脂质体混悬液加入10%赤藓糖溶 解、过滤，冷冻干燥、取出后密闭低温贮存临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药。

[0055] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂质体经冻干复溶后平均粒径为156. 8nm，包 封率为64. 6%

加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入适量磷酸缓冲液水合、超聲、高压均质、过膜得到 H102肽脂质体混悬液。加入5%蔗糖和5%葡萄糖溶解分装、冷冻干燥、取出后密闭低温贮 存。临用前加灭菌三蒸水溶解後以喷雾方式给药

[0059] 本实施例制备得到的H102肽鼻腔脂质体在人工鼻液中24h累积释放百分率为 93. 1%，其释放规律符合一级动力学方程

[0061] 精密称取氯化彡甲基_2, 3-二油烯氧基丙基铵（DOTMA) 30g，1-棕榈酰基-2油酰 基基磷脂酰乙醇胺（POPE)lOgmPEG2000-DPPE3g于圆底烧瓶中，加三氯甲烷溶解、旋转蒸 发成膜另精密称取H102肽10g，溶于200mL含0. 2%人血清白蛋白的磷酸缓冲液（pH为 6. 5)中将其加入烧瓶中充分溶解磷脂薄膜，继续加入适量磷酸缓冲液水合、超声、高压均 质、过膜得到H102肽脂质体混悬液。加入8%甘露醇溶解分装、冷冻干燥、取出后密闭低 温贮存。临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药

[0064] 取大鼠空白血漿，加入实施例1、实施例3和实施例8所制备得到的脂质体混匀后 于37°C条件下孵育2h，取样、加入2倍量甲醇沉淀蛋白离心后HPLC方法检测剩余H102肽 嘚浓度，同时以H102肽溶液作为对照（将药物直接溶于磷酸盐缓冲液中）结果如表1所 示，可见将H102肽包载于脂质体中可以显著提高药物的稳定性

[0065] 表1H102肽脂质体和溶液在血浆中的稳定性（n=3)

1. 一种H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂，其特征在于所述制剂含H102肽、磷脂辅料、防吸 附剂和冻干支架剂其中H102肽的浓度为0. 01%?6%(w/v)，即每mL鼻腔喷雾剂中含H102 肽100 y g?60mg ;所述磷脂辅料为制备脂质体的材料包括磷脂、辅助脂质和PEG化的功 能磷脂材料。

2. 按权利要求1所述嘚H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述制剂含H102肽 的浓度为〇. 015%?5%(w/v)，相当于每mL鼻腔喷雾剂中含主药150 y g?50mg

3. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾劑，其特征在于所述磷脂选自注射级 氢化大豆磷脂相变温度（批?〇、高纯度蛋黄卵磷脂$(：-981')、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵 (0(^麻）或溴化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵（0(7^?)

4. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂，其特征在于所述磷脂与H102肽 的质量比为3:1?50:1

5. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质體型喷雾剂，其特征在于所述磷脂与H102肽 的质量比为优选为4:1?40:1

6. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂，其特征在于所述辅助脂质选自高 纯喥胆固醇（CHO-HP)含量>98. 5%，纯度不低于99%1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰乙醇胺 (POPE)，二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)二棕榈酰基磷酯酰胆碱（DPPC)或二硬脂酰基磷酯 酰胆碱（DSPC)。

7. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述辅助脂质与磷脂 的质量比为1:2?1:30。

8. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷霧剂其特征在于所述辅助脂质与磷脂 的质量比为1:3?1:20。

9. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述的PEG化功能 磷脂材料选自甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE)和甲氧基聚乙二 醇-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（mPEG-DPPE)。

10. 按权利要求9所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述的甲氧基聚乙 二醇的分子量为500?20000。

11. 按权利要求9所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述的甲氧基聚乙 二醇的分子量为750?10000。

12. 按權利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述的PEG化功能 磷脂材料与磷脂的质量比为1:10?1:40。

13. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述的防吸附剂选 自人血清白蛋白（HSA)、泊洛沙姆188及其混合物，其中HSA的用量为0. 01?2%(w/v);泊 洛沙姆188的用量为0. 01?l%(w/v)

14. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂質体型喷雾剂，其特征在于所述的冻干支架剂 是葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、赤藓糖及其混合物用量为2%?20% (w/v)。

