列举RNA提取的最关键的3个实验步骤,并说明其技术要求及...6)预杂交,用100度变性的鲑精DNA,50度预杂交1小时...对整个原核表达质粒的构建和蛋白质诱导表达的理解及...
分析技术。此项技术的原理,是根据检体中蛋白质分子量大小的不同,使其在电泳胶中分离。在
外源蛋白的实验中,SDS-PAGE更是必不可少的操作,其通常用于检测蛋白的表达情况(表达量,表达分布),以及分析目的蛋白的纯度等。
蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷,为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关,我们在上样前,通常会进行一些处理(上样
缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠
(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一种阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构; β-巯基乙醇是强还原剂,它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后,经过高温处理,其目的是将SDS 与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷;另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于监控整个电泳过程;另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极,下方为正极),在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶,使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
电泳启动时,蛋白样品处于pH6.8 的上层,pH8.8 的分离胶层在下层,上槽为负极,下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续:启动时Cl?解离度大,Pro?解离度居中,甘 aaCOO?解离度小,迁移顺序为(pH6.8)Cl?> Pro? >—COO?。在 Cl?与 Pro?之间和 Pro?与—COO?之间都将出现低离子区,同时也出现高电势,高电势迫使 Pro?向 Cl?迁移,—COO?向 Pro?迁移。如:一个 Cl?领路,—COO?推动,蛋白在中间,这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中,由于胶联度小,孔径大,Pro?受阻小,因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层,起浓缩效应,使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时,此时Pro?,Cl?,甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中,Cl?完全电离而很快到达正极,甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质,而到达正极,只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro?在电泳过程中,受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化,但每一瞬间,其所带电荷数除以单位质量是不同的,所以带负电荷多者迁移快,反之则慢,这就现了电荷效应。由于胶孔径小,而且成为一个整体的筛状结构,它们对大分子阻力大,小分子阻力小,起着分子筛效应,也就是蛋白质在分离胶中,以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异,最终达到彼此分开。
PAGE 胶的聚合原理:甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合,形成胶,如下图:
注:催化剂:过硫酸铵(AP)在隔氧的状态下,最好现配现用,使用新鲜的。
加速催化剂:TEMED,四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围:
通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂:
A液——30%丙稀酰胺(W/V):丙稀酰胺29.2g,N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g,加入去离子水定容至100mL,pH值不能超过7.0,过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
E液——10%过硫酸铵:5g(0.5g)过硫酸铵,溶于50mL(5mL)去离子水中;现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,低温保存。
聚丙烯酰胺(Acrylamide)的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关。
制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择TRIS-HCL系统。
TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行。
十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
注意:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺(N,N’-Methylenebisacrylamide)时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉 轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
分离胶和浓缩胶的制备:按下表中溶液的顺序及比例,配置12%的分离胶和5.1%的浓缩胶。
30%凝胶贮备液/ml |
注:分离胶与浓缩胶的浓度计算公式:
加样完毕,盖好上盖,连接电泳仪,打开电泳仪开关后,样品进胶前电压控制在100~200V,大约15~20min;样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后,电压升到200V,电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1~2cm处即停止电泳,约0.5-1小时。如室温高,打开电泳槽循环水,降低电泳温度。
电泳结束后,关掉电源,取出玻璃板,在长短两块玻璃板下角空隙内,用刀轻 轻撬动,即将胶面与一块玻璃板分开,然后轻轻将胶片托起,指示剂区带中心插入铜丝作为标志,放入大培养皿中染色,使用0.25%的考马斯亮蓝染液,染色2~4h,必要时可过夜。
弃去染色液,用蒸馏水把胶面漂洗几次,然后加入脱色液,进行扩散脱色,经常换脱色液,直至蛋白质带清晰为止。
相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
注意:温度,时间,光照,APS和TEMED都会对凝胶产生影响