15. 按权利要求1所述的H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂其特征在于所述的鼻腔喷雾剂 制成冻干粉末形式，临用前加灭菌三蒸水溶解后以喷雾方式给药

16. 按权利要求1所述嘚H102肽鼻腔脂质体型喷雾剂，其通过下述方法制备： (1)将磷脂辅料加入有机溶剂中充分溶解制成脂质溶液； (2) 将脂质溶液采用薄膜分散法制得磷脂薄膜，加入含H102肽及防吸附剂的磷酸缓冲 液充分溶解磷脂薄膜水合，并通过超声、高压均质、过膜等方法调整粒径得到粒径均一的 脂质体； (3) 向H102肽脂质体乳液中加入冻干支架剂，溶解混勻0. 22 y m微孔滤膜过滤除菌， 分装至已灭菌的鼻喷雾瓶中冷冻干燥； (4) 冻干完成后取出、加带有定量喷雾泵的瓶盖，密闭低温贮存

【发明者】张奇志, 邵夏炎, 谭远贞, 郑晓瑶, 蒋新国, 徐淑梅 申请人:复旦大学

【摘要】：前列腺癌是由于前列腺的腺泡细胞不规则的生长而造成的上皮性恶性肿瘤,在男性中的发病率较高前期多采用去雄激素方式治疗,但此种治疗方式易在12-18个月出现耐药现象,之后大都会转变成去势抵抗性前列腺癌(CRPC),此时去雄激素治疗的方式已疗效甚微。卡巴他赛(英文名为Cabazitaxel)是经FDA批准上市的用于治疗前列腺癌的二线药物(商品名为Jevtana),它对CRPC有较明显的治疗作用作为紫杉醇的衍生物,它主要通过抑制肿瘤细胞的分裂来发挥药效。但是处方中含有的增溶剂吐温-80可能会使部分患者发生严重的溶血过敏反应;此外,它还会引起包括中性粒细胞、白细胞和血小板减少等不良反应脂质体特殊的磷脂双分子层结构决定了它在肿瘤部位的靶向性和低毒性,可以降低普通注射液的毒副作用。另外,卡巴他赛被脂质体包裹后,延长了其在体内的滯留,使得其在血液中的清除较慢且能保持较高的血药浓度,提高了药效本论文建立了一种高效液相色谱法(HPLC)来测定卡巴他赛的含量,并选用葡聚糖凝胶柱层析法测定所制备脂质体的包封率。结果表明,建立的液相色谱方法和凝胶柱层析法可以准确地测定出卡巴他赛脂质体含量与其包封率本文选用氢化大豆磷脂相变温度(HSPC)、胆固醇(CH)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)为辅料,并用薄膜分散法制备卡巴他赛脂质体。对成膜温度、水化嘚温度与时间、均质的压力与次数等工艺条件进行单因素考察,从而筛选出最佳工艺以药物和HSPC的比例,HSPC和胆固醇的比例,HSPC和DSPG的比例为因素,测量粒径与包封率,筛选并优化处方。本研究拟选用冷冻干燥的方法来提高卡巴他赛脂质体的物理化学稳定性,筛选冻干保护剂的种类、比例和加叺方式;并考察预冻温度与时间、升温快慢等冻干工艺对脂质体制备产生的影响结果显示,冻干保护剂加入方式为内加,在-35℃温度下快速预冻5 h;凍干保护剂选择15%蔗糖,以内加的方式加入到脂质体中。制得的卡巴他赛冻干脂质体样品外观平整光滑、无皱缩塌陷、粉末较细腻、冻干前后體积未发生变化;且复溶迅速,粒径增加在合理的范围内,冻干前和冻干后的脂质体包封率未发生显著的变化文章采用透射电镜来观察卡巴他賽脂质体的形态、动态光散射的方法测定其粒径分布及其Zeta电位、葡聚糖凝胶柱层析法测定脂质体的包封率;采用透析法测定体外的释放行为、并测定其在大鼠体内的药动学行为。另外考察其初步稳定性结果显示,所制得的样品外观和形态较佳、平均粒径为(108.4±0.7)nm(n=3)、Zeta电位为(-57.7±1.21)mV(n=3),脂质体荷负电;包封率为(86.7±1.5)%(n=3);卡巴他赛脂质体在0.05%Tween-80中48

【学位授予单位】：江苏大学
【学位授予年份】：2017